一种安全高效的可降解脂质纳米颗粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药和生物技术领域，具体而言，涉及一种安全高效的可降解脂质纳米颗粒及其制备方法和应用。

背景技术

外源生物分子和一些药物分子很难穿透细胞膜到达细胞质达到治疗效果。核酸分子(如DNA和RNA)是一类高负电荷的生物分子，必须克服细胞膜的屏障，才能翻译到达生物体内发挥其应有的功能和作用，因此，这类生物分子的治疗应用在体内高效递送是一重要挑战。

核酸本质是A，G，C，T(U)排列组合形成的DNA或者RNA分子。RNA 分子能够调节体内蛋白表达属性使得它可以作为治疗药物，例如，信使RNA (mRNA)可以快速的在细胞内翻译、表达所需的蛋白，可用于制备用于预防的传染病疫苗、肿瘤疫苗以及治疗的传染病、肿瘤的药物，这让mRNA具有非常广阔的应用前景。然而，mRNA的单链结构使其极为不稳定，在进入体内后会很快被普遍存在的RNA酶降解，并且其自身携带负电荷，使其很难穿过表面同为负电荷的细胞膜进入细胞进行蛋白表达，这些使得RNA药物的实际治疗效果大打折扣。为了解决mRNA递送途中的酶降解以及解静电排斥的膜屏障，从而更好的发挥mRNA的治疗能力，近年来，科学家使用脂质纳米颗粒(lipid-based nanoparticle，LNP)包封RNA疫苗、药物、基因编辑工具等，并实现递送生物分子到全身或特定的部位。LNP的组成包含可电离的阳离子脂质和辅助脂质，其中辅助脂质包括磷脂、胆固醇和聚乙二醇修饰的磷脂，均已经实现的了商业化。最关键的是可电离的阳离子脂质，它是mRNA包封、递送和转染效率的决定性因素。合成的至少含有一个叔胺的可电离的阳离子脂质，在酸性环境下携带正电荷，可高效与RNA静电络合形成复合物，并且自组装为载有RNA的LNP(RNA-LNP)，从而提高RNA的稳定性。在到达细胞膜时，阳离子脂质与细胞膜发生融合，促进RNA分子的递送。RNA-LNP进入细胞后，酸性环境下可电离的阳离子脂质质子化，LNP 双层结构被破坏，RNA被释放进入细胞质进行翻译表达特定蛋白(抗体)起到一定治疗作用。

RNA-LNP系统开发中的一个主要挑战是其安全性和有效性，以支持对慢性疾病的治疗指标。然而，由于生物体有限的耐受剂量水平，RNA-LNP药物的治疗效果并不是特别理想。并且在体内，磷脂的积蓄会引起毒副作用，所以如何降低LNP药物在生命体水平的毒性是不可避免的一个问题。虽然非水解性脂质材料已被证明具有满意的给药效果，但自身的毒性限制了其更广泛的应用。因此，一种可降解LNP系统的开发势在必行，但以往的可降解LNP在体内RNA的传递效果与基准LNP(如C12-200)相比，其传递能力不够高，不足以维持低剂量和长期治疗的需求。基于此，开发高效、低毒的新型LNP给药系统的优化设计仍是迫切需要解决的问题。

另外，LNP的原料和组分会对核酸-LNP的物理化学稳定性和核酸的有效递送产生影响。对于不同分子量的核酸或者不同种类的核酸的递送，其对可电离脂质的化学结构要求不同，因此发展不同化学结构的可电离脂质体是优化设计中非常重要的一环。

为了解决以上问题，获得一种安全性好且高效的脂质纳米粒，实现体外、体内安全高效的递送药物以及体内高效转染并且应用于不同的场景和递送对象的LNP是行业发展的需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种安全高效的可降解脂质纳米颗粒，此可降解脂质纳米颗粒为一种新型的可降解可电离脂质分子，具有优异的mRNA载体性能，可以明显提高其负载物-mRNA-在生物体内的翻译表达水平，同时其具有良好的可降解能力，因此在体内安全性高。

本发明的另一目的在于提供一种安全高效的可降解脂质纳米颗粒的制备方法，以获得此安全高效的可降解脂质纳米颗粒。

本发明的另一目的在于提供一种脂质纳米粒在递送基因类药物和基因治疗的药物中的应用，可显著提高外源性人类促红细胞生成素蛋白(human erythropoietin)在生物体内的表达。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

