一种抗TSLP单克隆抗体的纯化方法
文献发布时间：2024-04-18 19:53:33
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种抗TSLP单克隆抗体的纯化方法。
背景技术
哮喘是一种由多种炎症细胞与介质参与的气道慢性炎症性疾病，这种慢性炎症与气道高反应性相关，临床表现为反复发作的喘息、气促、胸闷、咳嗽等症状。在全球范围内，大约有3亿人患有哮喘。大量研究证明约三分之二的严重哮喘表现为Th2类细胞因子过表达，TSLP是引起Th2类细胞因子过表达的重要因子。
胸腺基质淋巴细胞生成素TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)是一种针对促炎性刺激(例如肺内过敏原、病毒及其他病原体)产生的上皮细胞因子，具有增强胸腺细胞增生的作用。TSLP驱动下游T2细胞因子的释放，包括IL-4、IL-5和IL-13，导致炎症和哮喘症状。TSLP也能激活参与非T2驱动炎症的多种类型细胞。因此，TSLP在炎症级联反应的早期上游活动已被确定为在广泛哮喘患者群体中的一个潜在靶点，可用于T2炎症驱动(T2高)的哮喘及非T2炎症驱动型哮喘。此外，TSLP通过激活未成熟DC、淋巴细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞来调节免疫。TSLP通过与其特异性受体TSLPR和共同受体IL-7Rα形成复合物来启动细胞内信号传导。TSLP首先与TSLPR高亲和力结合，然后与IL-7Rα的胞外结构域形成三元复合物。TSLP的两个相对面分别与TSLPR和IL-7Rα相互作用。STAT5的激活是TSLP介导的Th2反应所必需的信号。抗TSLP的人源化单克隆抗体能够特异性地结合人TSLP并阻断其与受体复合物的相互作用，由此可能阻止由TSLP靶向的免疫细胞释放促炎性细胞因子，从而防止哮喘发作并改善哮喘控制。
目前，阿斯利康及其合作伙伴安进公司的Tezepelumab(又名AMG157)是首个靶向TSLP的单克隆抗体药物，但目前仍未上市。鉴于TSLP靶点药物在哮喘治疗上的重要性，为了满足国内外哮喘患者的需求，本发明涉及的抗TSLP人源化单克隆抗体，与Tezepelumab单抗具有相似的结合表位，这将预示着尽可能降低生产成本才能提高单克隆产品的竞争力。随着抗TSLP人源化单克隆抗体生产规模的扩大和上游发酵工艺蛋白表达量的增加，下游纯化工艺面临更高的挑战。因此，不断寻求针对抗TSLP人源化单克隆抗体的纯化工艺的创新策略，以及筛选更有效的纯化介质将越来越受到关注，提高抗TSLP人源化单克隆抗体下游纯化质量和效率取决于从细胞培养、料液收获、纯化和最终精制等一系列各种参数的筛选。目前，常规的抗体药物制备工艺一般包括三步层析法，但每一步层析结束后均需通过换液或调整缓冲液来适应下一步的纯化条件，在批量生产中，过多的中间操作步骤不仅造成时间的浪费，还会影响回收率、增加成本，而且可能面临新杂质引入的风险。同时，进口层析介质的市场垄断性的存在无形中增加了生产成本，为此，常规方法对于本发明提供的抗TSLP单克隆抗体并不适用。因此，急需开发一种能够专门适用于本发明提供的抗TSLP单克隆抗体的纯化方法。
发明内容
为了满足国内外市场需求，本发明通过对免疫文库的筛选，得到了可以与TSLP特异性结合且具有较高生物学活性的抗TSLP单克隆抗体或其抗原结合片段，同时本发明根据该单克隆抗体的特性，通过大量的实验最终提供了一种适用于本发明提供的抗TSLP单克隆抗体的纯化方法。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种抗TSLP单克隆抗体的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：
S1、亲和层析：
S11、平衡：用缓冲液B1对亲和层析柱进行平衡；
S12、上样：将含有抗TSLP单克隆抗体的细胞上清液上样至所述亲和层析柱上，上样载量按50-70mg/ml；
S13、淋洗：上样结束后，使用所述缓冲液B1进行第一次淋洗，待紫外信号平稳后，使用缓冲液B2进行第二次淋洗，直至紫外吸收值的曲线降至平稳后，停止冲洗；
S14、洗脱：淋洗结束后，使用缓冲液B3对所述亲和层析柱进行洗脱，当所述紫外吸收值上升至100mAU时开始收集蛋白溶液，当所述紫外吸收值下降至100mAU时结束收集，收集的所述蛋白溶液备用；
S2、阴离子交换层析：
S21、平衡：用缓冲液B4对阴离子层析柱进行平衡；
S22、上样：将步骤S1中收集的所述蛋白溶液上样至所述阴离子层析柱上；
S23、收集：上样结束后，再次使用所述缓冲液B4进行再平衡，当所述紫外吸收值上升至100mAU时开始收集，当所述紫外吸收值下降至100mAU时结束收集，收集的所述蛋白溶液备用；
S3、阳离子交换层析：
S31、平衡：用所述缓冲液B4对阳离子层析柱进行平衡；
S32、上样：将步骤S2中收集的所述蛋白溶液上样至所述阳离子层析柱；
S33、再平衡：上样结束后，再次使用所述缓冲液B4进行再平衡，待所述紫外吸收值平稳后，停止冲洗；
S34、洗脱：使用缓冲液B5对所述阳离子层析柱进行洗脱，当所述紫外吸收值上升至100mAU时开始收集，当所述紫外吸收值下降至100mAU时结束收集，即得到纯化后的抗TSLP单克隆抗体的蛋白溶液。
本发明提供了一种专门针对抗TSLP单克隆抗体的纯化方法，通过大量实验筛选了三步纯化法所需的条件和层析介质，有效提高抗TSLP单克隆抗体的纯化效率和回收率，同时本发明中步骤S3中阳离子交换层析的平衡条件与步骤S2中阴离子交换层析的流穿条件一致，所以阴离子交换层析收集的样品，无需处理可直接进入阳离子交换层析，中间无需进行样品处理或溶液置换，不仅大大的节约了纯化时间，而且避免了纯化过程中引入杂质，提高了纯化蛋白的纯度，具有较高的实用性。
进一步的，步骤S1中，所述抗TSLP单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括3个分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示的重链互补决定区，所述轻链可变区包括3个分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示的轻链互补决定区，所述抗TSLP单克隆抗体选自以下任意一种：
A-Ⅰ：所述重链互补决定区HCDR1包含如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR2包含如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR3包含如SEQ ID No:3所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR1包含如SEQ ID No:4所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR2包含如SEQ ID No:5所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR3包含如SEQ ID No:6所示的氨基酸序列；
A-Ⅱ：所述重链互补决定区HCDR1包含如SEQ ID No:7所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR2包含如SEQ ID No:8所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR3包含如SEQ ID No:9所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR1包含如SEQ ID No:4所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR2包含如SEQ ID No:10所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR3包含如SEQ ID No:6所示的氨基酸序列；
