一种表面化学固载免疫活性分子的聚二甲基硅氧烷基质及其制备与应用

技术领域

本发明属于生物医学材料领域，具体涉及一种表面化学固载免疫活性分子的聚二甲基硅氧烷基质及其制备与应用。

背景技术

过继性细胞免疫疗法是最有前景的生物治疗方法之一，有望改善治疗的持久性、靶向性和目前生物制剂的疗效。这种细胞疗法需要有效的基质来产生足够数量的高质量细胞，但目前用于激活和扩增T细胞群的免疫磁珠还不能完全模拟抗原呈递细胞的特性。在T细胞的体外增殖过程中，吸附基质不仅仅只是为细胞增殖提供场所，其物理和化学性质(例如硬度、表面电荷、表面分子的性质和密度等)都会影响T细胞存在的微环境和T细胞与基质之间的作用力。微环境的变化和细胞与基质之间的作用力的改变是影响细胞活化、增殖和信号转导的关键因素之一。

T细胞的活化、增殖以及细胞亚群的分化在很大程度上依赖于抗体的刺激和吸附基质的性质。抗体的浓度和抗体的固载方式都会影响到T细胞的活化增殖状态，如固载状态的CD3单克隆抗体(CD3单抗)比游离状态的具有更强的诱导T细胞活化增殖的能力；吸附基质的物理性质和其固载抗体的能力都是影响T细胞活化增殖的重要一环，如吸附基质的表面太硬，则会阻碍信号转导，降低T细胞的活化效率。因此选择合适的基质材料和抗体固载方式对T细胞的体外活化增殖过程至关重要。

目前常用的固载抗体的基质有PA凝胶、PS微球(免疫磁珠)、TCP、玻片和PDMS弹性体等。其中PS微球、TCP和玻片均属于硬质材料，其杨氏模量达到了2～3GPa；而PA凝胶和PDMS弹性体均属于软质材料，都可通过调整基体与固化剂的比例来控制基质的刚度，PA凝胶的刚度大多可控制5～200kPa，而PDMS的刚度可控制在100kPa～3MPa。PDMS的优势在于它具有低毒性、生理惰性、透气性、透明性和良好的生物相容性，因此可选择PDMS作为抗体固载的基质材料。

目前将PDMS应用于T细胞的活化与增殖的研究皆是利用物理吸附中间蛋白(anti-IgG、Protein A)或直接物理吸附来捕获anti-CD3/CD28，但这样的非特异性吸附是不稳定不确定的，容易变性或者从表面脱去，而共价固载的抗体比物理吸附的抗体具有更好的免疫活性和稳定性，且在相同的抗体浓度下固载到基质表面的密度和覆盖率更大，有利于节省成本。在利用软PDMS作为基质活化T细胞的基础上，结合化学接枝的方法固载抗体于PDMS表面，有望探索T细胞体外活化增殖的最优条件，在T细胞刺激活化材料的设计中开辟新的途径。

发明内容

为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种表面化学固载免疫活性分子的聚二甲基硅氧烷(PDMS)基质的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述方法制得的一种表面化学固载免疫活性分子的聚二甲基硅氧烷基质。

本发明功能化PDMS细胞培养基质由基体和表层接枝物组成，表层接枝物与基体之间通过共价键结合，PDMS基体具有良好的生物相容性，表层接枝物由活性化学基团和免疫活性分子物质构成，具有刺激活化T细胞、促进T细胞增殖等效果；其中，免疫活性分子包括活化抗体、含肽的主要组织相容性复合物(pMHC)、抗原肽、共刺激分子或细胞因子中的一种或多种。

本发明的目的在于提供上述一种表面化学固载免疫活性分子的聚二甲基硅氧烷基质在非医疗手段的T细胞培养以及医用材料制备中的应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种表面化学固载免疫活性分子的聚二甲基硅氧烷基质的制备方法，包括以下步骤：

(1)将聚二甲基硅氧烷进行紫外辐照和/或等离子体处理，得到活化聚二甲基硅氧烷；

(2)将活化聚二甲基硅氧烷在硅烷偶联剂溶液中浸泡反应1～5h，得到硅烷偶联剂改性的聚二甲基硅氧烷；

(3)将硅烷偶联剂改性的聚二甲基硅氧烷在酸酐溶液中浸泡反应0.5～3h，得到羧基化改性的聚二甲基硅氧烷；

(4)将硅烷偶联剂改性的聚二甲基硅氧烷和/或羧基化改性的聚二甲基硅氧烷在免疫活性分子溶液中浸泡反应10～24h，得到表面化学固载免疫活性分子的功能化聚二甲基硅氧烷基质。

