陆地棉GhRF09基因的抗旱性相关分子标记及应用

技术领域

本发明涉及植物辅助育种领域，具体涉及陆地棉GhRF09基因的抗旱性相关分子及应用。

背景技术

α-酮戊二酸(2OG)/Fe(II)依赖双加氧酶广泛参与植物的多种代谢过程,是植物体内一种重要的氧化酶，相关研究也表明α-酮戊二酸(2OG)/Fe(II)依赖双加氧酶可能在植物抗旱性相关机制中扮演着重要的角色。在水稻中，RL14基因作为一种2OG-Fe(II)双加氧酶蛋白，其通过影响次生细胞壁的组成来影响叶片的水分运输，这种水分运输的变化导致缺水，也是导致叶片卷曲的主要原因(Fang L,Zhao F,Cong Y,et al.Rolling-leaf14 is a2OG-Fe(II)oxygenase family protein that modulates rice leaf rolling byaffecting secondary cell wall formation in leaves.Plant Biotechnol J.2012；10(5):524-532.doi:10.1111/j.1467-7652.2012.00679.x)。在拟南芥中，DMR6基因编码一个与防御相关的2OG-Fe(II)双加氧酶，参与对霜霉菌易感性降低的过程(van Damme,Mireille et al.“Arabidopsis DMR6 encodes a putative 2OG-Fe(II)oxygenase thatis defense-associated but required for susceptibility to downy mildew.”ThePlant journal:for cell and molecular biology vol.54,5(2008):785-93.doi:10.1111/j.1365-313X.2008.03427.x)。在苹果中，MdCoL基因编码一个假定的2OG-Fe(II)加氧酶，是控制苹果树柱状的生长表型的一个强有力的候选基因，mdCoL通过与mdDREB2脱落酸的相互作用来影响脱落酸(ABA)的生物合成(Sun,Xin et al.“The apple columnargene candidate MdCoL and the AP2/ERF factor MdDREB2positively regulate ABAbiosynthesis by activating the expression of MdNCED6/9.”Tree physiologyvol.41,6(2021):1065-1076.doi:10.1093/treephys/tpaa162)。

棉花，锦葵科(Malvaceae)棉属(Gossypium)植物，是我国新疆地区主要的经济作物之一，据统计当前我国新疆地区棉花种植面积达全国棉花种植总面积的76％，产量占全国总产量的84.6％，棉花的推广和生产对于新疆地区的经济发展已经变得不可或缺。干旱胁迫，作为植物可能面临的最主要的非生物胁迫之一，它的出现在一定程度上会阻碍棉花正常的生长发育。据研究表明，干旱胁迫可使棉花体内的生理过程受到严重的影响，导致棉花的品质和产量极大的降低，严重影响到棉花的经济效益，从而给农民带来巨大的损失。目前，想要真正的缓解干旱胁迫给棉花带来的诸多危害，除了要对环境做出改善之外，对棉花自身抗性的改良一直是育种家们所关注的重点。但是随着自然不断的选择更替，抗旱性优良的棉花种质资源并不丰富，我们还有待进一步的去扩展抗旱性优良的棉花种质资源。

分子标记辅助选择(MAS)被认为是将遗传多样性带入育种计划的主要工具，但是一直以来都没有被广泛的应用。随着育种家们的不断尝试，发现将MAS与现代育种方法整合的新模型将极大地提高育种的可靠性和效率，从而促进传统遗传多样性的利用。事实上，提高植物育种效率一直是通过构建外来遗传文库，来开发遗传资源的过程。近年来，国内外越来越多的育种家将不同的作物与分子生物学、表观遗传学等多组学手段结合来辅助育种，借助与目标性状基因紧密连锁的分子标记的基因型进行品种抗旱性强弱的筛选，从而筛选出适合于干旱缺水地区种植的抗旱性品种，这摒弃了传统育种上周期长，选择效率低的不足，极大地加快了抗旱新品种的选育进程。目前在棉花上用于鉴别和筛选棉花抗旱性优良材料的分子标记用于辅助选择育种方面的研究还较少，需要开发一种能够对棉花材料抗旱性相关性状指标密切关联的抗旱性相关分子标记，来应用于棉花抗旱性优良品种的快速鉴别和选育。

