一种测定复杂组分中维生素A的高效液相色谱分析方法

技术领域

本发明涉及一种高效快速测定复杂组分中维生素A含量的液相色谱分析方法。具体通过对样品前处理和色谱条件的优化，使得实验简单，方便且准确快速检测出复杂组分中维生素A的含量。

背景技术

维生素A(vitaminA)又称视黄醇(其醛衍生物视黄醛)或抗干眼病因子，是一个具有脂环的不饱和一元醇，其在人体内发挥中重要作用。例如，不仅可以维持正常视觉功能、维护上皮组织细胞的健康和促进免疫球蛋白的合成、维持骨骼正常生长发育、促进生长与生殖，还可以抑制肿瘤生长；因此含有维生素A的保健食品为维持人体健康很有益处。维生素A结构式如下：

维生素A难溶于水，能溶于有机溶剂。现阶段检测维生素A所采用的前处理大多是经过高温皂化后用正己烷、氢氧化钠等试剂多次萃取、氮吹、再溶解，需要用到的试剂较多，且操作过程复杂繁琐。因此，有必要研究一种可以将维生素A成分充分提取出来，且操作简单的前处理方法。

由于在保健食品中多种维生素矿物质片含有多种成分，某些成分可能会对维生素A造成一定的干扰或使其降解。因此，有必要研究一种检测维生素A专属性强，使其与其他组分或杂质峰能很好分离的高效液相色谱分析方法。

发明内容

为克服上述问题，本发明提供一种提取率高、稳定性好、准确度高、重复性好的专属维生素A的高效液相色谱方法，具体包括以下步骤：

一种用于测定片剂、粉剂、胶囊剂型等复杂组分中维生素A含量的高效液相色谱分析方法，供试品的提取溶剂为低浓度氨水溶液和/或有机溶剂，提取方法为水浴超声或水浴振荡提取；流动相A为甲醇，流动相B为水，流动相A与流动相B的混合比例为100～90：0～10，等度洗脱；紫外检测波长设定为300～350nm。

在本发明中，用于供试品的提取溶剂是低浓度的氨水溶液，提取溶剂的浓度为0.01～0.05％，优选0.02～0.03％，更加优选0.025％。

在本发明中，用于供试品提取的有机溶剂选自乙腈、甲醇或乙醇中的一种，优选乙醇。其中，有机溶剂的浓度选自50％-100％，优选95-100％，更加优选100％。

在本发明中，提取方法水浴超声的温度选自25～80℃，优选30～60℃，更加优选40～50℃。

在本发明中，提取方法水浴振荡的温度选自25～80℃，优选30～60℃，更加优选40～50℃。

在本发明中，所述的高效液相色谱法中的流速为0.8～1.5ml/min。

在本发明中，所述的维生素A溶液的色谱柱温度是25℃～30℃，最佳柱温为25℃。

在一个实施方案中，进行上述色谱分析的色谱仪器及条件为：

检测仪器：高效液相色谱仪(Thermo Fisher，U3000)，配备紫外检测器；

色谱条件：

色谱柱：welch-C18150mm*4.6mm，5μm；流动相：纯甲醇-水(100～90：0～10)；检测波长：300～350nm；流速：0.8～1.5ml/min；柱温：25～30，℃最佳柱温：25℃；运行时间：6min。

本发明中，采用高效液相色谱对多种维生素矿物质片溶液中的维生素A进行定量检测，需要对该方法进行专属性、准确度等多方面的确认，具体为：

专属性：配制样品溶液和不含维生素A的空白辅料溶液，分别进样，结果显示空白溶液、空白辅料溶液对供试品溶液的主峰出峰无干扰，且能与相邻峰有效的分离，说明本发明提供的方法能够准确测定多种维生素矿物质片功效成分维生素A的含量。

准确度：采用本发明的高效液相色谱方法对多种维生素矿物质片溶液中的维生素A进行检测，结果显示其回收率在合格标准范围内，准确度良好。

线性：采用本发明的高效液相色谱方法对多种维生素矿物质片中的维生素A对照品溶液进行检测，在线性范围60％～200％内，结果显示其主成分线性相关系数不小于0.998，表明检测结果与维生素A的浓度具有良好的线性关系。

本发明样品前处理采用的提取溶剂为低浓度氨水与乙醇，所用的试剂为低毒性，可保证实验人员在此工作环境下的人身安全，且前处理操作简单，避免了复杂的多次萃取、溶解等过程，溶剂的使用量也较少，减少了废液的产生。本发明提供的方法专属检测复杂成分产品中的维生素A，且其与其他组分和杂质峰都能很好的分离，具有提取率高、稳定性好、准确度高、重复性好的特点。

附图说明

图1示供试品溶液的HPLC检测的色谱图；

图2、3、4示实施例1的色谱条件下HPLC检测的色谱图；

图5示实施例2的色谱条件下HPLC检测的色谱图；

图6示实施例3的色谱条件下HPLC检测的色谱图；

图7示实施例4的色谱条件下HPLC检测的色谱图；

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细的说明，分别以片剂、胶囊和软胶囊为例。试剂：甲醇(SINENCE，批号1702M0603)，乙醇(安徽安特食品股份有限公司，AR)，氨水(国药集团化学试剂有限公司，25～30％，AR)，维生素A醋酸酯对照品(中国食品药品检定研究院)，样品(深圳芙莱特营养与健康有限公司提供)，软胶囊(深圳芙莱特营养与健康有限公司提供)

