一种表面增强拉曼光谱快速检测牛奶中阿洛西林钠的方法

技术领域

本发明涉及青霉素类抗生素的检测方法，尤其是一种表面增强拉曼光谱快速检测牛奶中阿洛西林钠的方法。

背景技术

青霉素类抗生素在目前的应用中最为普遍，它可以有效的预防和治疗动物疾病，大多企业由于抗生素能够对预防动物疾病有重大的作用。例如，阿洛西林钠(AzlocillinSodium)是第三代广谱半合成的青霉素，对革兰阳性菌和革兰氏阴性菌及厌氧菌导致的感染性有极强的预防和治疗效果。由于处理不当以及管理问题，对奶牛使用过阿洛西林钠进行治疗后，牛奶中可能存在阿洛西林钠残留。

目前，检测牛奶中青霉素类抗生素残留的方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、微生物检测法、免疫检测法等方法，这些检测方法的准确性高、灵敏性好，但是操作较为复杂，样品前处理繁琐，时间长，成本较高。

专利申请CN111551537A公开了一种基于表面增强拉曼技术检测牛奶中四环素的方法，使用PDMS腔结构的纳米银基底作为拉曼增强基底，同时将4-氨基-1丁醇与SERS基底结合使用，使其SERS增强优于单独使用PDMS腔或者纳米银颗粒。4-氨基-1-丁醇的加入使其SERS增强优于单独使用PDMS腔或者纳米银颗粒，四环素检测限可达到0.2μg/L。本发明中的PDMS等离子体腔可以作为SERS基底检测牛奶中的四环素，不需要进行牛奶样品的预处理，检测时间在十分钟内，检出限低至0.2μg/L。该方法针对四环素，由于四环素具有四个依次相连的环状官能团，化学结构不同于阿洛西林钠，后者只有两个环状官能团，且环状官能团的组成元素也不同于四环素。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有的牛奶中阿洛西林钠检测方法的不足，提供一种表面增强拉曼光谱快速检测牛奶中阿洛西林钠的方法。

发明人先后尝试了等电点法和乙醇法进行牛奶中阿洛西林钠的检测，发现：

采用等电点法：取40mL牛奶于50mL的离心管中，置于离心机中于3000r/min，25℃条件下离心10min，去除上层漂浮的脂肪，再取10mL脱脂牛奶加入2mL40℃HAC-NaAC缓冲溶液，置于离心机中于3000r/min，25℃条件下离心10min，取200μL上层清液于玻璃管中，先加入20μL浓缩纳米金胶混合均匀，再加入20μL浓度为1mol/L的氯化钠溶液，进行拉曼光谱测定，得到的谱图较为杂乱，无法获得有特征的数据进行处理。

采用乙醇法：取5mL脱脂牛奶于10mL离心管中，加入3mL50％乙醇溶液，在3000r/min，25℃的条件下离心10min，然后用移液枪准确移取200μL的上层澄清液体于玻璃管中，先加入20μL浓缩纳米金胶混合均匀，再加入20μL浓度为1mol/L的氯化钠溶液，进行拉曼光谱测定。由于乙醇的拉曼峰较强，所以无法测得阿洛西林钠的谱图。

拉曼光谱在对高分子物质、复杂的生物物质等的研究中有广泛的应用，然而，对于阿洛西林钠，普通拉曼光谱无法获得准确和有代表性的检测数据，本发明通过对阿洛西林钠标准品的用量、增强基底浓缩金胶的用量、氯化钠溶液的浓度及用量的优化，建立了有效检测牛奶中阿洛西林钠的方法。

具体的，本发明建立了表面增强拉曼光谱快速检测牛奶中阿洛西林钠的方法，样品经过离心、脱脂、去蛋白后，经固相微萃取柱净化，通过控制阿洛西林钠标准品的加入量、氯化钠溶液的加入量及浓度、自制金胶的用量以及标准品与氯化钠跟金胶的混合时间来确定最佳的检测方法。实验结果表明，最优化的检测条件为：在阿洛西林钠标准品溶液200μL，氯化钠溶液的用量为20μL浓度为1.0mol/L以及自制金胶的用量为20μL时，可以获得的SERS信号最强。阿洛西林钠的特征峰为1150，1383和1530cm

具体方案如下：

一种表面增强拉曼光谱快速检测牛奶中阿洛西林钠的方法，包括以下步骤：

样品前处理：取待检测牛奶样品，置于离心机中离心，分离出上层脂肪；取脱去了脂肪的牛奶进行加热，加入乙酸，之后离心，取上层清液过固相微萃取柱，加入水进行洗脱，收集洗脱液，得到经过前处理后的牛奶样品；