发明内容

本发明要解决的技术问题是在棉花辅助选择育种过程中，开发一种能够对棉花材料抗旱性相关性状指标密切关联的抗旱相关分子标记，来应用于棉花抗旱性优良品种的快速鉴别和选育，为快速鉴定及筛选大规模棉花抗旱性群体奠定基础，为后续棉花分子育种做出贡献。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于陆地棉GhRF09基因的抗旱性相关分子标记开发及应用。

第一方面，本发明要求保护棉花基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性或用于检测棉花基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性的物质在鉴定或辅助鉴定待测棉花抗旱性中的应用；

所述SNP位点在棉花参考基因组TM-1_ZJU_V2.1中的物理位置为A10：83520949；参考基因组序列TM-1_ZJU_V2.1可从棉花COTTONGEN数据库(https://www.cottongen.org/data/download/genome_tetraploid/AD1)获得；所述SNP位点处的核苷酸为T或G。注：TM-1_ZJU_V2.1参考基因组上的物理位置是GhRF09基因反义链的物理位置。对应于正义链，所述SNP位点在棉花基因组中SEQ ID No.4所示DNA片段的第18位，为A或C。

进一步地，用于检测棉花基因组中所述SNP位点的单核苷酸多态性的物质为后文第二方面中所述的KASP引物或后文第三方面中所述的试剂或试剂盒。

第二方面，本发明要求保护用于鉴定或辅助鉴定棉花抗旱性的KASP引物。

本发明要求保护的用于鉴定或辅助鉴定棉花抗旱性的KASP引物由引物1、引物2和引物3组成；所述引物1为自5’端到3’端依次为标签序列A和SEQ ID No.1的第22-39位的单链DNA；所述引物2为自5’端到3’端依次为标签序列B和SEQ IDNo.2的第22-39位的单链DNA；所述引物3为核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA。

进一步地，所述标签序列A的核苷酸序列可为SEQ ID No.1的第1-21位；所述标签序列B的核苷酸序列可为SEQ ID No.2的第1-21位。

在本发明的具体实施方式中，所述引物1为核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的单链DNA；所述引物2为核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的单链DNA。

第三方面，本发明要求保护用于鉴定或辅助鉴定棉花抗旱性的试剂或试剂盒。

本发明要求保护的用于鉴定或辅助鉴定棉花抗旱性的试剂或试剂盒中含有前文第二方面中所述的KASP引物。

进一步地，所述试剂或试剂盒中还含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B。所述荧光探针A的核苷酸序列与所述标签序列A的核苷酸序列一致，5’末端连接荧光基团A；所述淬灭探针A的核苷酸序列与所述标签序列A的核苷酸序列反向互补，3’末端连接淬灭基团。所述荧光探针B的核苷酸序列与所述标签序列B的核苷酸序列一致，5’末端连接荧光基团B；所述淬灭探针B的核苷酸序列与所述标签序列B的核苷酸序列反向互补，3’末端连接淬灭基团。

在本发明的具体实施方式中，所述荧光基团A为VIC；所述荧光基团B为FAM；所述淬灭基团为BHQ。

第四方面，本发明要求保护前文第二方面中所述的KASP引物或前文第二方面中所述的试剂或试剂盒在如下任一中的应用：

(A1)鉴定或辅助鉴定棉花抗旱性；

(A2)鉴定或辅助鉴定棉花在干旱胁迫下产量性状和/或表观形态和/或光合作用；

(A3)比较待测棉花的抗旱性强弱；

(A4)比较待测棉花在干旱胁迫下产量性状和/或表观形态和/或光合作用；

(A5)选育抗旱性相对较强的棉花单株或株系或品系或品种；

(A6)选育在干旱胁迫下产量相对较高和/或株高相对较高和/或果枝数相对较多和/或有效果枝数相对较多和/或光合作用相对较强的棉花单株或株系或品系或品种；

(A7)选育抗旱性相对较弱的棉花单株或株系或品系或品种；

(A8)选育在干旱胁迫下产量相对较低和/或株高相对较低和/或果枝数相对较、少和/或有效果枝数相对较少和/或光合作用相对较弱的棉花单株或株系或品系或品种；

(A9)棉花育种。

第五方面，本发明要求保护如下任一方法：

方法I：一种比较待测棉花的抗旱性强弱的方法，可包括如下步骤：检测待测棉花的基因组中如下SNP位点处的核苷酸，确定所述待测棉花的基因型，根据所述待测棉花的基因型按照如下确定所述待测棉花的抗旱性：G:G基因型的所述待测棉花的抗旱性强于或候选强于T:G基因型的所述待测棉花的抗旱性。