A-Ⅲ：所述重链互补决定区HCDR1包含如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR2包含如SEQ ID No:11所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR3包含如SEQ ID No:3所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR1包含如SEQ ID No:12所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR2包含如SEQ ID No:13所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR3包含如SEQ ID No:14所示的氨基酸序列；
A-Ⅳ：所述重链互补决定区HCDR1包含如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR2包含如SEQ ID No:11所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR3包含如SEQ ID No:3所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR1包含如SEQ ID No:12所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR2包含如SEQ ID No:15所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR3包含如SEQ ID No:16所示的氨基酸序列。
本发明通过对免疫文库的筛选得到上述4种能够与TSLP抗原高亲和力结合的单克隆抗体分子，而且结合活性较好，从而阻断其与受体复合物的相互作用，进而阻止由TSLP靶向的免疫细胞释放促炎性细胞因子，防止哮喘发作并改善哮喘控制，此外，本发明筛选得到的单克隆抗体分子还具有较高的热稳定性，满足成药条件。
进一步的，所述抗TSLP单克隆抗体为鼠源抗体分子，所述鼠源抗体分子选自以下任意一种：
MA-Ⅰ：所述重链可变区包含如SEQ ID No:17所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:18所示的氨基酸序列；
MA-Ⅱ：所述重链可变区包含如SEQ ID No:19所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:20所示的氨基酸序列；
MA-Ⅲ：所述重链可变区包含如SEQ ID No:21所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:22所示的氨基酸序列；
MA-Ⅳ：所述重链可变区包含如SEQ ID No:23所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:24所示的氨基酸序列；
优选的，所述鼠源抗体分子为MA-Ⅰ。
本发明通过用TSLP抗原免疫小鼠，优化免疫方法，创建噬菌体展示库，并筛选出上述亲和力较高，活性较好且较为稳定的鼠源抗体分子，通过大量的细胞水平实验验证，发现相对其他3个鼠源抗体分子，MA-Ⅰ具有更高的生物学活性，为此，本发明优选的选择MA-Ⅰ。
进一步的，所述鼠源抗体分子还包括选自鼠的IgG1型、IgG2a型、IgG2b型或IgG3型的重链恒定区和鼠Ck型的轻链恒定区；其中，所述IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQID No:26所示，所述IgG2a型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:27所示，所述IgG2b型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:28所示，所述IgG3型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:29所示；所述鼠Ck型的轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:25所示；
优选的，所述鼠源抗体分子包括鼠的IgG1型的重链恒定区和鼠Ck型的轻链恒定区。
进一步的，所述抗TSLP单克隆抗体为嵌合抗体分子，所述嵌合抗体分子包括所述鼠源抗体分子的重链可变区、所述鼠源抗体分子的轻链可变区和人源抗体恒定区。
嵌合抗体分子包括鼠源抗体分子的可变区序列和人源抗体恒定区，嵌合抗体分子的设计用于验证本发明恒定区人源化后没有改变CDR的特异功能，为人源化抗体分子的研究提供了进一步的研发基础。
进一步的，所述抗TSLP单克隆抗体为人源化抗体分子，所述人源化抗体分子选自以下任意一种：
HA-Ⅰ：所述重链可变区包含如SEQ ID No:34所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:35所示的氨基酸序列；
HA-Ⅱ：所述重链可变区包含如SEQ ID No:34所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:36所示的氨基酸序列；
HA-Ⅲ：所述重链可变区包含如SEQ ID No:37所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:38所示的氨基酸序列；
HA-Ⅳ：所述重链可变区包含如SEQ ID No:37所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:36所示的氨基酸序列；
优选的，所述人源化抗体分子为HA-Ⅰ。
本发明针对鼠源抗体分子进行人源化设计后筛选得到人源化抗体分子，通过体内外的实验验证发现本发明提供的4种人源化抗体分子中，HA-Ⅰ的生物学活性较高，药效最为显著，所以本发明优选HA-Ⅰ。
进一步的，所述人源化抗体分子还包括人源抗体恒定区。
进一步的，所述人源抗体恒定区包括选自人的IgG1型、IgG2型或IgG4型的重链恒定区和人Ck型的轻链恒定区，所述IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:30所示，所述IgG2型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:31所示，所述IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:32所示，所述人Ck型的轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:33所示；
优选的，所述人源抗体恒定区包括人的IgG1型的重链恒定区和人Ck型的轻链恒定区。
进一步的，所述缓冲液B1选自Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液或磷酸盐缓冲液中的一种，所述缓冲液B1的pH为7-8；所述缓冲液B2选自Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液中的一种，所述缓冲液B2的pH为5.0-5.5；所述缓冲液B3选自甘氨酸-盐酸盐、柠檬酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液中的一种，所述缓冲液B3的pH为3.4-3.6；所述缓冲液B4为醋酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液，所述缓冲液B4的pH为5-7；所述缓冲液B5为醋酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液，所述缓冲液B5的pH为5-7；