优选地，步骤(1)所述聚二甲基硅氧烷由以下方法制得：将弹性剂和固化剂按照质量比5：1～50：1的比例混合均匀后进行热固化，纯化，得到PDMS。

进一步地，所述热固化的条件为：50～80℃固化5～12h。

进一步地，所述弹性剂和固化剂混合均匀后，倒入聚四氟乙烯模具中，水平静置，待胶体完全铺展于模具后中再进行热固化。

进一步地，所述纯化指将固化样品在乙醇中浸泡12～24h后，洗涤，干燥。

优选地，步骤(1)所述紫外辐照的条件为：辐照波长50～400nm；辐照强度1～100mW/cm

优选地，步骤(1)所述等离子体处理的条件为：空气或氧气为介质；处理功率为60～400w；处理时间30～500s。

优选地，步骤(2)所述硅烷偶联剂溶液的质量浓度为0.1～10％；溶剂为体积分数70～90％的醇水溶液。

优选地，步骤(2)中的硅烷偶联剂为γ-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、γ-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)和异氰酸酯丙基三乙氧基硅烷(IPTS)中的至少一种。

优选地，步骤(2)所述反应结束后，将聚二甲基硅氧烷样品取出，用乙醇冲洗，干燥。

优选地，步骤(3)所述酸酐溶液的浓度为30～60mg/mL；溶剂为去离子水。

优选地，步骤(3)中的酸酐为丁二酸酐和戊二酸酐中的至少一种。

优选地，步骤(4)所述免疫活性分子溶液的浓度为1～20μg/mL；溶剂为PBS溶液；所述PBS溶液pH为7.2～7.4。

优选地，步骤(4)中的免疫活性分子为活化抗体、含肽的主要组织相容性复合物(pMHC)、抗原肽、共刺激分子和细胞因子中的至少一种；更优选为CD3e抗体和CD28抗体中的至少一种。

优选地，步骤(4)所述反应结束后，将将聚二甲基硅氧烷样品取出，用水冲洗，干燥。

上述制备方法制得的一种表面化学固载免疫活性分子的聚二甲基硅氧烷基质。

上述一种表面化学固载免疫活性分子的聚二甲基硅氧烷基质在非治疗手段的T细胞体外培养以及医用材料制备中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明以PDMS为基体，通过活化技术使PDMS表面产生具有化学反应活性的位点，再通过硅烷偶联剂-酸酐分子构成架桥分子，将免疫活性分子以共价键的形式固载在PDMS表面，保持PDMS本体良好性能的同时赋予其免疫活性，并保持免疫活性的长期稳定性和有效性，使具备免疫活性的PDMS基质成为可用于T细胞体外培养的基质材料加以应用。

附图说明

图1为是本发明实施例1～2和对比例1中不同改性PDMS基质的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)图。

图2是本发明实施例1～2和对比例1中不同改性PDMS基质表面的水接触角测量对比图。

图3是本发明实施例1～2和对比例1中不同改性PDMS基质上抗体的固载密度情况。

图4是本发明实施例1～2和对比例1中不同改性PDMS基质上T细胞的活化情况。

图5是本发明实施例1～2和对比例1中不同改性PDMS基质上T细胞显微镜明场图像。

图6是本发明实施例1～2和对比例1中不同改性PDMS基质上T细胞的增殖情况。

图7是本发明实施例1～2和对比例1中不同改性PDMS基质上T细胞的分化情况。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用未注明生产厂商者的原料、试剂等，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1：表面偶联抗体的PDMS基质的制备

步骤(1)将弹性剂(组分A)和固化剂(组分B)按照质量比为10:1混合(SYLGARD

步骤(2)将PDMS圆片置于172nm(辐照强度为50mW/cm

步骤(3)配制10wt％APTES的乙醇水溶液，其中乙醇和水的体积比为8：1)，将经过活化后的PDMS立即浸入APTES溶液中，反应2h后取出，乙醇冲洗，N

步骤(4)将PDMS-APTES样片加入到含抗小鼠CD3e(15μg/mL)和抗小鼠CD28(5μg/mL)的PBS溶液中(pH 7.2～7.4)中反应14h，取出后PBS冲洗，N

图1中的(a)是未改性PDMS的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)图。图中2963cm

图1中的(b)是经活化后的PDMS的FT-IR图，在3300cm

图1中的(c)是PDMS-APTES的FT-IR图。谱图中3400cm

图2是不同改性PDMS的水接触角对比。改性前PDMS表面与水的接触角为116°左右。PDMS表面接枝APTES后，与水的接触角为85°左右。

对比例1：表面偶联抗体的PDMS基质的制备

步骤(1)将弹性剂(组分A)和固化剂(组分B)按照质量比为10:1混合(SYLGARD

步骤(2)将PDMS圆片置于172nm(辐照强度为50mW/cm

步骤(3)配制10wt％APTES的乙醇水溶液，其中乙醇与水体积比为8：1，将经过活化后的PDMS立即浸入APTES溶液中，反应2h取出后，乙醇冲洗，N

步骤(4)将PDMS-GA加入到含抗小鼠CD3e(15μg/mL)和抗小鼠CD28(5μg/mL)的PBS溶液中(pH 7.2～7.4)中反应14h后取出，PBS冲洗，N