该方法也可以用于比较待测棉花在干旱胁迫下产量性状和/或表观形态和/或光合作用。G:G基因型的所述待测棉花的在干旱胁迫下产量高于或候选高于T:G基因型的所述待测棉花，G:G基因型的所述待测棉花的在干旱胁迫下株高高于或候选高于T:G基因型的所述待测棉花，G:G基因型的所述待测棉花的在干旱胁迫下果枝数多于或候选多于T:G基因型的所述待测棉花，G:G基因型的所述待测棉花的在干旱胁迫下有效果枝数多于或候选多于T:G基因型的所述待测棉花，G:G基因型的所述待测棉花的在干旱胁迫下光合作用强于或候选强于T:G基因型的所述待测棉花。

方法II：一种选育抗旱性相对较强的棉花单株或株系或品系或品种的方法，可包括如下步骤：检测待测棉花的基因组中如下SNP位点处的核苷酸，确定所述待测棉花的基因型，选择基因组中所述SNP位点为G:G基因型的所述待测棉花作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中所述SNP位点为G:G基因型的棉花，最终获得抗旱性相对较强的棉花单株或株系或品系或品种。

该方法也可用于选育在干旱胁迫下产量相对较高和/或株高相对较高和/或果枝数相对较多和/或有效果枝数相对较多和/或光合作用相对较强的棉花单株或株系或品系或品种。最终获得的所述抗旱性相对较强的棉花单株或株系或品系或品种即为在干旱胁迫下产量相对较高和/或株高相对较高和/或果枝数相对较多和/或有效果枝数相对较多和/或光合作用相对较强的棉花单株或株系或品系或品种。

方法III：一种选育抗旱性相对较弱的棉花单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：检测待测棉花的基因组中如下SNP位点处的核苷酸，确定所述待测棉花的基因型，选择基因组中所述SNP位点为T:G基因型的所述待测棉花作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中所述SNP位点为T:G基因型的棉花，最终获得抗旱性相对较弱的棉花单株或株系或品系或品种。

该方法也可用于选育在干旱胁迫下产量相对较低和/或株高相对较低和/或果枝数相对较、少和/或有效果枝数相对较少和/或光合作用相对较弱的棉花单株或株系或品系或品种。最终获得的所述抗旱性相对较弱的棉花单株或株系或品系或品种即为在干旱胁迫下产量性对较低和/或株高相对较低和/或果枝数相对较、少和/或有效果枝数相对较少和/或光合作用相对较弱的棉花单株或株系或品系或品种。

在本发明中，所述抗旱性相对较强是指：与T:G基因型的棉花相比，G:G基因型的棉花的抗旱性相对较强或候选相对较强。所述抗旱性相对较弱是指：与G:G基因型的棉花相比，T:G基因型的棉花的抗旱性相对较强或候选相对较弱。相应地，所述产量相对较高、所述株高相对较高、所述果枝数相对较多、所述有效果枝数相对较多、所述光合作用相对较强均是与T:G基因型的棉花相比，G:G基因型的棉花所显现出的性状。所述产量相对较低、所述株高相对较低、所述果枝数相对较少、所述有效果枝数相对较少、所述光合作用相对较弱均是与G:G基因型的棉花相比，T:G基因型的棉花所显现出的性状。

在所述方法中，所述SNP位点在棉花参考基因组TM-1_ZJU_V2.1中的物理位置为A10：83520949；所述SNP位点处的核苷酸为T或G；注：TM-1_ZJU_V2.1参考基因组上的物理位置是GhalkB09基因反义链的物理位置。对应于正义链，所述SNP位点在棉花基因组中SEQ IDNo.4所示DNA片段的第18位，为A或C。

所述G:G基因型为在棉花参考基因组TM-1_ZJU_V2.1中的物理位置A10：83520949处的核苷酸为G的纯合型；对应于正义链，所述G:G基因型在棉花基因组中SEQ IDNo.4所示DNA片段的第18位处的核苷酸为C的纯合型；