优选的，所述缓冲液B1为50mM的Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液中含有150mM NaCl，所述缓冲液B1的pH为7.4-7.8；所述缓冲液B2为50mM的醋酸盐缓冲液，所述缓冲液B2的pH为5.0；所述缓冲液B3为50mM的醋酸盐缓冲液，所述缓冲液B3的pH为3.5；所述缓冲液B4为20mM的磷酸盐缓冲液，所述缓冲液B4的pH为6；所述缓冲液B5为20mM的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液中含有80mM的NaCl，所述缓冲液B5的pH为6。
进一步的，所述亲和层析柱的介质选自MabSelect Sure LX、MabSelect PrismA、Eshmuno A或NMab pro；所述阴离子层析柱的介质为NanoGel-50Q；所述阳离子层析柱的介质为NanoGel-50SP；
优选的，所述亲和层析柱的介质NMab pro。
进一步的，步骤S1结束后，所述纯化方法还包括灭活处理：
灭活：首先，通过使用酸溶液调节步骤S1收集的所述蛋白溶液的pH值为3.4-3.8进行病毒灭活处理；其次，将所述蛋白溶液在室温下孵育1-3h，最后，病毒灭活后，用1M的Tris-HCl缓冲液将所述蛋白溶液的pH值回调至5.0-7.0；
所述酸溶液包括柠檬酸、乙酸或盐酸；
优选的，所述酸溶液为乙酸。
本发明的有益效果如下：本发明提供了一种专门针对抗TSLP单克隆抗体的纯化方法，通过亲和层析捕获目的蛋白，阴离子交换层析去除残留杂质，阳离子交换层析控制聚集体；由于本发明中步骤S3中阳离子交换层析的平衡条件与步骤S2中阴离子交换层析的流穿条件一致，所以阴离子交换层析收集的样品，无需处理可直接进入阳离子交换层析，中间无需进行样品处理或溶液置换，大大的节约了纯化时间，提高了纯化效率，最终获得质量符合要求的抗TSLP单克隆抗体；该方法相对于传统方法而言，本发明易于中试放大生产，适宜连续流工艺生产，工艺衔接顺畅，且处理量高，抗体纯度高，回收率高，减轻工作强度、降低生产成本，缩短工艺周期；
此外，本发明提供的抗TSLP单克隆抗体与TSLP抗原具有较高的结合能力，能够有效抑制TSLP抗原与其受体复合物的结合，进而阻止由TSLP靶向的免疫细胞释放促炎性细胞因子，防止哮喘发作并改善哮喘控制，此外，本发明筛选得到的单克隆抗体分子还具有较高的热稳定性，本发明筛选得到的抗TSLP单克隆抗体能够用于治疗免疫性疾病或癌症，免疫性疾病包括但不限于哮喘、慢性阻塞性肺病、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、特发性肺纤维化、过敏性皮炎；哮喘包括但不限于重度哮喘、嗜酸细胞性或非嗜酸细胞性哮喘和低嗜酸细胞哮喘；癌症包括但不限于胰腺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、结直肠癌或乳腺癌。
附图说明
图1为本发明实施例3中pScFv-Disb-HS载体的质粒图谱；
图2为本发明实施例4中梯度稀释ELISA抗TSLP噬菌体单克隆抗体相对亲和力的比较图；
图3为本发明实施例6中载体pTSE的图谱；
图4为本发明实施例6中鼠源抗体分子的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图5为本发明实施例7中鼠源抗体与TSLP的结合能力比较图；
图6为本发明实施例8中鼠源抗体与TSLP受体蛋白CRLF2的竞争抑制实验比较图；
图7为本发明实施例13中人源化抗体分子的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图8为本发明实施例14中人源化抗体分子与TSLP的结合能力比较图；
图9为本发明实施例15中人源化抗体与对照抗体的竞争抑制实验比较图；
图10为本发明实施例16中人源化抗体与不同种属的TSLP交叉结合实验图；
图11为本发明实施例17中抗TSLP单克隆抗体抑制TSLP与细胞表面受体结合实验比较图；
图12为本发明实施例18中抗TSLP单克隆抗体生物学活性检测(报告基因法)比较图；
图13为本发明实施例19中抗TSLP单克隆抗体阻断TSLP诱导mDC细胞释放趋化因子比较图；
图14为本发明实施例20抗TSLP单克隆抗体HA-1热稳定性评价图。
具体实施方式
为了更加容易理解本发明，描述实施例之前，先对本发明某些技术和科学术语作以下说明：
本文所使用的术语“抗体”，包含全抗体及其任一抗原结合片段，抗体包括鼠源抗体、人源化抗体、双特异抗体或嵌合抗体，抗体也可以是Fab、F(ab)2、Fv或ScFv(单链抗体)，抗体可以是天然存在的抗体也可以是通过改变(例如突变、缺失、置换等)的抗体。
本文所使用的术语“可变区”和“恒定区”，即为抗体重链和轻链靠近N段的序列区为可变区(V区)，靠近C段的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)，可变区包括3个互补性决定区(CDR)和4个框架区(FR)，每条轻链可变区和重链可变区均有3个CDR区和4个FR区组成，重链的3个CDR区分别通过HCDR1、HCDR2和HCDR3表示，轻链的3个CDR区分别通过LCDR1、LCDR2和LCDR3表示。
本文所使用的术语“鼠源抗体分子”，其来源是用TSLP抗原免疫注射小鼠后得到的抗体。
本文所使用的术语“嵌合抗体分子”，是将鼠源抗体的可变区与人源抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源抗体在人体内诱发的免疫应答反应。嵌合抗体是利用DNA重组技术，将鼠源单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，这样表达的抗体分子中轻重链的可变区是鼠源的，而恒定区是人源的，整个抗体分子的近2/3部分都是人源的。这样产生的抗体，减少了鼠源抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。
本文所使用的术语“人源化抗体分子”，其是将鼠源单抗的CDR移植至人源抗体可变区，替代人源抗体CDR，使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性，同时减少其异源性。
术语“CHO细胞”为中国仓鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary cell)；术语“HEK293细胞”为人胚肾293细胞(human embryonic kidney 293cell)，术语“NS0细胞”为小鼠NS0胸腺瘤细胞。
下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本发明实施例1提供了一种抗TSLP单克隆抗体的纯化方法，纯化方法包括以下步骤：
S1、亲和层析：
S11、平衡：用缓冲液B1对亲和层析柱进行平衡；
S12、上样：将含有抗TSLP单克隆抗体的细胞上清液上样至亲和层析柱上，上样载量按50-70mg/ml；
S13、淋洗：上样结束后，使用缓冲液B1进行第一次淋洗，待紫外信号平稳后，使用缓冲液B2进行第二次淋洗，直至紫外吸收值的曲线降至平稳后，停止冲洗；
S14、洗脱：淋洗结束后，使用缓冲液B3对亲和层析柱进行洗脱，当紫外吸收值上升至100mAU时开始收集蛋白溶液，当紫外吸收值下降至100mAU时结束收集，收集的蛋白溶液备用；
S2、阴离子交换层析：
S21、平衡：用缓冲液B4对阴离子层析柱进行平衡；
S22、上样：将步骤S1中收集的蛋白溶液上样至阴离子层析柱上；