一方面，本申请实施例公开了下式(Ⅰ)的化合物：

或其立体异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、前药或溶剂合物，其中，

A为亲水的胺基化合物，其结构为：

Ra、Ra’和Ra”各自独立的选自H或者包含2-24个碳原子烷基、烯基或炔基；

或者Ra、Ra’和Ra”形成4-10元杂环，所述杂环是O、S或N中的一种或多种；

或者Ra、Ra’和Ra”各自独立的选自包含2-24个碳原子且含杂原子取代的烷基、烯基或炔基，所述杂原子是O、S或N中的一种或多种；

所述Z

或者Z

或者Z

所述B为H或包含2-24个碳原子烷基、烯基或炔基的直链或支链的脂肪族化合物；

或者B为4-10元杂环，所述杂环是O、S或N中的一种或多种；

或者B为杂环和脂肪族化合物的混合，所述杂环是O、S或N中的一种或多种；

当Ra、Ra’和Ra”中的其中一个或多个为H或者A中含NH或者B为H 时，此处的H应被如下结构取代：

X和Y各自独立的选自O、S或N，当X或Y为N时，则X和Y均为NH；

R

R

R

R

在本发明的一些实施例中，上述R

R

在本发明的一些实施例中，上述A和B-A-各自独立的选自如下结构：

在本发明的一些实施例中，上述R

在本发明的一些实施例中，上述R

在本发明的一些实施例中，上述R

在本发明的一些实施例中，上述R

本发明还提供一种安全高效的可降解脂质纳米颗粒的合成，其包含上述任意一项的可电离脂质化合物，应当注意的是包含

本发明还提供一种安全高效的可降解脂质纳米颗粒，其包含上述任意一项的化合物。

本申请实施例提供一种安全高效的可降解脂质纳米颗粒，还包括辅助脂质、固醇、聚乙二醇脂质和核酸中的一种或多种物质。

在本发明的一些实施例中，上述辅助脂质为非阳离子脂质，固醇为胆固醇或其衍生物，聚乙二醇脂为C14-PEG2000、C18-PEG2000或C16-PEG2000，核酸分子为plasmid，smallinterfering RNA(siRNA)，message RNA(mRNA), Circular RNA(CircRNA)，guide RNA(gRNA)中的任意一种或几种。

在本发明的一些实施例中，上述非阳离子脂质包括DOPE、DOPC和/或 DSPC。

本申请实施例提供一种安全高效的可降解脂质纳米颗粒的制备方法，包括如

下步骤：

使用化合物

将化合物II与B-AH所示的胺反应得到化合物I，结构式如下：

本发明实施例还提供一种脂质纳米粒在递送基因类药物药物中的应用，可显著提高外源性人类促红细胞生成素蛋白(human erythropoietin) 在生物体内的表达。

相对于现有技术，本发明的实施例至少具有如下优点或有益效果：

本发明通过改进可电离脂质分子的结构得到一种新型的可电离脂质分子，通过引入多级可降解的酯类结构，提高了其在生物体内被相关酶切的可能性，该脂质结构可以更容易被酶切从而降解，减少了体内存留的概率，提高了安全性。随后，该脂质分子与磷脂、固醇或聚乙二醇脂合成得到256 个LNP，通过筛选和测试，代号为LNP 223的LNP具有最优异的mRNA载体性能。另外，在递送功能性外源性蛋白，如人类促红细胞生成素蛋白时，代号为LNP30的LNP表现出比基准LNP(C12-200)更优异的递送效率。

本发明中通过引入多级酯类结构，提高了其疏水性，使得某些结构的 LNP能够更容易包裹mRNA，同时所得LNP的等电点在6-7之间，脂质体很容易破坏溶酶体/内涵体内膜，使mRNA逃逸到细胞质中，从而可以明显提高其负载物-mRNA-在细胞内的翻译表达水平。

本发明的产物是一种改进的氨基脂质化合物，其尾部是由两个或两个以上酯(酰胺)组成的，具有疏水性特征，其头部氨基具有亲水性特征，同时具有亲水、疏水特性使得其能自组装形成可降解脂质纳米颗粒。改进后的氨基脂质化合物具有合成反应条件温和、反应产率高、合成步骤简单对仪器设备要求低的特点，并且其与磷脂、胆固醇、聚乙二醇脂形成的LNP 具有更加优异的mRNA载体性能，可以明显提高LNP/mRNA在细胞内的翻译表达水平。同时双酯(酰胺)结构的引入，可以大大增加其可降解的能力从而减小生物毒性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1Lipidoid 53的核磁氢谱图。