所述T:G基因型为在棉花参考基因组TM-1_ZJU_2.1中的物理位置A10：83520949处的核苷酸为T和G的杂合型。对应于正义链，所述T:G基因型为在棉花基因组中SEQ ID No.4所示DNA片段的第18位处的核苷酸为A和C的杂合型。

另外，除了所述G:G基因型、所述T:G基因型，理论上还存在T:T基因型(在本发明验证的183份自然材料中没有发现T:T基因型，且还有一些材料存在未知基因型)。所述T:T基因型为在棉花参考基因组TM-1_ZJU_2.1中的物理位置A10：83520949处的核苷酸为T的纯合型；对应于正义链，所述T:T基因型在棉花基因组中SEQ IDNo.4所示DNA片段的第18位处的核苷酸为A的纯合型。

在上述方法中，所述“检测待测棉花的基因组中如下SNP位点处的核苷酸，确定所述待测棉花的基因型”可按照包括如下步骤的方法进行：利用前文第三方面中所述的试剂或试剂盒对所述待测棉花的基因组DNA进行PCR扩增，将所扩增的产物进行荧光信号扫描，然后按照如下确定所述待测棉花的基因组中所述SNP位点的基因型：

若所述待测棉花的扩增产物的荧光信号为所述荧光基团B的信号，则所述待测棉花的所述SNP位点为所述G:G基因型；

若所述待测棉花的扩增产物的荧光信号为所述荧光基团A和所述荧光基团B的信号，则所述待测棉花的所述SNP位点为所述T:G基因型。

若所述待测棉花的扩增产物的荧光信号为所述荧光基团A的信号，则所述待测棉花的所述SNP位点为所述T:T基因型；

若所述待测棉花的扩增产物的荧光信号均不显示所述荧光基团A和所述荧光基团B的信号，则所述待测棉花的所述SNP位点为未知基因型。

在本发明中，所述荧光探针A、所述荧光探针B、所述淬灭探针A和所述淬灭探针B是存在于KASP HiGeno 2x Probe Mix中的，其中所述KASP HiGeno 2x Probe Mix为北京嘉程生物科技有限公司产品(货号AQP-001S)。

在上述各方面中，所述棉花为陆地棉。

在本发明的具体实施方式中，所述棉花选自表3中所示的183份材料。

在上述各方面中，所述抗旱性主要体现在干旱胁迫下产量性状、表观形态和/或光合作用的变化。进一步地，所述产量性状通过如下指标体现：铃数(bollnumber，BN)、有效铃数(efficiency bollnumber，EBN)、单铃籽棉重(single boll seeds weight，SBSW)、单铃皮棉重(single boll lint weight，SBLW)和/或单铃重(Single boll weight，SBW)；所述表观形态通过如下指标体现：株高(plant height，PH)、果枝数(fruit branch number，FBN)和/或有效果枝数(efficiency fruit branch number，EFBN)；所述光合作用通过如下指标体现：净光合速率(photosynthetic net，Pn)、蒸腾速率(transpiration rate，Tr)和/或水蒸气压亏缺(vapor pressure deficit，VPD)。

本发明的有益效果：

(1)本发明开发的KASP标记表型选择效率与田间鉴定基本一致，可用于棉花不同种质资源中快速、精准的检测抗旱性。

(2)本发明开发的分子标记KASP可以高通量的应用在商业化分子育种中，且在检测过程中不需要酶切、电泳及测序等繁琐的程序，减少了气溶胶的污染以及EB等有毒物质的使用，直接对碱基进行检测，准确性不受扩增片段长度影响，而且简便、快捷、精准，自动化程度高，大大提高了基因选育效率，降低了成本。

