利用同种真菌同步溶解-回收铅锌矿废液污染灰钙土中重金属的方法

技术领域

本发明涉及污染的土壤的复原的技术领域，特别涉及一种土壤修复与环境保护领域的利用同种真菌同步溶解-回收铅锌矿废液污染灰钙土中重金属的方法。

背景技术

灰钙土是暖温带荒漠草原区弱淋溶的干旱土，表层弱腐殖化，土壤有机质含量1-2.5％，15-30cm处为假菌丝状或斑点状的钙积层，剖面中下部还可出现石膏淀积层与可溶盐淀积层。矿山和冶炼厂附近农田灰钙土重金属污染问题受到了越来越多的关注，农田灰钙土中重金属含量过高时，会导致作物体内重金属积累甚至无法生长，亦将对人体健康造成严重威胁，每年因重金属污染而导致生态环境破坏和大量农作物的损失。因此，对这些污染灰钙土进行修复就显得尤为重要和迫切。

由于重金属具有不易分离和不可降解等特点，使灰钙土修复非常困难。近年来，许多修复技术被应用于重金属污染的农田灰钙土，然而大部分技术由于其高成本和可能的二次污染而受限。

生物修复技术被认为是环境友好、运行成本低和应用范围广的灰钙土重金属修复技术。生物淋滤技术是微生物修复技术中的一种，它通过将微生物直接接种到目标物质上或者将其代谢产物间接作用于目标物上，经过氧化、还原、络合、吸附或溶解等方式，将固相中某些不溶性成分分离浸提出来的一种技术。生物溶解机制主要有酸解作用、络合作用和氧化还原作用，以酸解作用为主。常用的微生物主要分为三大类：化能自养细菌、化能异养细菌、化能异养真菌，黑曲霉作为化能异养真菌，是代谢分泌有机酸方面具有独特优势的一类，被众多研究者用于生物淋洗各种介质(如液晶显示屏，电池和灰钙土等)中的重金属。黑曲霉代谢分泌的有机酸主要有葡萄糖酸、柠檬酸、草酸、乙酸和苹果酸等，能有效的产生大量的H+，从而降低土壤pH、为重金属的溶出提供有力条件，其分泌物中还包含大量羟基、羧基和磷酸基等活性基团和蛋白质、氨基酸等胞外多聚物，不仅能螯合重金属促进溶解，还能为灰钙土提供营养物质，恢复灰钙土的生态功能。另外，黑曲霉菌球体中含有大量活性基团，是生物收集重金属的有效结合位点，为黑曲霉收集水体重金属提供有利条件。因此，黑曲霉淋洗灰钙土是一种具有降低灰钙土毒性、提供营养物质和恢复生态功能的潜在修复方法。

矿区周围灰钙土中高毒性的重金属(Cu、Zn、Pb和Cd)含量严重超标，这些灰钙土中的金属含量高达数百甚至数千mg/kg，使得周边地区的农作物受到了严重影响，重金属积累量远高于未污染灰钙土中的作物，对当地居民的身体健康构成威胁。因此，探索多种重金属污染灰钙土的可持续、绿色高效的修复技术迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种利用同种真菌同步溶解-回收铅锌矿废液污染灰钙土中重金属的方法，利用黑曲霉产生的代谢产物，通过溶解螯合等方式减少灰钙土中重金属的含量，同时利用黑曲霉菌球体收集溶解废液中重金属，以达到治理的目的。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种利用同种真菌同步溶解-回收铅锌矿废液污染灰钙土中重金属的方法，利用所述真菌产生的代谢产物配置的溶解剂溶解并去除灰钙土中的重金属，并同时利用所述真菌球体收集溶解废液中的重金属；具体来说，为以黑曲霉分泌物作为去除灰钙土中重金属的溶解溶液，以黑曲霉菌球体作为收集材料回收灰钙土溶解后废液中的重金属。

优选地，所述真菌为黑曲霉；菌株经复溶后，于培养基，如LB固体培养基培养获取菌株孢子，预设天数后(一般为10天)，以无菌枪头吸取无菌水冲洗菌落表面，制备得到黑曲霉孢子液，孢子液数量级为10

本发明中，黑曲霉孢子液数量级为3×10

优选地，所述溶解剂由真菌菌液经过液体培养基灭菌后培养得到，真菌球体经液体培养基培养后过滤得到。

优选地，所述液体培养基由以下重量份的原料组成：蛋白胨2～8份、葡萄糖10～30份、酵母浸出粉1～5份、磷酸氢二钾0.1～5份、硫酸镁0.1～5份；使用前加水，调节pH值为6.4±0.2；灭菌温度为115～121℃，灭菌时间为15～30min。