配制标准溶液：称取阿洛西林钠标准品，加入水，混合均匀后得到阿洛西林钠标准溶液，分别制备不同浓度的阿洛西林钠标准溶液，备用；

拉曼检测：将经过前处理后的牛奶样品，以及上步中不同浓度的阿洛西林钠标准溶液，分别先加入纳米金溶胶混合均匀，再加入氯化钠的水溶液混合均匀，之后进行拉曼光谱检测；

线性拟合：根据不同浓度的阿洛西林钠标准溶液的检测图谱，获得阿洛西林钠浓度和图谱峰强度的线性关系，从而通过待检测牛奶样品的检测图谱，计算出待检测牛奶样品中的阿洛西林钠浓度。

进一步的，所述样品前处理中，固相微萃取柱的型号为Envi-carb。

进一步的，所述固相微萃取柱使用前先用甲醇和水进行活化处理。

进一步的，所述配制标准溶液中，所述不同浓度的阿洛西林钠标准溶液的浓度包括100mg/L、10mg/L、1mg/L、0.1mg/L。

进一步的，所述拉曼检测中，纳米金溶胶的体积：经过前处理后的牛奶样品的体积＝8-12；纳米金溶胶的体积：阿洛西林钠标准溶液的体积＝8-12。

进一步的，所述拉曼检测中，氯化钠的水溶液的浓度为0.2-2mol/L。

进一步的，所述拉曼检测中，氯化钠的水溶液的体积：经过前处理后的牛奶样品的体积＝8-12。

进一步的，所述线性拟合中，选取所述检测图谱中包括但不限于1150、1383、1530cm

进一步的，所述阿洛西林钠浓度和图谱峰强度的线性关系为y＝11.567x+507.33，其中x为浓度，y为峰强度。

有益效果：

本发明所述方法检测牛奶中阿洛西林钠具有灵敏度高、时间短、特异性强、无损、所需样品量少、前处理简单等优点，适用于牛奶中阿洛西林钠的检测，该方法实现了牛奶中阿洛西林钠的快速检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅涉及本发明的一些实施例，而非对本发明的限制。

图1是本发明一个实施例3提供的阿洛西林钠标准溶液的SERS光谱图；

图2是本发明一个实施例4提供的增强基底加入量对SERS信号的影响图；

图3是本发明一个实施例5提供的氯化钠浓度对SERS信号的影响图；

图4是本发明一个实施例6提供的氯化钠加入量对SERS信号的影响图；

图5是本发明一个实施例7提供的标准品加入量对SERS信号的影响图；

图6是本发明一个实施例8提供的阿洛西林钠标准品的检出限分析图；

图7是本发明一个实施例9提供的加标不同浓度阿洛西林钠的牛奶样品的SERS谱图；

图8是本发明一个实施例9提供的线性拟合图。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。在下面的实施例中，如未明确说明，“％”均指重量百分比。

实施例1

本实施例展示纳米金溶胶的制备和浓缩方法，

首先取出1mL 1％的HAuCl

取上述自制金胶溶液1.5mL于1.5mL离心管中，用小型离心机离心10min，去除上层清液得到20μL浓缩金胶。

需要说明的是，本发明中采用的纳米金溶胶也可以采用其他方法制备得到，或者直接商购得到。

实施例2

本实施例展示检测未知牛奶样品的方法，包括以下步骤：

(1)样品前处理：用移液枪移取金典牛奶40mL放到50mL的离心管中，置于离心机中于3000r/min，20℃条件下离心10min，之后把上层漂浮的脂肪用移液枪慢慢的吸走，注意不要浪费牛奶。再取25mL脱去了脂肪的金典牛奶加热至40℃后加入1mL乙酸(1：9)，搅拌。再次于3000r/min，20℃条件下离心10min。取上层清液2mL过固相微萃取柱(Envi-carb)，加入1mL纯净水洗脱，取200μL洗脱液进行检测。

(2)标准溶液配制：准确称取2mg阿洛西林钠标准品粉末，加入2mL纯净水，混合均匀后得到1mg/mL(1000mg/L)的阿洛西林钠标准溶液，取1mL1000 mg/L的阿洛西林钠标准溶液加入9mL纯净水混合均匀得到100mg/L的阿洛西林钠标准溶液，再取1mL100 mg/L的阿洛西林钠标准溶液加入9mL纯净水混合均匀得到10mg/L的阿洛西林钠标准溶液，以此方法继续得到1mg/L、0.1mg/L的阿洛西林钠标准溶液。密封储存，备用。固相微萃取柱在使用前需要先用1mL的甲醇和1mL的纯净水活化。

