一种快速鉴定植物基因的方法

技术领域

本发明涉及植物基因鉴定技术领域，更具体地，涉及一种快速鉴定植物基因的方法。

背景技术

转基因植物，是利用基因工程和遗传工程技术将优良性状功能基因整合进入目标植物的基因组的一定位置，并得以表达，从而获得具有新的遗传性状的植物。这些外源转入的目的基因不仅能够再后代中稳定遗传，同时还可以使转基因植物产生新的农艺性状，如抗虫、耐除草剂、抗逆、抗病、改善作物营养品质等。转基因作物自商业化以来，带来了一系列的农业、经济和环境效益。随着生物科技的不断发展，社会需求的日新月异，对转基因植物的研究不断深入，为加速科研进程，需要对转基因植物进行快速准确的检测，以验证基因是否转入植物体内以及验证转基植株是否纯合。

基因组鉴定有赖于植物基因组的提取，目前植物提取基因组应用最多的方法是采用CTAB法。该方法在提取过程中应用到异丙醇或者异戊醇、酚氯仿等，以除去其中的多糖和蛋白质等杂质，得到较纯的核酸。但是酚或者酚氯仿有致癌作用，属于二类危化品；异丙醇也具有一定的毒副作用，对实验者的人生安全具有一定的影响。而且该方法操作复杂，提取过程耗时长，不能同时大批量提取样本DNA。应三轻甲基氨基甲烷(Tris)和乙二胺四乙酸(EDTA)等试剂提取，该方法在提取过程中需要加热，且操作过程较长；采用其他方法提取植物基因都存在一定的限制，如采用磁珠法，试剂耗材存在成本高，且提取要进行预处理；采用过柱法提取植物基因组，操作步骤繁琐，耗时长等问题。需要研发出一种可以用于快速、且无毒提取植物基因组，其产物可以用于基因鉴定，以提高植物基因鉴定速度。

发明内容

基于此，本发明提供了一种快速鉴定植物基因的方法，使用该方法可以实现基因快速鉴定，而且操作简单。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种快速鉴定植物基因的方法，包括以下步骤：

S1、将待测植物样本置于容器中，加入磁珠和/或钢珠；

S2、向所述容器中加入提取液，所述提取液为0.2～0.3mol/L的氢氧化钾或氢氧化钠溶液；

S3、将容器放入打碎仪器中进行物理破碎，取上层液体，得到含有核酸的溶液；

S4、使用2xTaq Mix、引物、超纯水以及提取模板进行PCR扩增，扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中检测。

在一些实施方式中，所述提取液的体积与所述植物样本的面积比为200:1。

在一些实施方式中，步骤S3中，将容器放入打碎仪器中，以20～40Hz的频率进行打磨。

在一些实施方式中，步骤S3中，打磨时间为30～120s。

在一些实施方式中，所述提取液配制包括将固体氢氧化钾或氢氧化钠溶于超纯水中的步骤。

在一些实施方式中，所述提取液配制方法为：称取一定质量的氢氧化钾或氢氧化钠粉末于烧杯中，加入超纯水溶解，再引流到容量瓶中定容，使氢氧化钠或氢氧化钾浓度为0.2～0.3mol/L。

在一些实施方式中，所述提取液为氢氧化钾溶液，浓度为0.2mol/L。

在一些实施方式中，所述植物样本为剪切为1cm

相较于现有技术，本发明的有益效果如下：

本发明在进行植物基因组提取过程中直接使用一定浓度的氢氧化钾或氢氧化钠溶液结合物理破碎的方式进行提取，操作简单，提取快速，而且成本低，安全无污染，本发明在提取过程中不适用异丙醇、酚氯仿等有毒试剂，无污染，安全性高；同时在提取的过程中不需要加热，也不需要特殊仪器设备，极大地节约了人力和物力成本。

提取液选用0.2～0.3mol/L浓度的氢氧化钾或氢氧化钠，对DNA快速提取，且得到的核酸溶液可直接用于PCR实验，克服了使用现有的方法进行DNA提取过程耗时长或者操作繁琐而影响鉴定速度的问题。