本发明中，液体培养基组成为：蛋白胨5.0g，葡萄糖20.0g，酵母浸出粉2.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁0.5g，加水至1L，最终pH6.4±0.2；灭菌温度为121℃，灭菌时间为15min。

优选地，所述溶解剂的配制条件为：培养基浓度为1～2倍(基准)培养基浓度，真菌菌液添加量与培养基的体积比为1～3:100，培养温度为25～28℃，恒温震荡培养2-4天。

本发明中，选用1.5倍培养基浓度，黑曲霉菌液添加量与培养基的体积比为2:100，培养温度为28℃，恒温震荡培养3天。

优选地，所述溶解剂通过淋洗的方式施入待处理污染灰钙土，用于去除灰钙土中的Cu、Zn、Pb和Cd；收集上述溶解后的溶解废液，向废液中加入高活性的黑曲霉菌球体，进而实现对污染灰钙土和淋洗废液的一体化处理。

优选地，所述溶解剂和灰钙土按质量体积比为1g：20mL混合，180rpm水平震荡24-96h，过滤后得到溶解废液。

本发明中，菌球体与溶解废液的质量体积比为0.5g：100mL；溶解水平震荡时间为72h。

优选地，向所述溶解废液中加入真菌球体，吸附废液中重金属，其中，真菌球体与溶解废液的质量体积比为0.5g:100mL。

优选地，吸附时间为3天。

优选地，所述溶解包括单次溶解和二次溶解，二次溶解通过连续方式进行溶解。

所述溶解后的灰钙土理化性质较淋洗前有不同程度改善，生物溶解恢复了灰钙土的生态功能。

与现有技术相比本发明具有以下有益效果：

(1)本发明选用发酵产酸菌株黑曲霉作为溶解液原材料，原料易得、价格低廉、无二次污染，同时实现了黑曲霉菌球体的资源再利用和重金属污染灰钙土的有效修复，具有较强的可推广性；

(2)本发明选用原料简单、溶解剂制备过程简便，同时灰钙土溶解过程中采用较小的土液比将污染灰钙土中重金属降低至灰钙土重金属筛选值以下，降低修复成本，具有较强的可应用性；

(3)本发明溶解剂制备原材料黑曲霉所分泌的有机酸包含柠檬酸、葡萄糖酸、草酸和苹果酸，可提供大量H+和-COOH活性基团，通过酸溶和螯合作用增强重金属的解吸释放能力；黑曲霉分泌的EPS中含有大量可溶性有机质和能与重金属螯合的羟基、羧基和氨基等活性基团。它们生物降解性较好且可保持或增加灰钙土养分，具有较好的灰钙土环境友好性；

(4)本发明在所述的微生物修复方法既适用于不同种类重金属污染灰钙土的修复，也适用于不同污染程度的灰钙土修复，适用范围广。

附图说明

图1为本发明的方法原理图；

图2为不同培养基浓度和菌液投加量对重金属溶解效率的影响；

图3为黑曲霉单次和二次溶解浸出效果对比图；

图4为黑曲霉菌球体收集溶解废液重金属效率图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明为达成预定目标所采取的技术手段及功效，下面将结合附图和具体实施例介绍一种利用同一种真菌同时溶解一回收铅锌矿废液污染灰钙土中重金属的方法，其具体实施方式、特征及其效果进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

如图1所示，本发明涉及一种利用同种真菌同步溶解-回收铅锌矿废液污染灰钙土中重金属的方法，过程中主要包括了原料制备、生物溶解修复和溶解废液重金属收集三部分。

(一)原料制备

(1)灰钙土的制备

供试矿山灰钙土样本采集于甘肃省白银铅锌矿附近东大沟某冶炼废水灌溉农田(36°32’N 104°14’E)，采集深度为1-20cm。采集到的灰钙土样去除植物根系、大小石块等杂质后放于干燥通风处自然风干7天，均匀打散，充分混合后通过1毫米的筛子，装于塑料袋中保存备用。灰钙土基本属性参见表1。