图2为本发明实施例6中对应表1中各可降解脂质体所形成的LNP粒径图。

图3为本发明实施例7中对应表1各LNP包裹mRNA的效率图。

图4为本发明实施例8中对应表1中各可降解脂质体所形成的LNP细胞毒性测试结果。

图5为实施例9中对应表1中各可降解脂质体所形成的LNP在体外Hela 细胞中转染效率。

图6为本发明实施例10中LNP 223的小鼠体内肝脏转染成像与标杆LNP (C12-200)的对照图；(a)LNP 223和C12-200 LNP全身发光强度示意图；(b)LNP 223和C12-200 LNP各器官上的发光强度示意图；(c)LNP 223 和C12-200 LNP全身发光强度数值的比较；(d)LNP223和C12-200 LNP肝脏发光强度数值的比较。

图7为本发明实施例10中LNP 23在小鼠体内脾脏的转染成像图；(a) LNP全身发光强度示意图；(b)LNP 23各器官上的发光强度示意图。

图8为本发明实施例11中LNP 30的对外源性hEPO蛋白在体内的表达。

图9是本发明实施例12中LNP 223的在小鼠体内肝脏毒性测试；(a) 谷丙转氨酶的测试结果；(b)谷草转氨酶的测试结果。对照组为空白PBS 和标杆LNP(C12-200)。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。

本发明的可降解脂质纳米颗粒的制备的反应式如下：

应当注意的是，上述反应式只是选自其中的一个典型的双键化学物(II) 与含NH结构的(B-AH)之间的迈克尔加成反应。当A或B中额外含NH或B 为H时，都发生反应并遵从此处的反应机理。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

Lipidoid 53的合成，包括如下步骤：

在圆底烧瓶中依次加入6-羟基己基丙烯酸酯(17.2g，0.1mol)，辛酸 (17.3g，0.12mol)，EDC HCl(21.5g，0.12mol)，4-二甲氨基吡啶 (DMAP，1.46g，0.012mol)300mL二氯甲烷，在室温下搅拌反应12小时。反应完后，依次用稀盐酸溶液(1wt％，300mL×2)、水(300mL×2)和饱和碳酸氢钠溶液(300mL×2)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗产品。粗产物通过柱层析(SiO

在圆底烧瓶中依次加入A(17.9g，0.06mol)和二乙烯三胺(1.03g， 0.01mol)，在80℃搅拌反应48小时。反应完后，通过柱层析(SiO

实施例2

Lipidoid 41的合成，包括如下步骤：

在圆底烧瓶中依次加入4-羟基丁基丙烯酰胺(14.3g，0.1mol)，壬酸 (19g，0.12mol)，EDC HCl(21.5g，0.12mol)，4-二甲氨基吡啶 (DMAP，1.46g，0.012mol)300mL二氯甲烷，在室温下搅拌反应12小时。反应完后，依次用稀盐酸溶液(1wt％，300mL×2)、水(300mL×2) 和饱和碳酸氢钠溶液(300mL×2)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗产品。粗产物通过柱层析(SiO

实施例3

Lipidoid 193的合成，包括如下步骤：

在圆底烧瓶中依次加入6-羟基己基丙烯酸酯(17.2g，0.1mol)，己酸(13.94g，0.12mol)，EDC HCl(21.56g，0.12mol)，4-二甲氨基吡啶 (DMAP，1.46g，0.012mol)300mL二氯甲烷，在室温下搅拌反应12小时。反应完后，依次用稀盐酸溶液(1wt％，300mL×2)、水(300mL×2) 和饱和碳酸氢钠溶液(300mL×2)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗产品。粗产物通过柱层析(SiO

在圆底烧瓶中依次加入A(17.18g，0.06mol)和N-(2-氨乙基)-1,4- 哌嗪二基二乙胺(2.13g，0.01mol)，在80℃搅拌反应48小时。反应完后，通过柱层析(SiO

实施例4

Lipidoid 213的合成，包括如下步骤：

在圆底烧瓶中依次加入2-羟基丙烯酸乙酯(11.6g，0.1mol)，辛酸(17.3 g，0.12mol)，EDC HCl(21.56g，0.12mol)，4-二甲氨基吡啶(DMAP， 1.46g，0.012mol)300mL二氯甲烷，在室温下搅拌反应12小时。反应完后，依次用稀盐酸溶液(1wt％，300mL×2)、水(300mL×2)和饱和碳酸氢钠溶液(300mL×2)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗产品。粗产物通过柱层析(SiO