(3)SERS检测步骤：首先在玻璃管中加入200μL的经过前处理后的牛奶样品溶液，先加入20μL浓缩纳米金胶混合均匀，再加入1mol/L的氯化钠溶液20μL混合均匀即可测定SERS光谱。

实施例3

本实施例采用实施例2中的检测方法，对不同浓度的阿洛西林钠标准溶液进行检测分析，结果见图1，从图1可以看出，在1150、1383、1530cm

实施例4

本实施例采用实施例2中的检测方法，对增强基底的加入量的优化。取200μL0.1mg/L的阿洛西林钠标准溶液4份，分别加入15μL、20μL、35μL、40μL的增强基底浓缩金胶。结果如图2所示。

由图2可知，使阿洛西林钠标准溶液加入量、氯化钠溶液浓度及加入量不变的前提下，SERS信号会随着增强基底加入量的增加而先增强后减弱，当增强基底的加入量为20μL时SERS信号最强。

实施例5

本实施例采用实施例2中的检测方法，对氯化钠溶液进行优化。取200μL0.1mg/L的阿洛西林钠标准溶液4份，分别加入20μL增强基底浓缩金胶，再分别加入0.1mol/L、0.2mol/L、1.0mol/L、2.0mol/L的氯化钠溶液20μL混合均匀，结果如图3所示。

由图3可知，在阿洛西林钠标准溶液加入量、增强基底浓缩金胶加入量以及氯化钠溶液加入量不变的前提下，SERS信号会随着氯化钠溶液浓度的升高先增强后减弱，当氯化钠溶液浓度为1.0mol/L时检测到的SERS信号最强。

实施例6

本实施例采用实施例2中的检测方法，对氯化钠加入量进行优化。取200μL 0.1mg/L的阿洛西林钠标准溶液4份，分别加入20μL增强基底浓缩金胶，再分别加入0.1mol/L的氯化钠溶液0μL、10μL、20μL、30μL混合均匀，结果如图4所示。

由图4可知，在阿洛西林钠标准溶液加入量、增强基底浓缩金胶加入量以及氯化钠溶液浓度不变的前提下，拉曼信号会随着氯化钠溶液加入量的增加先增强后减弱，当氯化钠溶液加入量小于20μL时，拉曼信号随着加入量的增加而增强，当加入量大于20μL时，SERS信号开始出现偏移。

实施例7

本实施例采用实施例2中的检测方法，对标准品加入量进行优化。分别取100μL、200μL、300μL和400μL的阿洛西林钠标准溶液，加入20μL浓缩金胶混合均匀，再加入20μL浓度为1mol/L的氯化钠溶液混合均匀，依次进行拉曼光谱检测结果如图5所示。

由图5可知，在增强基底浓缩金胶加入量、氯化钠溶液浓度和加入量不变的前提下，SERS信号会随着阿洛西林钠标准溶液加入量的增加先增强后减弱，当阿洛西林钠标准溶液加入量小于200μL时，拉曼信号随着加入量的增加而增强，当加入量大于200μL时，拉曼信号开始出现偏移。

实施例8

本实施例对检出限进行探究，取0.001mg/L、0.010mg/L、0.100mg/L、1.000mg/L、10.000mg/L的阿洛西林钠标准品200μL，分别先加入20μL浓缩纳米金胶混合均匀，再加入20μL浓度为1mol/L的氯化钠溶液混合均匀，进行SERS信号检测，结果如图6所示。

由图6可知，阿洛西林钠标准溶液的拉曼信号随着浓度的增加而增强，并且在1150、1383、1530cm-1附近出现尖锐明显的特征峰，当阿洛西林钠标准溶液的的浓度为0.001mg/L时，依旧有较为清晰的特征峰，因此，阿洛西林钠标准溶液的检出限为0.001mg/L。

实施例9

本实施例分别将加标后阿洛西林钠浓度为10μg/L、40μg/L、70μg/L、100μg/L的牛奶实施例2的方法进行前处理和检测，结果如图7所示。3次测量的误差范围在1.2％～3.9％。

对所获得的检测图谱数据进行线性拟合，拟合得到的线性关系图见图8。从图8可以看出，阿洛西林钠浓度和图谱峰强度的线性关系为y＝11.567x+507.33，其中x为浓度，微克/升为单位，y为峰强度，二者线性相关度R

实施例10

本实施例进行加标回收试验，对金典牛奶进行加标，分别为0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L，采用实施例2中的方法对金典牛奶进行前处理和拉曼信号检测。每种浓度各做三组平行试验结果如表1所示，测得的回收率在80～100％之间，RSD(n＝3)在2.3～4.0％之间。

表1牛奶加标回收实验结果表

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。