表1供试灰钙土基本性质

(2)培养基的配制

称取酵母提取物5g、NaCl 10g、琼脂15g，加入水至1L，自然pH值制备得到LB固体培养基。

称取蛋白胨7.5g、葡萄糖30.0g、酵母浸出粉3.0g、磷酸氢二钾1.5g、硫酸镁0.75g，加水至1L，最终pH6.4±0.2，制备得液体培养基。

(3)溶解剂与菌球体的制备

黑曲霉菌种购买自中国医学细菌保藏管理中心，解冻至常温后，迅速用复溶液溶解菌种，吸取100uL菌液，加至已凝固的无菌固体培养基平板中，用涂布棒涂抹均匀，置于30℃恒温培养箱内培养10d。培养结束后用无菌水洗下平板上的孢子，经过滤后，在显微镜下确定其数量，并最终稀释至3.0×10

用无菌枪头吸取1～3mL孢子液于制备好的液体培养基中，置于恒温震荡培养箱中72h，过滤后上清液经紫外灭菌后得到溶解剂，过滤出的菌球体作为收集重金属的受体。

(二)生物溶解修复

分别配置1倍、1.5倍和2倍培养基，装入250mL锥形瓶中，于121℃灭菌15min，待冷却至室温后，分别加入1mL、2mL和3mL菌液恒温震荡培养72h后，经过过滤后得到不同浓度溶解剂。称取过1mm筛1.0g灰钙土于50mL离心管中，分别加入20mL上述溶解剂，在25℃、180rpm水平摇床上震荡72h，然后放入离心机，8000r运行10分钟，取上清液过滤，经一定比例稀释后用ICP-OES测定Cu、Zn、Pb和Cd的含量(参见图2)，每组实验重复三次。

由图2不同培养基浓度和菌液投加量对重金属溶解效率的影响可见，在相同培养基浓度下，2mL真菌液添加量(6.0×10

在上述实施过程的前提下，涉及重金属污染灰钙土二次生物溶解修复。

配置1.5倍培养基，装入250mL锥形瓶中，于121℃灭菌15min，待冷却至室温后，加入2mL菌液恒温震荡培养72h后，经过过滤后得到溶解剂。将上述一次溶解后的灰钙土经30℃烘干后，加入20mL上述溶解剂，在25℃、180rpm水平摇床上震荡72h。然后放入离心机，8000r运行10分钟，取上清液过滤，经一定比例稀释后用ICP-OES测定Cu、Zn、Pb和Cd的含量(参见图3)，每组实验重复三次。

由图3二次溶解浸出效果对比可见，Cu、Zn、Cd和Pb的最大溶解效率分别提高至79.84％，84.66％，81.81％和27.01％，并在72h左右达到相对平衡，二次溶解效果较单次溶解最高效率分别提升了5.80％、15.02％、14.13％和3.73％，其中Cu和Pb的溶解效率上升较小，Zn和Cd的溶解效率上升明显。因此，对灰钙土进行二次溶解对黑曲霉生物溶解修复灰钙土重金属十分必要。

(三)溶解废液重金属收集

以溶解废液为实验材料，将菌球体以浓度(干重)为5g·L

由图4黑曲霉菌球体收集溶解废液重金属效率可见，溶解废液中重金属的收集率与菌球体的添加量成正比。添加5g/L的菌球体后Cu、Zn、Pb和Cd的收集率分别达到为81.18％、86.49％、100％和97.37％，其中Cu和Zn实现了大部分的回收，Pb和Cd实现了完全回收，实现了同一种真菌对重金属污染灰钙土和溶解废液的一体化处理。

完成实验后，对淋洗前后灰钙土性质进行对比。

以溶解前后灰钙土为原材料，经风干、研磨和过筛后测定其性质。灰钙土pH和电导率以土液比为1:5，25℃恒温震荡30min后于pH计测定；灰钙土CEC采用NH

表2溶解前后灰钙土理化性质

由表2溶解前后灰钙土理化性质对比可见，黑曲霉溶解后灰钙土pH和CEC值与原始灰钙土相差不大，但黑曲霉处理后灰钙土中营养物质均有很大程度的升高，总磷、有效磷、有效钾和碱解氮分别提升了55.79％、392.61％、173.99％和27.78％。另外，由于黑曲霉分泌物有机酸内含有大量碳元素，在溶解过程中会吸附在土壤表面，因此黑曲霉溶解后土壤TOM升高了82.75％。试验结果表明，黑曲霉溶解修复后灰钙土的理化性质得到了不同程度的提升。

最后应当说明的是，以上个实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解；其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。