S23、收集：上样结束后，再次使用缓冲液B4进行再平衡，当紫外吸收值上升至100mAU时开始收集，当紫外吸收值下降至100mAU时结束收集，收集的蛋白溶液备用；
S3、阳离子交换层析：
S31、平衡：用缓冲液B4对阳离子层析柱进行平衡；
S32、上样：将步骤S2中收集的蛋白溶液上样至阳离子层析柱；
S33、再平衡：上样结束后，再次使用缓冲液B4进行再平衡，待紫外吸收值平稳后，停止冲洗；
S34、洗脱：使用缓冲液B5对阳离子层析柱进行洗脱，当紫外吸收值上升至100mAU时开始收集，当紫外吸收值下降至100mAU时结束收集，即得到纯化后的抗TSLP单克隆抗体的蛋白溶液。
实施例2
本发明实施例2在实施例1的基础上进一步限定了抗TSLP单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括3个分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示的重链互补决定区，所述轻链可变区包括3个分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示的轻链互补决定区，所述抗TSLP单克隆抗体选自以下任意一种。
实施例3鼠源抗体分子筛选
本发明实施例3通过用TSLP抗原免疫小鼠，优化免疫方法，创建噬菌体展示库并建立抗原位点筛选方法，具体噬菌体展示库的构建与筛选鉴定如下：
步骤一：TSLP抗原免疫小鼠
1、实验动物：
种属品系：BALB/c，雌性，小鼠；
体重：18-20g；
实验动物提供商：北京华阜康生物科技股份有限公司。
2、免疫：对小鼠进行免疫，免疫抗原为人TSLP(南京金斯瑞生物科技有限公司合成基因，本公司构建载体并表达纯化)。
步骤二：噬菌体抗体库的构建
取效价较高的小鼠脾细胞，利用Trizol试剂(购买自Ambion，货号：15596026)，提取小鼠脾细胞中的总RNA，RT-PCR获得cDNA，以cDNA为模板，采用简并引物(所用简并引物参考文献：Journal of Immunological Methods 233(2000)167-177)进行PCR扩增，从而获得免疫小鼠抗体重链可变区基因库(VH)及轻链可变区基因库(VL)，轻重链分别双酶切，连接至同样分步骤酶切处理过的载体上，构建pScFv-Disb-HS-VH-VL基因库，PscFv-DisB-HS载体是采用一系列基因克隆的方法对载体pComb3载体(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)进行改造，使之用于噬菌体单链抗体库的构建和表达。改造后的载体命名pScFv-Disb-HS载体，获得其质粒图谱如图1所示，并以此载体为基础，构建小鼠免疫噬菌体抗体库。
步骤三：以TSLP为抗原包被免疫管，抗原包被量为5μg/500μl/管，4℃包被过夜，再用4％脱脂奶粉/PBST分别封闭免疫管和免疫噬菌体抗体库，室温封闭1h。封闭后的免疫噬菌体抗体库加入免疫管中进行抗原抗体结合，噬菌体投入量约为10
步骤四：将上述中和后的噬菌体感染10ml生长至对数期的TG1菌液，37℃培养箱中静置30min，取出部分菌液进行梯度稀释，涂布于2YTAG平板上，用于计算噬菌体产出量。剩余的菌液离心弃上清，将菌体沉淀重悬于少量培养基，吸出后涂布于2YTAG大平板，为下一轮筛选做准备。
步骤五：将上述感染后涂板的菌体从大平板上刮下，接菌至2YTAG液体培养基，摇至对数期后加入M13KO7辅助噬菌体超感染，在28℃条件下，220rpm培养过夜制备噬菌体，PEG/NaCl沉降纯化噬菌体用于下一轮筛选，共进行一轮噬菌体库富集筛选。
步骤六：TSLP噬菌体单链抗体阳性克隆的筛选：经过一轮筛选后，挑取分隔良好的单克隆菌落，接种于加有2YTAG液体培养基的96孔深孔板，在37℃条件下，220rpm的条件下培养至其对数生长期，每孔加入约10
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具体的，SEQ ID No:17(MA-Ⅰ的重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLEQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGLIDPSDSDTTYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLGSLTSEDSAVYYCSRSLDGYFDHWGQGTLVTVSA；
SEQ ID No:18(MA-Ⅰ的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNARTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSFYCQHHYGTPWTFGGGTKLEIK；SEQ ID No:19(MA-Ⅱ的重链可变区的氨基酸序列)：
QVKLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTTYWMHWVKQRPGQGLEWIGVIDPSDSYITYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRSLDGYFDYWGQGTLVTVSA；
SEQ ID No:20(MA-Ⅱ的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVLTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPWTFGGGTKLEIK；
SEQ ID No:21(MA-Ⅲ的重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGVIDPSDSDTTYNQKFKGKATLTVDTSSSTVYMQLSSLTSEDSAVYYCTRSLDGYFDHWGQGTLVTVSA；
SEQ ID No:22(MA-Ⅲ的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPWTFGGGTKLEIK；
SEQ ID No:23(MA-Ⅳ的重链可变区的氨基酸序列)：
QVKLEQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGVIDPSDSDTTYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRSLDGYFDHWGQGTLVTVSA；
SEQ ID No:24(MA-Ⅳ的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVITQTPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNTKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPYTFGGGTKLEIK。
实施例4梯度稀释ELISA比较抗TSLP噬菌体单克隆抗体的亲和力
将实施例3中获得的4个鼠源抗体分子(MA-Ⅰ，MA-Ⅱ，MA-Ⅲ和MA-Ⅳ)进行单克隆噬菌体的展示和纯化，然后进行噬菌体梯度稀释ELISA实验鉴定亲和力，对照抗体选择安进公司的抗TSLP单克隆抗体tezepelumab(又名AMG157，专利申请号为CN201880026131.3，专利名称为用抗TSLP抗体治疗哮喘)，具体方法如下：
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被TSLP，100ng/孔/100μl，在4℃温度条件下包被过夜，使用PBST洗涤三次，将实施例2中筛选得到的4个噬菌体单克隆抗体分别用PBST四倍梯度稀释，每孔加入100μl稀释后的样品，在室温下静置1小时。用PBST洗涤ELISA板，将PBST稀释后的HRP-anti-M13(购买自Bio-viewshine，货号：GE27-9421-01)单克隆抗体加入ELISA板中，在室温放置1h。TMB显色试剂盒显色，室温显色10分钟，用2M H