本发明的方法应用范围广泛，不仅适用于如拟南芥等模式植物，也适用于如水稻、小麦、玉米等单子叶植物，以及如大豆、花生等多子叶植物，同时对其他乔木和灌木类植物也具有一定的适用性。

附图说明

图1为本发明的流程图；

图2为本发明实施例1提取核酸进行PCR扩增后电泳检测图；

图3位本发明实施例2的基因测序鉴定结果图。

具体实施方式

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

实施例1

1、提取液的配制

(1)1mol/L氢氧化钾50mL母液配制：称取氢氧化钾2.8g于烧杯中，用超纯水溶解，再引流至容量瓶中定容；

(2)提取液的配制：配制100mL提取液：取20mL步骤(1)配制的氢氧化钾母液，加入80mL超纯水稀释，得到浓度为0.2mol/L的氢氧化钾溶液，常温下储存，用于下述的基因组DNA提取。

2、基因组DNA的提取和鉴定

如图1所示，一种快速鉴定拟南芥叶片基因的方法，包括以下步骤：

(1)剪取1cm

(2)相装有拟南芥叶片样本的EP管中加入200μL的提取液(上述配制的浓度为0.2mol/L的氢氧化钾溶液)；

(3)将EP管放入打碎仪器中，调节频率为40Hz，在此频率下打磨30-120s，取上层液体，得到含有拟南芥基因组DNA的核酸溶液。

(4)PCR扩增：应用2xTaq Mix、引物、超纯水、以及提取的模板进行PCR扩增，扩增产物在1％的琼脂糖凝胶电泳中检测；具体操作步骤如下：

a)PCR反应各组分的量：2×Taq Mix 10μL、primer F 0.5μL、primer R 0.5μL、核酸溶液0.5μL、ddH2O 8.5μL；

b)设定PCR反应程序：预变性：94℃3min；变性：94℃30s；复性：55℃30s；延伸：72℃45s、72℃5min；扩增34个循环，得到PCR产物；

c)吸取10μL PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳15min，电泳电压为120V；

d)将跑好的凝胶在凝胶成像系统中观察电泳条带，并记录结果，检测结果如图2所示。

实施例2

一种快速鉴定水稻基因的方法，包括以下步骤：

(1)剪取1cm

(2)相装有水稻叶片样本的EP管中加入200μL的提取液(上述配制的浓度为0.2mol/L的氢氧化钾溶液)；

(3)将EP管放入打碎仪器中，调节频率为40Hz，在此频率下打磨30-120s，取上层液体，得到含有水稻基因组DNA的核酸溶液。

(4)PCR扩增：应用2xTaqMix、引物、超纯水、以及提取的模板进行PCR扩增，PCR产物用于测序鉴定，具体测序步骤如实施例1，测序结果如图3所示。

综上，本发明的方法，可实现对植物基因进行快速鉴定，而且准确性高。另外，鉴定内容包括分子鉴定、基因分型、测序鉴定等，应用范围广泛。

与现有的植物基因组的鉴定方法相比，现有提取植物基因组的方法多是采用多种试剂搭配使用，得到核酸溶液最后用于实验，且在提取的过程中有的使用到有毒试剂、液氮速冻或者须加热等步骤；而本发明公布的方法采用机械破壁与低浓度氢氧化钾或氢氧化钠溶液溶解核酸的方式一步提取植物基因组。该方法极大的减少了提取的时间，简化提取步骤，且该过程不使用有毒试剂和加热过程，得到的核酸溶液可以直接用于PCR实验:如转基因植株鉴定、基因型确定等，加快了科学研究的进程，在植物研究鉴定实验中具有很大适用性。通过案例分析，应用该方法提取的核酸，通过基因扩增以及凝胶电泳，结果表明该方法对提取的植物基因组DNA浓度纯度较高，说明了本发明方法可以有效进行植物基因的鉴定，而且简便快速，对生物科技的研究发展具有重大意义。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。