(3)本发明开发的KASP标记可在苗期即可进行前景选择和背景选择，减小育种群体的田间种植规模，缩短育种年限，加快育种进程。

附图说明

图1为基因型分型结果图。

图2为183份资源材料抗旱性聚类图。A为基于CDC值进行的聚类分析结果图，B为基于D值进行的聚类分析结果图。

图3为183份陆地棉资源材料抗旱相关性状指标DC值、CDC值和D值结合基因型的箱线图。A-Q依次为各个材料以株高(PH)，第一果枝节位高度(HNFFB)，果枝数(FBN)，有效果枝数(EFBN)，铃数(BN)，有效铃数(EBN)，单铃籽棉重(SBSW)，单铃皮棉重(SBLW)，单铃重(SBW)，衣分(LP)，胞间二氧化碳浓度(Ci)，净光合速率(Pn)，气孔导度(Gs)，蒸腾速率(Tr)，水蒸气压亏缺(VPD)，水分利用效率(WUE)，叶绿素相对值(SPAD)这17个性状指标分别计算的抗旱系数(DC)值结合基因型数据绘制的箱线图，R和S依次为以各个材料的综合抗旱系数(CDC值)和抗旱性度量值(D)结合基因型数据绘制的箱线图。

具体实施方式

下述实施例大致内容如下：鉴于棉花抗旱性相关性状的复杂性以及多种分子标记技术比较下，通过干旱胁迫处理下的高通量测序数据和资源材料的表型数据，对通过抗旱性群体定位到的QTL候选区间中得到的非同义突变基因GhRF09，根据其基因型及特性进行KASP分子标记的开发，通过遗传背景丰富的陆地棉资源材料进行基因分型筛选鉴定，并对相关性状指标进行关联分析，从而进行抗旱性相关分子标记的开发。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、用于鉴定棉花抗旱性的分子标记的开发以及KASP引物的设计

本发明所用于开发分子标记的基因为陆地棉中的GhRF09基因，基因注释信息为α-酮戊二酸(2OG)/Fe(II)依赖双加氧酶。其来源背景为由抗旱性相关RIL群体基于抗旱性度量值D值进行BSA-seq简化基因组测序定位到的抗旱性相关候选区间内的候选基因，参考基因组为TM-1_ZJU_V2.1，其基因ID为GH_A10G1602，物理位置信息为A10:83519234-83521058(反义链)，CDS序列片段大小为1353bp，DNA全长序列片段大小为1825bp,蛋白质序列长度为450aa，相关信息可于棉花cottonFGD数据库(https://cottonfgd.net/profiles/gene/GH_A10G1602/)查询。

基于定位候选区间内SNP信息及非同义基因信息进行分析发现，位于基因组物理位置A10：83520949(反义链)处存在一个SNP突变：T/G，这个位点在GhRF09基因CDS序列中的第110位碱基，其突变引起了氨基酸的变化：cAt/cCt，由组氨酸突变为脯氨酸，是该基因中唯一一个非同义突变位点。根据其在GhRF09基因CDS序列中的位置，将该SNP位点命名为GhRF09-110SNP。

根据该SNP位点(GhRF09-110SNP)所在正义链设计KASP标记引物序列，如下：

上游引物F1：5’-

上游引物F2：5’-

下游引物R：5’-AACTCACTGAAGAATAATCGGAAGA-3’(SEQ ID No.3)。

两条上游引物的3’末端最后一个碱基对应该SNP位点(GhRF09-110SNP)。

上游引物F1用于扩增棉花参考基因组TM-1_ZJU_V2.1的物理位置A10：83520949(反义链)处核苷酸为T的情况，上游引物F2用于扩增棉花参考基因组TM-1_ZJU_V2.1的物理位置A10：83520949(反义链)处核苷酸为G的情况；下游引物R为通用引物。

理论扩增产物的序列如SEQ ID No.4所示(对应正义链)。SEQ ID No.4的第18位为所示SNP位点(GhRF09-110SNP)，为A或C(在SEQ ID No.4中用M表示)。

上述SEQ ID No.1所示的单链DNA分子与SEQ ID No.3所示的单链DNA分子扩增棉花参考基因组TM-1_ZJU_V2.1的物理位置A10：83520949(反义链)处核苷酸的基因型为T:T纯合型(即棉花基因组上SEQ ID No.4的第18位处碱基为A:A纯合)的片段。

上述SEQ ID No.2所示的单链DNA分子与SEQ ID No.3所示的单链DNA分子扩增棉花参考基因组TM-1_ZJU_V2.1的物理位置A10：83520949(反义链)处核苷酸的基因型为G:G纯合型(即棉花基因组上SEQ ID No.4的第18位处碱基为C:C纯合)的片段。