实施例1：

深圳芙莱特营养与健康有限公司生产的A1111-A2131-A3333号牌多种维生素矿物质片(含有维生素A、维生素E、维生素B

第一步：提取溶剂0.025％氨水溶液配置：量取1.0ml的浓氨水，加入到1000ml的超纯水中，摇匀。

第二步：对照品溶液的配制：精密称取维生素A醋酸酯对照品42.0mg，置50ml容量瓶中，加无水乙醇适量超声使溶解，并用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液Ⅰ；精密量取对照品贮备液Ⅰ1ml，置100ml容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

第三步：样品溶液配制：临用新配且避光操作，取本品20片，精密称定，研粉，精密称定适量置100ml量瓶中，加10ml 0.025％氨水，45℃超声10min，加50ml无水乙醇，45℃水浴振摇5min，冷却，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。A1111-A2131-A3333牌号多种维生素矿物质片各配制两份。

第四步：液相色谱条件的具体内容如下：

[色谱柱：welch-C18150mm*4.6mm，5μm

流动相：甲醇-水(98：2)

检测波长：325nm

流速：1.2ml/min

柱温：25℃

进样体积：20ul

运行时间：6min

检测色谱图如2、3、4图，检测结果如表1

表1检测结果

实施例2：

深圳芙莱特营养与健康有限公司生产维生素A片样品中维生素A含量的测定。具体步骤：

第一步：提取溶剂0.025％氨水溶液的配制：量取1.0ml的浓氨水，加入到1000ml的超纯水中，摇匀。

第二步：对照品溶液的配制：精密称取维生素A醋酸酯对照品4.0mg，置50ml容量瓶中，加95％乙醇适量超声使溶解，并用95％乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液Ⅰ；精密量取对照品贮备液Ⅰ1ml，置100ml容量瓶中，用95％乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

第三步：样品溶液配制：临用新配且避光操作，取本品20片，精密称定，研粉，精密称定适量置100ml量瓶中，加10ml 0.025％氨水，40℃超声10min，加50ml95％乙醇，40℃水浴振摇5min，冷却，加95％乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。

第四步：液相色谱条件的具体内容如下：

色谱柱：welch-C18150mm*4.6mm，5μm

流动相：甲醇-水(98：2)

检测波长：330nm

流速：1.2ml/min

柱温：25℃

进样体积：20ul

运行时间：6min

样品检测色谱图如图5，检测结果如表2。

表2检测结果

实施例3：

深圳芙莱特营养与健康有限公司生产的多种维生素胶囊(含有维生素A、维生素E、维生素B

第一步：提取溶剂0.025％氨水溶液的配制：量取1.0ml的浓氨水，加入到1000ml的超纯水中，摇匀。

第二步：对照品溶液的配制：精密称取维生素A醋酸酯对照品42.0mg，置50ml容量瓶中，加无水乙醇适量超声使溶解，并用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液Ⅰ；精密量取对照品贮备液Ⅰ1ml，置100ml容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

第三步：样品溶液配制，临用新配且避光操作。取维生素A胶囊若干粒，剪破胶囊皮，取内容物于烧杯，精密称定适量，置100ml量瓶中，加10ml 0.025％氨水，50℃超声10min，加50ml无水乙醇，50℃水浴振摇5min，冷却，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。

第四步：液相色谱条件的具体内容如下：

色谱柱：welch-C18150mm*4.6mm，5μm

流动相：甲醇-水(98：2)

检测波长：325nm

流速：1.2ml/min

柱温：25℃

进样体积：20ul

运行时间：6min

样品检测色谱图如图6，检测结果如表3。

表3检测结果

]实施例4：

深圳芙莱特营养与健康有限公司生产的维生素A软胶囊中维生素A含量的测定。具体步骤如下：

第一步：对照品溶液的配制，(避光操作)取维生素A醋酸酯对照品25.85mg(约相当于维生素A7.5mg)，精密称定，置于20ml量瓶中，加无水乙醇适量，超声使溶解，冷却至室温，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为维生素A醋酸酯对照品储备液；精密移取维生素A醋酸酯储备液3.0ml，置于200ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得

第二步：样品溶液配制，(避光操作)取维生素A软胶囊10粒，剪破胶囊皮，取内容物于25ml烧杯，玻璃棒搅匀，取适量(约相当于维生素A267μg)，精密称定，置50ml量瓶中，加无水乙醇适量，摇匀使溶解，超声10min，冷却至室温，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，静置10min，用0.45μm滤膜过滤。

第三步：液相色谱条件的具体内容如下：

色谱柱：welch-C18150mm*4.6mm，5μm

流动相：甲醇

检测波长：325nm

流速：1.0ml/min

柱温：25℃

进样体积：20ul

运行时间：10min

样品检测色谱图如图7，检测结果如表4。

表4检测结果

实施例1～3显示，本发明对含有多种维生素矿物质片、维生素A片、多种维生素矿物质胶囊样品进行检测，维生素A均能在4min左右出峰；实施例4显示，在原基础测定维生素A的检测方法上稍做一点改变，来测定软胶囊样品，结果显示大豆油中的维生素A能在6min左右出峰；且峰型好，与其他成分分离度大，说明该方法适用于不同剂型的复杂组分中维生素A的检测。

以上所述的具体实施例，对本发明的解决的技术问题、技术方案以及有益效果作了一系列的详细说明。但该说明仅仅是针对本发明的具体实施例而已，凡没有脱离本发明技术基础、原则和精神而作的等效实施例或变更，均应包括在本发明的保护范围之内。