一种假禾谷镰孢分泌的植物免疫激活蛋白FpCDP1及其应用

技术领域

本发明属于基因工程及农作物生物防治技术领域，具体涉及一种假禾谷镰孢分泌的植物免疫激活蛋白FpCDP1及其在防治农作物病害中的应用。

背景技术

镰孢菌引起的小麦茎基腐病(crown rot of wheat)是小麦生产上重要的病害之一，其中假禾谷镰孢(Fusarium pseudograminearum)是引起小麦茎基腐病的优势病原菌，每年给世界小麦生产造成约10亿美元的直接经济损失(Powell et al.,2017)。我国于2012年首次发现假禾谷镰孢引起的小麦茎基腐病(Li et al.,2012)，目前该病害在黄淮麦区发生严重，已成为威胁我国小麦生产的重要病害(Xu et al.,2018；纪莉景等,2016)。

传统的化学农药能快速、有效地杀死病原菌，但也存在引起环境污染和造成有害生物形成抗药性等问题(许建勋,2011)。因此，高效、低毒、绿色环保的生物农药研发及利用越来越受到重视，越来越多的生物农药被开发出来，如赤眼蜂、各种菌体、提取物及微生物的代谢物，近来诱导植物抗性的蛋白质农药要被陆续开发出来(王成等,2011)。

病原菌在侵染寄主的过程中会分泌一些具有激发子功能的蛋白质，其能够被植物识别，诱导了植物的抗病性。由于病原菌与植物在互作的过程中，长期地进行“军备竞赛”、共同进化，其中一些分泌蛋白被植物中的蛋白质识别后触发了免疫反应，抵御了病原菌的侵染，我们把这类效应子称为植物免疫反应的激发子(Liu et al.,2013；Armstrong etal.,2005；Bos et al.,2009)。目前，假禾谷镰孢的激发子诱导作物抗病性的研究还没有相关的报道，因此假禾谷镰孢激发子的鉴定、开发及应用将有助于提高作物的抗病力，有利于粮食的安全生产。本发明鉴定到假禾谷镰孢分泌蛋白FpCDP1(Cell Death-relatedProtein)能强烈激发植物免疫反应并能够增强植物的抗病力，这表明其具有激发子的功能，可作为植物免疫诱抗蛋白的激活剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种假禾谷镰孢分泌的植物免疫激活蛋白FpCDP1及其编码基因和应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种假禾谷镰孢分泌的植物免疫激活蛋白FpCDP1，该蛋白为如下(a)或(b)所示的蛋白：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白；

(b)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与激活植物免疫反应功能相关的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白。

编码上述植物免疫激活蛋白FpCDP1的基因。该基因的核苷酸序列如下(1)或(2)：

(1)该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列相比，至少具有60％以上的同源性核苷酸序列；优选为与SEQ ID NO.2相比具有至少70％以上同源性的核苷酸序列；进一步优选为与SEQ ID NO.2相比具有至少80％以上同源性的核苷酸序列；更进一步优选为与SEQ ID NO.2相比具有至少90％以上同源性的核苷酸序列；最优选为与SEQ ID NO.2相比具有至少95％以上同源性的核苷酸序列。

一种重组表达载体，该重组表达载体包含上述编码植物免疫激活蛋白FpCDP1的基因。该重组表达载体是以植物表达载体pBin-HA为骨架载体，将编码植物免疫激活蛋白FpCDP1的基因序列插入该骨架载体的KpnI和BamHI酶切位点间所得的重组植物表达载体pBin-FpCDP1-HA。也可以采用其他植物表达载体构建。该重组表达载体通过农杆菌Gv3101在植物中表达FpCDP1蛋白后，能激发植物的免疫反应，接种病原菌后能抑制病原菌侵染。

一种重组菌，该重组菌由上述的重组表达载体转入受体菌所得，所述的受体菌为大肠杆菌、农杆菌细胞或其他表达蛋白菌株。

上述的植物免疫激活蛋白FpCDP1、上述的基因、上述的重组表达载体或上述的重组菌在提高植物免疫或抗病性中的应用。上述的植物免疫激活蛋白FpCDP1、上述的基因、上述的重组表达载体或上述的重组菌在高抗病性植物分子育种中的应用也属于本发明的保护范围。上述的植物免疫激活蛋白FpCDP1、上述的基因、上述的重组表达载体或上述的重组菌在防治农作物病害中的应用也属于本发明的保护范围。