通过上述数据及如图2所示，实施例3筛选出的4个不同的鼠源抗体分子均能够与TSLP结合，但是与其他3个鼠源抗体分子及对照抗体相比，本发明提供的单克隆抗体MA-Ⅰ与TSLP具有更高的亲和力。
实施例5
本发明实施例4在实施例2的基础上进一步限定了鼠源抗体分子还包括选自鼠的IgG1型、IgG2a型、IgG2b型或IgG3型的重链恒定区和鼠C
SEQ ID No:25(鼠C
ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC；
SEQ ID No:26(鼠的IgG1型的重链恒定区氨基酸序列)：
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPG；
SEQ ID No:27(鼠的IgG2a型的重链恒定区氨基酸序列)：
AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK；
SEQ ID No:28(鼠的IgG2b型的重链恒定区氨基酸序列)：
AKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK；
SEQ ID No:29(鼠的IgG3型的重链恒定区氨基酸序列)：
ATTTAPSVYPLVPGCSDTSGSSVTLGCLVKGYFPEPVTVKWNYGALSSGVRTVSSVLQSGFYSLSSLVTVPSSTWPSQTVICNVAHPASKTELIKRIEPRIPKPSTPPGSSCPPGNILGGPSVFIFPPKPKDALMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVHVSWFVDNKEVHTAWTQPREAQYNSTFRVVSALPIQHQDWMRGKEFKCKVNNKALPAPIERTISKPKGRAQTPQVYTIPPPREQMSKKKVSLTCLVTNFFSEAISVEWERNGELEQDYKNTPPILDSDGTYFLYSKLTVDTDSWLQGEIFTCSVVHEALHNHHTQKNLSRSPELELNETCAEAQDGELDGLWTTITIFISLFLLSVCYSASVTLFKVKWIFSSVVQVKQTAIPDYRNMIGQGA。
实施例6抗TSLP鼠源抗体分子制备
本发明实施例6在实施例5的基础上优选的限定了鼠源抗体分子包括鼠的IgG1型的重链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:26所示)和鼠Ck型的轻链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:25所示)。抗体制备方法具体如下：
1、将实施例3筛选出来的4个单克隆抗体的重链VH和轻链VL的编码基因分别克隆至装有重链和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)，优选的重链恒定区为鼠的IgG1型恒定区(氨基酸序列如SEQ ID No:26所示)，轻链恒定区为鼠源C
2、瞬时转染HEK293E细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所，货号为GNHu43)，进行抗体表达，使用AKTA仪器通过protein A亲和柱纯化获得4个单克隆抗体，同时使用BCA试剂盒(购买自：北京汇天东方科技有限公司，货号：BCA0020)进行蛋白浓度测定，之后通过SDS-PAGE鉴定蛋白大小，结果如图4所示，从左侧到右侧依次为非还原MA-Ⅰ，MA-Ⅱ，MA-Ⅲ和MA-Ⅳ和蛋白质分子量Marker及还原MA-Ⅰ，MA-Ⅱ，MA-Ⅲ和MA-Ⅳ鼠源抗TSLP单克隆抗体，每条带的分子量大小与理论一致。
实施例7鼠源抗体与TSLP的结合实验
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被TSLP，100ng/孔/100μl，在4℃的温度条件下过夜包被。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入1％BSA-PBST在37℃温度条件下封闭1h，加入不同稀释浓度的MA-Ⅰ，MA-Ⅱ，MA-Ⅲ和MA-Ⅳ鼠源抗体，4种抗体的起始最高浓度均是1μg/ml，分别经过5倍梯度稀释，每个抗体共稀释8个梯度，在37℃温度条件下孵育1h。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入用1％BSA-PBST 1:2000稀释的Goat Anti-Mouse IgG-HRP(购买自solarbio，货号：SE131)，在37℃温度条件下孵育1h。TMB显色试剂盒显色，100μl/孔，室温显色8min，然后用2MH
通过上述数据及如图5所示，筛选出的4个不同的鼠源抗体均能与TSLP进行结合，此外，这4个鼠源抗体分子中MA-Ⅰ的EC50值最低，说明其与TSLP具有更好的结合能力。
实施例8鼠源抗体与TSLP受体蛋白CRLF2的竞争抑制实验
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被CRLF2-Fc，200ng/孔/100μl，在4℃的温度条件下过夜包被。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入1％BSA-PBST在37℃温度条件下封闭1h，先加入经过1％BSA-PBST稀释至10μg/ml的TSLP-His，50μl/孔，再加入不同稀释浓度的MA-Ⅰ，MA-Ⅱ，MA-Ⅲ和MA-Ⅳ鼠源抗体及对照抗体，50μl/孔，5种抗体的起始最高浓度均是400μg/ml，分别经过5倍梯度稀释，每个抗体共稀释8个梯度，在37℃温度条件下孵育2h。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入用2％BSA-PBST 1:5000稀释的Anti-His-Tag Mouse-HRP(购买自北京康为世纪生物科技有限公司，货号：CW0285)，在37℃温度条件下孵育1h。TMB显色试剂盒显色，100μl/孔，室温显色10min，然后用2MH
通过上述数据及如图6所示，筛选出的4个不同的鼠源抗体均能与受体蛋白CRLF2产生竞争，此外，本发明提供的4个鼠源抗体分子中MA-Ⅰ的IC50值最低，且明显优于对照抗体，说明其能够有效的抑制了TSLP与受体蛋白CRLF2的结合。
实施例9
本发明实施例9进一步的限定了单克隆抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体分子，嵌合抗体分子包括实施例3中鼠源抗体分子的重链可变区、鼠源抗体分子的轻链可变区和人源抗体恒定区。人源抗体恒定区包括选自人的IgG1型、IgG2型或IgG4型的重链恒定区和人Ck型的轻链恒定区，所述IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:30所示，所述IgG2型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:31所示，所述IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:32所示，所述人C
SEQ ID No:30(人的IgG1型的重链恒定区氨基酸序列)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