上述SEQ ID No.1所示的单链DNA分子、SEQ ID No.2所示的单链DNA分子与SEQ IDNo.3所示的单链DNA分子扩增棉花参考基因组TM-1_ZJU_V2.1的物理位置A10：83520949(反义链)处核苷酸的基因型为T:G杂合型(即棉花基因组上SEQ IDNo.4的第18位处碱基为A:C杂合)的片段。

实施例2、用KASP引物检测SNP基因型方法的建立及应用

1、DNA样本准备

DNA提取：采用CTAB法从棉花叶片中提取基因组DNA。

DNA浓度测定：随机抽取若干个DNA工作液，使用NanoDrop2000仪器测浓度。

DNA完整性鉴定：琼脂糖凝胶电泳，1.5％，120V，40min。有主带为合格。

SNP Primer Mix(4x)配制：将引物干粉稀释到100mM，再将三条序列按照F1：F2：R：ddH

DNA稀释：将DNA原液统一稀释至20ng/μl。

2、KASP反应

委托新疆艾德森生物科技有限公司通过LGC高通量基因分型检测平台进行GhalkB09-110SNP位点的KSAP检测。

KASP检测PCR扩增体系如表1所示。

表1、KASP检测PCR扩增体系

注：KASP HiGeno 2x Probe Mix为北京嘉程生物科技有限公司产品(货号AQP-001S)。KASP HiGeno 2x Probe Mix中含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A、淬灭探针B、ROX染料、高保真Taq酶、dNTP、Mg

KASP检测PCR反应程序如表2所示。

表2、KASP检测PCR反应程序

3、结果分析

荧光值读取：PCR扩增循环结束后，在低于40℃的环境下，利用荧光定量PCR仪器读取荧光值。在本方法中，SNP位点检测使用荧光团FAM和VIC来区分两个等基因位点。被动参比染料ROX(passive reference dye ROX)用于校正孔与孔之间由于反应体积误差导致的信号差异。相关的激发和发射波长示于下表3中。读取软件为LGC的Omega设备。

表3、荧光基团的激发光和发射光波长

注：如果荧光扫描仪器将HEX荧光基团作为检测信号，则不需要对设置进行修改，因为VIC和HEX的激发光和发射光值非常相似。

利用LGC的基因分型软件(Kluster Caller)对荧光值读取的结果数据进行分析。每个反应孔的VIC和FAM值通过该特定孔参比染料(ROX)的值进行矫正，将数据荧光值进行标准化处理，获取每一个PCR反应孔的VIC和FAM对应的相对荧光值。根据相对荧光值，对样品进行聚类分簇，进一步根据样品簇和荧光类型确定待测棉花基因组中GhRF09-110SNP位点的基因型(即棉花基因组上SEQ ID No.4的第18位处碱基为A还是C)：若所述待测棉花的扩增产物的荧光信号数据经基因分型软件KlusterCaller分析靠近Y轴(VIC信号)，则待测棉花基因组中GhRF09-110SNP位点的基因型为T:T纯合型(即棉花基因组上SEQ ID No.4的第18位处碱基为A:A纯合)；若待测棉花的扩增产物的荧光信号数据经基因分型软件KlusterCaller分析靠近X轴(FAM信号)，则待测棉花基因组中GhRF09-110SNP位点的基因型为G:G纯合型(即棉花基因组上SEQ ID No.4的第18位处碱基为C:C纯合)；若待测棉花的扩增产物的荧光信号数据经基因分型软件KlusterCaller分析位于X轴和Y轴中间(同时有VIC和FAM信号)，则待测棉花基因组中GhRF09-110SNP位点的基因型为T:G杂合型(即棉花基因组上SEQ ID No.4的第18位处碱基为A:C杂合)。

基因分型结果图如图1所示。标记为橙色(打叉)的为基因型T:G，标记为蓝色(圆形)的为基因型G:G，标记为绿色(正方形)的为基因型未知。

4、标记分型数据分析

供试陆地棉资源材料共183份，包括黄河流域棉区、西北内陆棉区、长江流域棉区和东北特早熟棉区等各大棉区常规种植品种、部分国外引进材料以及本实验室自育材料，均由新疆农业大学农学院作物遗传改良与种质创新重点实验室收集并提供。