所述的农作物或植物为小麦、玉米、水稻、棉花、黄瓜、草莓、番茄或烟草，但不限于此。所述的病害为小麦根腐病或烟草花叶病，但不限于此。

一种农药组合物，该农药组合物的有效成分包含上述的植物免疫激活蛋白FpCDP1或上述的重组菌。

本发明的植物免疫激活蛋白FpCDP1通过表达菌株可以在体外大量表达，进而喷施在作物表面提高其抗病能力。

研究结果表明：蛋白FpCDP1应用到植物上后能诱导植物免疫反应产生，提高植物的抗病能力；该蛋白可以通过转基因技术在植物中表达或者体外表达蛋白加以施用的方法，应用于农作物病害的防治，可以用于小麦、玉米、水稻、棉花、黄瓜、草莓、番茄及烟草病害的防治。

本发明的有益效果：

植物免疫激活蛋白FpCDP1作用于植物以后能激发植物的免疫反应，提高植物的抗病能力，有望通过分子育种将该蛋白转入植物中或者体外合成蛋白或肽段进行体外施用，或者定向改造生防菌使其增效生防能力。本发明可以通过分子育种和作为生物农药的施用提高植物的抗病力，因而在农业生产上具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为FpCDP1在烟草中表达诱导植物细胞坏死及其蛋白模式图；

图2为FpCDP1在烟草中表达能抑制病原菌的侵染；

图3为FpCDP1在烟草中表达的蛋白检测图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。本发明实施例所涉及引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

实施例1

(1)实验材料

假禾谷镰孢菌种(Fusarium pseudograminearum,WZ-8A)、小麦矮抗58、本氏烟、pBin-HA植物表达载体(郭宝佃.大豆疫霉RxLR效应子PsAVh240和Avr3b的结构与功能研究[D].南京农业大学,2019,76.)。

(2)假禾谷镰孢侵染小麦材料的获得

将小麦品种Ak58在10％NaClO中浸泡30秒后用无菌水洗5次，种植灭菌的基质中4天后，用假禾谷镰孢WZ-8A的孢子接种，分别在侵染8小时和24小时取侵染阶段的混合样，用RNA提取试剂盒(Vazyme)提取RNA，按着RNA逆转录试剂盒(Vazyme)将RNA逆转录成cDNA。

(3)目的基因的克隆

利用生物信息学鉴定到FpCDP1基因后，以假禾谷镰孢侵染阶段的cDNA为模板进行FpCDP1基因的扩增。

FpCDP1基因扩增的引物序列为：

上游引物序列：CATTTACGAACGATAGGGTACCATGCGTTTCACATCCATCCTCG(SEQ IDNO.3)；

下游引物序列：GGTAAGGCCTACTAGTGGATCCCAGAGCGAAGATAGCGGCAACAA(SEQ IDNO.4)；

50μL PCR反应体系(Vazyme高保真酶)：2×Phanta Max Master Mix 25μL，上游引物、下游引物各2μL，cDNA 2μL，ddH

将回收的FpCDP1基因的PCR产物根据CloneExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme)按照说明书操作连接到KpnI和BamHI双酶切的植物表达载体pBin-HA上得到pBin-FpCDP1-HA质粒，转化大肠杆菌JM109感受态细胞中，涂含有50μg/mL卡纳的LB平板，37℃培样14小时后，用载体引物进行菌落PCR验证，挑取两个阳性克隆，按着SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(上海生工)操作步骤提取质粒送郑州尚亚生物公司测序。通过电击转化将测序正确的质粒到农杆菌GV3101中，涂50μg/mL卡纳和50μg/mL利福平的LB平板，28℃培养48小时后，用载体引物进行菌落PCR验证，选取转入目的基因的阳性克隆进行后续实验。