SEQ ID No:31(人的IgG2型的重链恒定区氨基酸序列)：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
SEQ ID No:32(人的IgG4型的重链恒定区氨基酸序列)：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK；
SEQ ID No:33(人的C
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
实施例10嵌合抗体分子抗体的制备
本发明实施例10在实施例9的基础上进一步限定了人源抗体恒定区包括人的IgG1型的重链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:30所示)和人C
具体的制备方法：
将实施例3中免疫噬菌体抗体库筛选得到的抗体分子MA-Ⅰ的重链可变区VH(SEQID No:17)和轻链可变区VL基因(SEQ ID No:18)保持鼠源序列不变，分别克隆至装有重链恒定区和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)上，重链恒定区为人的IgG1型(氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示)，轻链恒定区为人的C
实施例11鼠源抗体分子MA-Ⅰ进行人源化
首先使用实施例3中鼠源抗体分子MA-1的序列和人抗体种系数据库(v-base)比较，寻找同源性较高的人抗体轻、重链种系作为候选序列，然后将鼠源抗体分子MA-1的CDR的序列移植到人源候选序列上进行同源建模。然后通过三维结构模拟计算可能对于维持CDR环状结构起重要作用的关键框架氨基酸残基，从而设计人源化抗体的回复突变。将设计好的包含回复突变的人源化抗体的轻、重链可变区分别由南京金斯瑞生物科技有限公司优化合成，然后再连接到瞬时表达载体上，对人源化得到的轻重链组合分析，得到如下人源化抗体分子：HA-Ⅰ，HA-Ⅱ，HA-Ⅲ，HA-Ⅳ，上述筛选到的4个单克隆抗体序列如下：
具体的，SEQ ID No:34(HA-Ⅰ和HA-Ⅱ的重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGLIDPSDSDTTYNQKFKGRATLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCSRSLDGYFDHWGQGTLVTVSS；
SEQ ID No:35(HA-Ⅰ的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKSPKLLVYNARTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPWTFGGGTKVEIK；
SEQ ID No:36(HA-Ⅱ与HA-Ⅳ的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLVYNARTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPWTFGGGTKVEIK；
SEQ ID No:37(HA-Ⅲ和HA-Ⅳ的重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGLIDPSDSDTTYNQKFKGRATMTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSLDGYFDHWGQGTLVTVSS；
SEQ ID No:38(HA-Ⅲ的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLVYNARTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPWTFGGGTKVEIK。
实施例12
本发明实施例12在实施例11的基础上进一步的限定了人源化抗体分子还包括人源抗体恒定区；人源抗体恒定区包括选自人的IgG1型、IgG2型或IgG4型的重链恒定区和人C
上述人源抗体恒定区具体序列与实施例9相同。
实施例13人源化抗体分子的制备
本发明实施例13在实施例12的基础上进一步的限定了人源抗体恒定区包括人的IgG1型的重链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:30所示)和人C
将上述实施例11人源化得到的4个人源化抗体分子的重链VH和轻链VL的编码基因分别克隆至装有重链恒定区和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)，重链恒定区为人的IgG1型(氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示)，轻链恒定区为C
将对照抗体、和人源化抗体分子HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HA-Ⅳ分别瞬时转染HEK293细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所，货号为GNHu43)，进行抗体表达，使用AKTA仪器通过protein A亲和柱纯化获得单克隆抗体，同时使用BCA试剂盒(购买自：北京汇天东方科技有限公司，货号：BCA0020)进行蛋白浓度测定，之后通过SDS-PAGE鉴定蛋白大小，结果如图7所示，从左侧到右侧依次为非还原蛋白质分子量HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HA-Ⅳ、实施例10中制备的嵌合抗体CA-Ⅰ、对照抗体、非还原蛋白质分子量Marker1和还原蛋白质分子量Marker2、HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HA-Ⅳ、嵌合抗体CA-Ⅰ、对照抗体，每条带的分子量大小与理论一致。
实施例14人源化抗体分子与TSLP结合实验
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被TSLP-His，200ng/孔/100μl，在4℃的温度条件下过夜包被。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入1％BSA-PBST在37℃温度条件下封闭1h，加入不同稀释浓度的人源化抗体HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HA-Ⅳ和实施例10中制备的嵌合抗体CA-Ⅰ及对照抗体，6个抗体的起始最高浓度均是5μg/ml，分别经过5倍稀释后每个抗体均做8个梯度，在37℃温度条件下孵育1h。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入用1％BSA-PBST 1:5000稀释的Goat Anti Human IgG-HRP(购买自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZB-2304)，在37℃温度条件下孵育1h。TMB显色试剂盒显色，100μl/孔，室温显色5min，然后用2M H
通过上述数据及实验结果如图8所示，4个不同的人源化抗体分子均能与TSLP进行结合，本发明提供的4个不同的单克隆抗体的EC50值均明显低于对照抗体，说明本发明提供的单克隆抗体与TSLP的结合能力强，亲和力高，此外，从图8及上述数据中还可以得出，4个不同的单克隆抗体中HA-Ⅰ的EC50值最低，说明其与TSLP结合能力最好，亲和力最高；同时HA-Ⅰ的EC50值与嵌合抗体CA-Ⅰ相似，说明人源化后的HA-Ⅰ保留了鼠源亲本抗体MA-Ⅰ与TSLP的高亲和力。
实施例15人源化抗体与对照抗体的竞争抑制实验