一方面，按照上述方法检测各供试棉花材料GhRF09-110SNP位点的基因型。另一方面，采用常规方法进行田间抗性鉴定。具体如下：

183份资源材料(参见表4，记载于“闫成川,曾庆涛,陈琴,付锦程,王婷伟,陈全家,曲延英.陆地棉花铃期抗旱指标筛选及评价[J].中国农业科技导报,2022,24(07):46-57”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用不得他用)的抗旱性鉴定相关试验于2021年在沙湾县144团3连新疆农业大学棉花育种基地(43°20′—45°20′N，84°45′—86°40′E)进行。试验设置干旱胁迫和正常对照2个处理，各2个重复，干旱胁迫与正常对照之间设2m的保护行。每个小区行长2m，1区14膜，1膜3行，1膜1份材料种植，采用膜下滴灌浇水。试验材料于4月26日播种，5月5日出苗，7月7日打顶。胁迫处理在7月4日开始，胁迫前在干旱区主管道安装水表来记录控水量。栽培期间管理方法同大田。干旱胁迫15d后，采用5点取样法对土壤0—20、20—40、40—60cm的土层进行取样称重，放入烘箱内烘至恒重称量，对含水量进行测定。结果显示，干旱胁迫后0—20cm土层的含水量变化最大，下降了8.257个百分点，3个土层含水量平均下降了7.921个百分点，胁迫期间2个干旱胁迫处理总共控水566m

选取棉花倒3叶，用光合仪(英国汉莎，CIRAS-3)测定光合指标，包括蒸腾速率(transpiration rate，Tr)、胞间二氧化碳浓度(intercellular carbon dioxideconcentration，Ci)、净光合速率(photosynthetic net，Pn)、气孔导度(gascavity，Gs)、水蒸气压亏缺(vapor pressure deficit，VPD)和水分利用效率(water use efficiency，WUE)，每个材料连续测3株取平均值为1个重复。

7月20日，用SPAD仪(日本赛亚斯，SYS-SPAD-502Plus)测定叶绿素相对值(SPAD)，选取棉花倒3叶，在倒3叶上、中、下测量取平均值，连续测3株，再取平均值记为1个重复。9月17日，测定干旱胁迫和正常对照的农艺性状，包括株高(plant height，PH)、第一果枝节位高度(Height at the node of the first fruit branch，HNFFB)、果枝数(fruit branchnumber，FBN)、有效果枝数(efficiency fruit branch number，EFBN)、铃数(bollnumber，BN)、有效铃数(efficiency bollnumber，EBN)；9月25日，开始混收棉花20铃,测量衣分(lint percentage，LP)，单铃重(Single boll weight，SBW)，单铃籽棉重(single bollseeds weight，SBSW)和单铃皮棉重(single boll lint weight，SBLW)，测定方法参照《棉花种质资源描述规范和数据标准》(杜雄明,周忠丽.棉花种质资源描述规范和数据标准[M].北京:中国农业出版社,2005:1-89.)。

采用EXCEL 2010软件和SPSS 25.0软件对数据进行统计分析。本试验共计17个性状指标，进行抗旱评价的方法包括计算相关性状指标的抗旱系数(DC)、抗旱指数(DI)、综合抗旱系数(CDC值)及抗旱性度量值(D)，计算公式参照孙丰磊(孙丰磊,曲延英,陈全家,等.棉花抗旱相关指标综合评价及灰色关联分析[J].干旱地区农业研究.2019,37(1):233-239.)等人的计算方法来计算：