(4)转入含有FpCDP1目的基因农杆菌的扩大培养

分别含有pBin-FpCDP1-HA载体及pBin-GFP-HA载体(是以pBin-HA为骨架，参考现有技术将GFP基因连上去得到的)以及含有P19的农杆菌GV3101单菌落，接种到4mL含有50μg/mL卡纳和50μg/mL利福平的液体LB培养液中，在28℃，200rpm摇床上培养16小时，5000g离心3分钟收集菌体。用1mL缓冲液(含有10mM MgCl

(5)在本氏烟叶片中瞬时表达FpCDP1

用去针头的注射器将配置好的农杆菌菌液注射入烟草叶片中，吸水纸吸干防止菌液污染其他部位，将注射后的烟草放置在温室中(24℃、16h光照/8h黑暗)培养。农杆菌注射表达5-7天后，观察烟草叶片的表型变化。实验结果显示：与表达了GFP的叶片相比，在表达了FpCDP1的烟草叶片上出现了明显的坏死斑，这表明FpCDP1在烟草中表达能强烈诱导烟草细胞的坏死(图1)。

(6)FpCDP1增强烟草对辣椒疫霉菌的抗性

在生长30天左右的烟草叶片上分别表达GFP和FpCDP1，在注射36小时后接种辣椒疫霉菌，进行25℃黑暗保湿培养36-48小时后，进行侵染观察、测量记录病斑大小并拍照。与表达GFP对照相比，表达了FpCDP1的烟草在接种辣椒疫霉菌后均出现较小的病斑(图2)，这表明FpCDP1在植物中表达能增强植物的抗病性。

(7)FpCDP1蛋白表达检测

将注射带有表达载体的农杆菌36小时的烟草叶片在液氮条件下研磨，将研磨后的粉末加入到1mL的蛋白裂解液(1M Tris-HCl(PH＝6.8)100μL、10％(g/100ml)SDS 600μL、ddH

FpCDP1蛋白全长序列：SEQ ID NO.1

MRFTSILAAGAFATMASAQSKTVSMDPAQASQMDCLKDCEAGDVKCQSYCITVPSPNEQDIEKTTKCVAACPKGKGSEADTQKYTVCMNECIADNYWKSVDGTPRGTDVPDVKSQASEAASSAADKATATGTASESDATATAAATNSESGSDSSSDETGSATGSGTATGTAAEVSETGNAASSLVGGVSFLGLVAAIFAL*

FpCDP1基因全长核苷酸序列：SEQ ID NO.2

ATGCGTTTCACATCCATCCTCGCTGCCGGTGCTTTCGCCACCATGGCCTCTGCCCAGAGCAAGACCGTCTCCATGGACCCTGCTCAGGCTTCCCAGATGGACTGCCTCAAGGACTGTGAGGCTGGCGATGTCAAGTGCCAGTCTTACTGTATCACTGTCCCCTCTCCCAACGAGCAGGACATTGAGAAGACCACCAAGTGTGTTGCCGCCTGCCCCAAGGGTAAGGGCTCCGAGGCCGATACCCAGAAGTACACCGTCTGCATGAACGAGTGTATCGCCGACAACTACTGGAAGTCCGTTGACGGTACCCCCCGTGGCACCGACGTCCCCGATGTCAAGAGCCAGGCCTCCGAGGCTGCCTCCTCCGCCGCTGACAAGGCCACCGCCACCGGCACCGCTTCCGAGTCTGATGCTACCGCCACTGCTGCTGCTACCAACTCCGAGTCCGGCTCCGACTCCAGCTCCGATGAGACCGGCTCTGCTACCGGCTCCGGCACTGCTACTGGCACCGCTGCTGAGGTCTCCGAGACTGGCAACGCCGCCTCTTCTCTCGTTGGTGGTGTCTCCTTCCTCGGTCTTGTTGCCGCTATCTTCGCTCTGTAA

SEQ ID NO.3

5’-CATTTACGAACGATAGGGTACCATGCGTTTCACATCCATCCTCG-3’

SEQ ID NO.4

5’-GGTAAGGCCTACTAGTGGATCCCAGAGCGAAGATAGCGGCAACAA-3’