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被TSLP-His，100ng/孔/100μl，在4℃的温度条件下过夜包被。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入1％BSA-PBST在37℃温度条件下封闭1h，先加入经过1％BSA-PBST稀释至4μg/ml的HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HA-Ⅳ及嵌合抗体CA-Ⅰ，50μl/孔，再加入不同稀释浓度的对照抗体，50μl/孔混合。对照抗体的起始最高浓度是400μg/ml，分别经过3倍梯度稀释，共稀释11个梯度，在37℃温度条件下孵育2h。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入用1％BSA-PBST 1:5000稀释的Anti-Human IgG1-HRP(购买自Sigma，货号：SAB4200768)，在37℃温度条件下孵育1h。TMB显色试剂盒显色，100μl/孔，室温显色10min，然后用2M H
通过上述数据及如图9所示，筛选出的4个不同的人源化抗体及嵌合抗体均能够抑制TSLP与对照抗体的结合，同时这4个人源化抗体分子中HA-Ⅰ的IC50值最低，其抑制效果最佳。
实施例16人源化抗体与不同种属的TSLP交叉结合实验
用pH9.6的碳酸盐缓冲液分别包被人TSLP-His、鼠TSLP-His(购买自义翘神州科技股份有限公司，货号：51005-M08H)、猴TSLP-His(购买自近岸蛋白质科技有限公司，货号：CR62)100ng/孔/100μl，在4℃的温度条件下过夜包被。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入1％BSA-PBST在37℃温度条件下封闭1h，加入不同稀释浓度的人源化抗体HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HA-Ⅳ，4个人源化抗体的起始最高浓度均是16μg/ml，分别经过4倍稀释后每个抗体均做8个梯度，在37℃温度条件下孵育1h。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入用1％BSA-PBST1:5000稀释的Goat Anti Human IgG-HRP，在37℃温度条件下孵育1h。TMB显色试剂盒显色，100μl/孔，室温显色5min，然后用2M H
通过上述数据及如图10所示，筛选出的4个不同的人源化抗体均能与人TSLP、食蟹猴TSLP进行结合，与鼠TSLP均无结合。此外，这4个人源化抗体分子中，HA-Ⅰ与人TSLP和食蟹猴TSLP的EC50值最低，说明其结合能力强，可在食蟹猴的实验动物模型中进行药理毒理性研究及安全性评价。
实施例17抗TSLP单克隆抗体抑制TSLP与细胞表面受体结合实验
将BaF/3-TSLPR工程细胞株消化计数，利用样品稀释液(其成分包括90％IMDM、10％FBS、300μg/ml Hygromycin)将细胞稀释至1×10
通过上述数据及如图11所示，筛选出的4个不同的人源化抗体及对照抗体均能与TSLP竞争结合细胞表面受体TSLPR。此外，这4个人源化抗体分子中HA-Ⅰ的IC50值最低且优于对照抗体，说明其在细胞水平上对TSLP与其受体的结合有较好的阻断效果。
实施例18抗TSLP单克隆抗体生物学活性检测(报告基因法)
将表达TSLPR、IL-7Rα、STAT5-Luc的BaF/3(小鼠原B细胞，购买自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，货号：3111C0001CCC000095)细胞消化计数，利用样品稀释液(其成分包括90％IMDM、10％FBS、300μg/ml Hygromycin、0.5μg/ml Puromycin和600μg/ml Geneticin)将细胞稀释至1×10
通过上述数据及如图12所示，筛选出的4个不同的人源化抗体及对照抗体均能与TSLP进行结合，且能够竞争抑制TSLP与受体复合物结合并发挥作用，阻断胞内信号通路。工程细胞株BaF/3-TSLPR-IL7Rα-STAT5-Luc的构建，可以模拟人肥大细胞在TSLP作用下的增殖反应。TSLP通过与细胞表面TSLPR和IL7Rα受体的结合，激发并上调细胞内增殖信号(STAT5-Luc)的表达。这4个人源化抗体分子能够有效阻断TSLP与细胞表面受体的结合作用，进而抑制细胞内增殖信号的发生发展。此外，这4个人源化抗体分子中HA-Ⅰ的IC50值最低且明显优于对照抗体，说明其在细胞水平上能够阻断TSLP与其受体的结合，抑制细胞增殖效果最优。
实施例19抗TSLP单克隆抗体阻断TSLP诱导mDC细胞释放趋化因子
复苏PBMC细胞，利用试剂盒分选获得mature DC细胞，使用样品稀释液(其成分包括90％1640和10％FBS)调整细胞密度至4×10
通过上述数据及图13所示，筛选出的4个不同的人源化抗体及对照抗体均可以抑制TSLP激活mDC细胞释放趋化因子TARC。此外，这4个人源化抗体分子中HA-Ⅰ的IC50值最低且明显优于对照抗体，说明其在细胞水平上能够有效抑制TSLP对mDC的激活效应，且抑制效果最好。
实施例20抗TSLP单克隆抗体HA-Ⅰ热稳定性评估
将抗TSLP单克隆抗体HA-Ⅰ超滤换液到PBS缓冲体系中，12000rpm，在4℃条件下，离心5min，使用多功能蛋白热稳定性分析系统(购买自Unchained Labs)对抗TSLP单克隆抗体HA-Ⅰ的热稳定性进行评估。通过监测蛋白内源性荧光随温度变化(从25℃开始，以0.3℃/min的升温速度升温至95℃)检测蛋白构象的变化，从而确定蛋白熔解温度Tm，评估蛋白构象稳定性。样品发生聚集时，会导致散射光波发生干涉，散射光信号增加，通过静态光散射测定蛋白的胶体稳定性(以Tagg进行表征)，结果参考如下表和附图14所示。
如上表和图14显示，抗TSLP单克隆抗体HA-Ⅰ的温度为71.7℃，平均Tagg为83.0℃，显示出较好的构象稳定性和胶体稳定性。
实施例21
本发明实施例21在上述实施例的基础上进一步限定了一种抗TSLP单克隆抗体的纯化方法，具体包括以下方法：
通过实施例13-20中选择与TSLP结合能力最高、活性最好的抗TSLP单克隆抗体HA-Ⅰ作为蛋白分子，然后进行蛋白溶液的纯化，具体步骤如下：
S1、亲和层析：
S11、平衡：用缓冲液B1对亲和层析柱进行平衡，亲和层析柱的介质选自MabSelectSure LX、MabSelect PrismA、Eshmuno A或NMab pro；缓冲液B1选自Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液或磷酸盐缓冲液中的一种，缓冲液B1的pH为7-8；
S12、上样：将含有抗TSLP单克隆抗体的细胞上清液上样至亲和层析柱上，上样载量按50-70mg/ml；
S13、淋洗：上样结束后，使用缓冲液B1进行第一次淋洗，待紫外信号平稳后，使用缓冲液B2进行第二次淋洗，直至紫外吸收值的曲线降至平稳后，停止冲洗，缓冲液B2选自Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液中的一种，缓冲液B2的pH为5.0-5.5；
S14、洗脱：淋洗结束后，使用缓冲液B3对亲和层析柱进行洗脱，当紫外吸收值上升至100mAU时开始收集蛋白溶液，当紫外吸收值下降至100mAU时结束收集，收集的所述蛋白溶液备用，缓冲液B3选自甘氨酸-盐酸盐、柠檬酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液中的一种，缓冲液B3的pH为3.4-3.6；
S2、阴离子交换层析：
S21、平衡：用缓冲液B4对阴离子层析柱进行平衡，阴离子层析柱的介质为NanoGel-50Q；缓冲液B4为醋酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液，缓冲液B4的pH为5-7；