抗旱系数：

抗旱指数：

综合抗旱系数：

隶属函数：

抗旱性度量值：

上述各计算公式中，X

利用上述试验设计和分析方法对183份陆地棉资源材料的17个性状指标进行测定并分析。将正常处理和干旱胁迫处理后的平均值进行抗旱系数DC值的计算，然后计算综合抗旱系数CDC值和抗旱性度量值D值，通过聚类分析将183份陆地棉资源材料的抗旱性进行了等级划分，结果显示综合抗旱系数CDC值和抗旱性度量值D值的等级划分大致相同。最后根据抗旱性度量值D值进行最后抗旱性等级的确定：Ⅰ类为强抗旱型(0.54≤D≤0.78)，有16个材料，其中G/G基因型占比62.5％(10/16)，T/G基因型占比37.5％(6/16)；Ⅱ类为抗旱型(0.46≤D＜0.54)，有46个材料，其中G/G基因型占比约23.9％(11/46)，T/G基因型占比约71.7％(33/46)，未知基因型占比约4.3％(2/46)；Ⅲ类为中抗旱型(0.42≤D＜0.46)，有40个材料，其中G/G基因型占比22.5％(9/40)，T/G基因型占比75％(30/40)，未知基因型占比2.5％(1/40)；Ⅳ类为敏旱型(0.38≤D＜0.42)，有45个材料，其中G/G基因型占比约8.9％(4/45)，T/G基因型占比88.9％(40/45)，未知基因型占比约2.2％(1/45)；Ⅴ类为极敏旱型(0.28≤D＜0.38)，有36个材料，其中G/G基因型占比0％(0/36)，T/G基因型占比97.2％(35/36)，未知基因型占比约2.7％(1/36)。

具有G/G基因型的材料共计34个，其中位于Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类(强抗旱型、抗旱型和中抗旱型)的材料占比约88.2％(30/34)，位于Ⅳ类(敏旱型)的材料占比约11.8％(4/34)，位于Ⅴ类(极敏旱型)的材料占比为0％(0/34)。

183份资源材料抗旱性聚类图。图2中A为基于CDC值进行的聚类分析结果图，图2中B为基于D值进行的聚类分析结果图。颜色代表数值的大小，由蓝至黄代表着数值的由小到大。

183份陆地棉资源材料基于17个性状指标的抗旱系数DC值计算得到的综合抗旱系数CDC值、依据CDC值进行的等级划分情况、抗旱性度量值D值、依据D值进行的等级划分情况及GhRF09-110SNP位点的基因型信息如表4所示。表5为183份陆地棉资源材料的17个性状指标的DC值。

表4、183份陆地棉资源材料17个性状指标的CDC值及其对应等级、D值及其对应等级和GhRF09-110SNP位点的基因型信息

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表5、183份陆地棉资源材料的17个性状指标的DC值

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5、基因型与表型关联分析

将步骤4得到的基于183份陆地棉资源材料的抗旱性鉴定结果与其在GhRF09-110SNP位点的基因型结果进行关联分析，以达到将基因型与单个或多个性状指标关联的目的，探索基因型与抗旱性的联系。

利用软件GraphPad Prism 9对表型和基因型之间进行双尾T检验，结果如图3所示。ns代表无显著性差异；*代表P<0.05，表明不同基因型间的性状指标整体上呈显著性差异；**代表P<0.01，表明不同基因型间的性状指标整体上呈非常显著性差异；***代表P<0.001，表明不同基因型间的性状指标整体上呈极显著性差异。

结果显示，综合抗旱系数CDC值和抗旱性度量值D值均呈极显著差异，这表明基因的基因型变化与资源材料的整体抗旱性强弱存在较强的关联强度。在测定的17个性状指标中有BN、EBN、SBSW、SBLW、SBW等五个性状指标呈现极显著差异，这些指标均能直接的展现棉花的产量信息；有PH、FBN、EFBN等三个性状指标呈现非常显著差异，这些指标体现的是棉花的表观形态；Pn、Tr、Vpd等三个性状指标呈现显著性差异，这些指标均为光合测定指标。其余的性状指标在整体上虽然没有显著性差异，但是均呈现整体上的抗旱性差异性趋势。这些结果表明了GhRF09-110SNP位点的基因型与棉花抗旱性相关的多个性状指标显著关联，且在整体上，不同的基因型在一定程度上代表着抗旱性的强弱。

综上所述，GhRF09-110SNP位点不同的基因型可能通过某种干旱胁迫调控机制影响着棉花多个性状指标的差异性表现，且G/G基因型的材料相比于T/G基因型的材料在整体上较为抗旱，同时也通过对多个性状的影响达到植株抗旱性增加的效果，这表明GhRF09-110SNP位点作为一个分子标记，在棉花资源材料的抗旱性鉴定和筛选中具有重要意义，为棉花分子标记辅助选择育种奠定了良好的基础。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。