在圆底烧瓶中依次加入A(5.81g，0.024mol)和N-(2-氨基乙基)吗啉 (1.3g，0.01mol)，在80℃搅拌反应48小时。反应完后，通过柱层析(SiO

实施例5

可降解的可降解脂质纳米颗粒(LNP)的制备：

将本发明中的可降解的脂质体与辅助磷脂(DOPE)、胆固醇、C14-PEG2000按照摩尔比45:15:36.5:3.5的比例在无水乙醇中溶解。mRNA在 pH＝4.5的PBS缓冲液中溶解。可降解的脂质体与mRNA的质量比为10：1。在微流控仪器上，左侧注射器装溶解了mRNA的PBS溶液，右侧注射器装以上各脂质体的乙醇混合液，水相与乙醇相的体积比为3：1。PBS相的流速为1.8mL/min，乙醇相的流速为600ul/min，收集含有可降解脂质纳米颗粒的粗溶液，然后加入到透析卡(截留分子量：20K)在1x PBS里室温下透析4小时除去LNP溶液中的乙醇成分，用0.22um的无菌过滤膜，得到纯的LNP溶液，置于4℃存储待用。根据可降解的脂质体的结构不同，可以制备不同的LNP，表1为本发明制备LNP所用脂质体结构。

表1 不同可降解LNP所用脂质体结构

性能测试：针对以上LNP，进行性能测试；

实施例6

不同LNP粒径测试：

将实施例5中制备的LNP进行动态光散射测试颗粒直径分布。表1中各脂质体形成的LNP的水合粒径结果如图2所示。所述的LNP粒径大小在 40-160nm，粒径大小均一，分布窄。

实施例7

不同LNP对mRNA包封率测试：

将实施例5中制备的LNP进行mRNA的包裹效率的测试，表1中各脂质体形成的LNP对mRNA的包封率结果如图3所示，本发明所制备的LNP对mRNA 的包裹率在60-90％之间。

实施例8

不同LNP细胞毒性评估：

将实施例5中制备的LNP进行细胞毒性的测试。以培养基处理的样品作为对照，96孔板每孔种的细胞数量为10k，每孔加的mRNA-LNP的量为10 ng mRNA，放在一起培养12h后进行毒性测试。测试结果如图4所示，本发明所制备LNP的细胞毒性与空白对照(PBS)相似，说明所述LNP几乎没有或具有低细胞毒性。

实施例9

不同LNP在体外递送能力评估：

将实施例5中制备的LNP进行体外mRNA递送的测试。以培养基处理的样品作为对照，96孔板每孔种的细胞数量为10k，每孔加的mRNA-LNP的量为10ng mRNA，放在一起培养12h后进行转染能力测试，所得转染数值与对照组数值相比即为相对发光强度。表1中不同LNP的递送效率筛选结果如图5所示，结果可知，所述的可降解的脂质体有多个与阳性对照C12-200 相似，并且有多数优于阳性对照。

实施例10

优化后可降解LNP在萤火虫荧光素酶(firefly luciferase，Fluc)体内递送性能评估：

制剂方法：将本发明中的可降解脂质体与DOPE，胆固醇，C14-PEG2000 以摩尔比为45:15:36.5:3.5的比例混合溶解在无水乙醇中，同时Fluc mRNA 溶解在醋酸钠溶液(10mM)中。分别使用微量注射泵，控制乙醇溶液与醋酸钠溶液配比为1:3，且流速分别为600ul/min和1.8ml/min，在微流控芯片中制得可降解脂质纳米颗粒的粗溶液，后使用透析卡在1x磷酸盐缓冲溶液PBS中室温下透析2小时，使用前用0.45um的无菌微孔滤膜过滤。实验中控制递送载体与Fluc mRNA的质量比约为10:1。

动物准备：选取6～8周龄的雌性C57BL/6J小鼠，体重在20g左右，饲养环境为SPF级的饲养室，动物实验严格按照国家健康机构的指南以及动物伦理要求进行。

体内递送：每组随机选取3只小鼠，按0.15mg/kg的用量，通过尾静脉注射可降解脂质纳米颗粒。14小时后，分别往每只小鼠体内通过腹腔注射200uL 15mg/mL的D-荧光素钾盐，将小鼠麻醉后5min置于活体成像系统下，观察每只小鼠总的生物发光强度，之后将小鼠安乐死取其主要器官 (心、肝、脾、肺和肾)进行拍照并记录。优化后可降解的LNP体内递送Fluc mRNA的表达强度见表2，本发明中多个递送载体明显优于标杆LNP (C12-200)。其中编号为LNP 223的在肝脏的生物发光强度较标杆LNP增加了50余倍(图6)。编号为LNP 23在脾脏的生物发光强度也很高(图7)，而标杆LNP(C12-200)几乎只在肝脏上表达。