图1中的(d)是表面接枝戊二醛的PDMS薄膜傅里叶变换红外光谱(FT-IR)图。PDMS表面的氨基与戊二醛的一端醛基发生席夫碱反应生成C＝N键，并留下另一端活性醛基用于接枝蛋白质，分别对应于1651cm

图2中PDMS接枝GA后，接触角为71.2°。

表1中PDMS接枝GA并在其表面接枝抗体后，出现了抗体结构特有的S元素，说明成功在醛基化PDMS表面接枝了抗体。

表1 XPS表面元素分析结果

实施例2：表面偶联抗体的PDMS基质的制备

步骤(1)将弹性剂(组分A)和固化剂(组分B)按照质量比为10:1混合(SYLGARD

步骤(2)将PDMS圆片置于等离子体发生装置中，进行氧气等离子体处理300s(功率为200w)后，得表面活化的PDMS，留待后续立即使用。

步骤(3)配制10wt％APTES的乙醇水溶液，其中乙醇与水体积比为8：1，将活化过的PDMS立即浸入APTES溶液中，反应2h取出后，乙醇冲洗，N

步骤(4)将PDMS-SAA样片加入到含抗小鼠CD3e(15μg/mL)和抗小鼠CD28(5μg/mL)的PBS溶液中(pH 7.2～7.4)，反应14h后取出，PBS冲洗，N

图1中的(e)是表面接枝丁二酸酐的PDMS薄膜FT-IR图。在氨基化PDMS表面接枝丁二酸酐(SAA)后，在1643-1550cm

图2中PDMS接枝SAA后，接触角为71.3°。

表2中PDMS接枝SAA后，O元素含量明显上升。在其表面接枝抗体后，出现了抗体结构特有的S元素，说明成功在羧基化PDMS表面接枝了抗体。

表2 XPS表面元素分析结果

图3为不同PDMS基质接枝抗体后表面固载抗体密度的表征情况。先在PDMS表面固载生物素化的抗小鼠CD3e抗体，再孵育HRP酶标记的亲和素，最后用TMB显色，抗体浓度即可通过ELISA定量并以吸光度表示，结果表明与空白组相比，三种PDMS表面均能有效地固载抗体。

实施例3：对制备的不同PDMS基质进行T细胞培养实验。

步骤(1)使用MACS缓冲液重悬小鼠T细胞，与CD4磁珠4℃孵育15min。用离心机离心，取细胞沉淀。加入MACS缓冲液与细胞混匀后倒入LS柱中并放置在MACS分选架(Midi分离器)上进行分离，待液体流尽后再加入MACS缓冲液润洗三次。将LS柱拿出，并加入MACS缓冲液，迅速冲出磁珠细胞，重复2-3次，收集细胞悬液，离心5min取细胞沉淀。

步骤(2)用无菌PBS缓冲液与细胞混匀后，加入CFSE染液染色2.5min，并进行细胞计数。所得CD4

步骤(3)T细胞培养72h后收集细胞，标记CD3-BV421和CD4-PE。流式检测CD4

图4为不同PDMS基质接枝抗体后培养T细胞的细胞活化情况。由上清液的ELISA结果可知，实施例2中PDMS-SAA-Ab表面所培养T细胞其IL-2的分泌量最高。PDMS-APTES-Ab(实施例1)表面所培养T细胞的IL-2分泌量适中。PDMS-GA-Ab(对比例1)表面所培养的T细胞基本上没有IL-2的分泌。

图5为不同PDMS基质培养T细胞的显微镜明场图像。PDMS-APTES-Ab(实施例1)表面和PDMS-SAA-Ab(实施例2)表面均能观察到明显的大规模的细胞团聚现象，而对照组和PDMS-GA-Ab(对比例1)组均未能观察到此现象。这也说明PDMS-SAA-Ab(实施例2)表面和PDMS-APTES-Ab(实施例1)表面能够加快细胞的团聚，促进T细胞的活化与增殖。

图6为不同PDMS基质培养T细胞的细胞增殖情况。PDMS-SAA-Ab(实施例2)表面所培养T细胞进入分裂期的细胞比例最多，相应的增殖指数也最大。PDMS-APTES-Ab(实施例1)表面的细胞进入分裂期的细胞比例相对于对照组具有显著性差异，相应的增殖指数也较大。与IL-2分泌结果相对应的，PDMS-GA-Ab(对比例1)表面T细胞进入分裂期的细胞最少，与未受到刺激的对照组无显著性差异。

图7为不同PDMS基质培养T细胞的细胞分化情况。相比于未刺激组，PDMS-APTES-Ab(实施例1)和PDMS-SAA-Ab(实施例2)表面诱导了更高比例的IFN-γ阳性细胞。且与对照组比，在PDMS-APTES-Ab(实施例1)和PDMS-SAA-Ab(实施例2)上培养的细胞的IFN-γ的分泌水平明显增加，证明了PDMS-APTES-Ab(实施例1)和PDMS-SAA-Ab(实施例2)表面可以诱导Th1细胞的产生。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。