表2 优化后可降解的LNP体内递送Fluc mRNA的表达强度

实施例11

优化后可降解的可降解脂质纳米颗粒在外源性人类促红细胞生成素蛋白 (hEPO)mRNA体内递送的评估：

制剂方法：将本发明中的递送载体与DOPE，胆固醇，C14-PEG2000以摩尔比为45:15:36.5:3.5的比例混合溶解在无水乙醇中，同时hEPO mRNA 溶解在醋酸钠溶液(10mM)中。分别使用微量注射泵，控制乙醇溶液与醋酸钠溶液配比为1:3，且流速分别为600ul/min和1.8ml/min，在微流控芯片中制得可降解脂质纳米颗粒的粗溶液，后使用透析卡在1x磷酸盐缓冲溶液PBS中室温下透析2小时，使用前用0.45um的无菌微孔滤膜过滤。实验中控制递送载体与hEPO mRNA的质量比约为10:1.

动物准备：选取6～8周龄的雌性C57BL/6J小鼠，体重在20g左右，饲养环境为SPF级的饲养室，动物实验严格按照国家健康机构的指南以及动物伦理要求进行。

体内递送：组随机选取3只小鼠，按0.15mg/kg的用量，通过尾静脉注射可降解脂质纳米颗粒。14小时后，进行血清学分析。C12-200作为阳性对照。hEPO在体内的表达强度通过酶联免疫吸附测定(ELISA)。测试方法遵从该试剂盒的使用说明书。如图8所示，本发明中某一种实施例LNP 30对hEPO的表达值明显优于阳性标杆LNP(C12-200)。

实施例12

优化后可降解的可降解脂质纳米颗粒体内肝脏毒性的评估：

制剂方法：将本发明中的递送载体与DOPE，胆固醇，C14-PEG2000 以摩尔比为45:15:36.5:3.5的比例混合溶解在无水乙醇中，同时Fluc mRNA 溶解在醋酸钠溶液(10mM)中。分别使用微量注射泵，控制乙醇溶液与醋酸钠溶液配比为1:3，且流速分别为600ul/min和1.8ml/min，在微流控芯片中制得可降解脂质纳米颗粒的粗溶液，后使用透析卡在1x磷酸盐缓冲溶液PBS中室温下透析2小时，使用前用0.45um的无菌微孔滤膜过滤。过滤后对所得的LNP进行体积上的浓缩，在1000xg下离心两个小时，得到的LNP重新通过无菌微孔滤膜过滤。实验中控制递送载体与Fluc mRNA的质量比约为10:1.

动物准备：选取6～8周龄的雌性C57BL/6J小鼠，体重在20g左右，饲养环境为SPF级的饲养室，动物实验严格按照国家健康机构的指南以及动物伦理要求进行。

体内递送：组随机选取3只小鼠，按1mg/kg的用量，通过尾静脉注射可降解脂质纳米颗粒。14小时后，进行血清学分析。C12-200作为阳性对照。LNP在体内的肝脏毒性通过转氨酶试剂盒进行测试。测试方法遵从该试剂盒的使用说明书。如图9所示，本发明中LNP223肝脏毒性非常小，比标杆LNP C12-200的毒性更小。

综上所述，本发明通过引入多级可降解酯类结构得到了一系列可降解脂质分子，随后与磷脂、固醇和聚乙二醇脂形成了256个可降解LNP。进一步通过优化配方设计，该发明实施例中有多个体内递送效率可以与基准LNP (C12-200)在同一水平甚至更高。其中，在递送荧光素酶编码的mRNA时，该配方中编号LNP 223表现出最高的转染能力，比基准LNP(C12-200)提高了近50倍；在递送功能性外源性蛋白，如人类促红细胞生成素蛋白(humanerythropoietin)时，编号LNP 30表现出比基准LNP(C12-200)更优异的递送效率。

本发明实施例是一种改进的氨基脂质化合物，其合成反应条件温和、反应产率高、合成步骤简单，且对仪器设备要求低。该改进的氨基脂质化合物与磷脂、固醇、聚乙二醇脂形成的LNP具有更加优异的mRNA载体性能，可以明显提高mRNA-LNP在细胞内的翻译表达水平。同时，双酯(酰胺)结构的引入，可以大大增加其可降解的能力从而减小体内毒性。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。