S22、上样：将步骤S1中收集的所述蛋白溶液上样至阴离子层析柱上；
S23、收集：上样结束后，再次使用缓冲液B4进行再平衡，当紫外吸收值上升至100mAU时开始收集，当紫外吸收值下降至100mAU时结束收集，收集的蛋白溶液备用；
S3、阳离子交换层析：
S31、平衡：用缓冲液B4对阳离子层析柱进行平衡；阳离子层析柱的介质为NanoGel-50SP；
S32、上样：将步骤S2中收集的蛋白溶液上样至阳离子层析柱；
S33、再平衡：上样结束后，再次使用缓冲液B4进行再平衡，待紫外吸收值平稳后，停止冲洗；
S34、洗脱：使用缓冲液B5对阳离子层析柱进行洗脱，当紫外吸收值上升至100mAU时开始收集，当紫外吸收值下降至100mAU时结束收集，即得到纯化后的抗TSLP单克隆抗体的蛋白溶液，缓冲液B5为醋酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液，所述缓冲液B5的pH为5-7。
实施例22
本发明实施例22在上述实施例的基础上进一步限定了一种抗TSLP单克隆抗体的纯化方法，具体包括以下方法：
通过实施例13-20中选择与TSLP结合能力最高、活性最好的抗TSLP单克隆抗体HA-Ⅰ作为蛋白分子，然后进行蛋白溶液的纯化，具体步骤如下：
S1、亲和层析：
S11、平衡：用缓冲液B1对亲和层析柱进行平衡，亲和层析柱的介质为NMab pro，缓冲液B1为50mM的Tris-HCl缓冲液，Tris-HCl缓冲液中含有150mM NaCl，缓冲液B1的pH为7.6；
S12、上样：将含有抗TSLP单克隆抗体的细胞上清液上样至亲和层析柱上，上样载量按60mg/ml；
S13、淋洗：上样结束后，使用缓冲液B1进行第一次淋洗，待紫外信号平稳后，使用缓冲液B2进行第二次淋洗，直至紫外吸收值的曲线降至平稳后，停止冲洗，缓冲液B2为50mM的醋酸盐缓冲液，缓冲液B2的pH为5.0；
S14、洗脱：淋洗结束后，使用缓冲液B3对亲和层析柱进行洗脱，当紫外吸收值上升至100mAU时开始收集蛋白溶液，当紫外吸收值下降至100mAU时结束收集，收集的所述蛋白溶液备用，缓冲液B3为50mM的醋酸盐缓冲液，缓冲液B3的pH为3.5；
进一步限定了抗TSLP单克隆抗体的纯化方法的步骤S1结束后，纯化方法还包括灭活处理：
灭活：首先，通过使用酸溶液调节步骤S1收集的蛋白溶液的pH值为3.4-3.8进行病毒灭活处理；其次，将蛋白溶液在室温下孵育1-3h，最后，病毒灭活后，用1M的Tris-HCl缓冲液将蛋白溶液的pH值回调至5.0-7.0；
酸溶液包括柠檬酸、乙酸或盐酸；
S2、阴离子交换层析：
S21、平衡：用缓冲液B4对阴离子层析柱进行平衡，阴离子层析柱的介质为NanoGel-50Q；缓冲液B4为20mM的磷酸盐缓冲液，缓冲液B4的pH为6；
S22、上样：将步骤S1中收集的所述蛋白溶液上样至阴离子层析柱上；
S23、收集：上样结束后，再次使用缓冲液B4进行再平衡，当紫外吸收值上升至100mAU时开始收集，当紫外吸收值下降至100mAU时结束收集，收集的蛋白溶液备用；
S3、阳离子交换层析：
S31、平衡：用缓冲液B4对阳离子层析柱进行平衡；阳离子层析柱的介质为NanoGel-50SP；
S32、上样：将步骤S2中收集的蛋白溶液上样至阳离子层析柱；
S33、再平衡：上样结束后，再次使用缓冲液B4进行再平衡，待紫外吸收值平稳后，停止冲洗；
S34、洗脱：使用缓冲液B5对阳离子层析柱进行洗脱，当紫外吸收值上升至100mAU时开始收集，当紫外吸收值下降至100mAU时结束收集，即得到纯化后的抗TSLP单克隆抗体的蛋白溶液，缓冲液B5为20mM的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液中含有80mM的NaCl，缓冲液B5的pH为6。
实施例23
本发明实施例23在实施例22的基础上，进一步限定了抗TSLP单克隆抗体的纯化方法中，灭活处理过程中酸溶液优选为乙酸。
实施例24-25
本发明实施例24-25在实施例22的基础上，进一步限定了抗TSLP单克隆抗体的纯化方法中步骤S1的缓冲液B1，其他方法和参数与实施例22全部相同，具体如下。
实施例26-27
本发明实施例26-27在实施例22的基础上，进一步限定了抗TSLP单克隆抗体的纯化方法中步骤S1的缓冲液B3，其他方法和参数与实施例22全部相同，具体如下。
实施例28-30
本发明实施例28-30在实施例22的基础上，进一步限定了抗TSLP单克隆抗体的纯化方法中步骤S2的缓冲液B4，其他方法和参数与实施例22全部相同，具体如下。
实施例31-34
本发明实施例31-34在实施例22的基础上，进一步限定了抗TSLP单克隆抗体的纯化方法中步骤S3的缓冲液B5，其他方法和参数与实施例22全部相同，具体如下。
对照例1
本发明对照例2在实施例21的基础上，进一步限定了抗TSLP单克隆抗体的纯化方法的步骤S1中，亲和层析柱的介质为GE公司的MabSelect SuRe LX，其他方法和参数与实施例21全部相同。
对照例2
本发明对照例2提供了一种抗TSLP单克隆抗体的纯化方法，该方法在实施例21的基础上，进一步限定了亲和淋洗缓冲液B2，缓冲液B2包括50mM的Tris-HCl 500mM的NaCl，pH7.4，其他方法和参数与实施例21全部相同。
对照例3
本发明对照例3提供了一种抗TSLP单克隆抗体的纯化方法，该方法在实施例21的基础上，进一步限定了阴离子交换层析介质，更换为GE公司的Capto Q，其他方法和参数与实施例21全部相同。
对照例4
本发明对照例4提供了一种抗TSLP单克隆抗体的纯化方法，该方法在实施例21的基础上，进一步限定了阳离子交换层析介质，更换为GE公司的Capto SP，其他方法和参数与实施例21全部相同。
实验一、抗TSLP单克隆抗体的理化检测
针对本发明上述实施例和对照例提供的方法用于纯化的抗TSLP单克隆抗体，运用凝胶色谱技术手段检测蛋白纯度，分析纯化过程中样品的聚集体、单体及降解产物含量；此外，运用离子色谱技术手段，分析电荷异构体酸碱峰含量，同时，通过以下公式计算总回收率：总回收率＝亲和层析蛋白收率(％)*阴离子交换层析蛋白收率(％)*阳离子交换层析蛋白收率(％)，具体数据如下：
/>
/>
从上表可看出，本发明上述实施例提供的纯化方法纯化的抗TSLP单克隆抗体，蛋白纯度可达99％以上，同时蛋白总收率可达到85％以上；实施例22提供的纯化方法得到的蛋白溶液中，蛋白纯度及收率最高，蛋白总回收率达到90％以上，在抗体生产中该回收率可显著提高产率降低生产成本。为此，实施例22为本发明最优实施例，实施例22提供了纯化方法中最佳的缓冲液B1、缓冲液B2、缓冲液B3、缓冲液B4、缓冲液B5的成分和含量及pH值；此外，通过本发明实施例与对照例1-4相比，说明本发明亲和层析柱的介质选自MabSelectSure LX、MabSelect PrismA、Eshmuno A或NMab pro；所述阴离子层析柱的介质为NanoGel-50Q；所述阳离子层析柱的介质为NanoGel-50SP，能够有效提高蛋白回收率和蛋白纯度，同时通过实施例22可以得出，亲和层析柱的介质优选为NMab pro，蛋白回收率和纯度更高。
实验二、抗TSLP单克隆抗体的相关杂质检测
针对本发明上述实施例提供的纯化方法纯化的抗TSLP单克隆抗体，采用专用的试剂盒检测工艺相关杂质的含量。
/>
通过上述实验数据表明，实施例21照例1相比，纯化过程中使用亲和层析介质NMabPro捕获细胞培养液中的目的蛋白，与传统的亲和层析相比，具有更高的载量、更高的蛋白收率及优良的结合特异性、耐碱性及压力-流速特性，较低的配基脱落及宿主蛋白残留，显著降低成本。
实施例21对照例2相比，对照例2改变了亲和淋洗缓冲液B2，该淋洗方式可同样有效地控制HCP残留，但是容易导致亲和洗脱样品的电导值偏高，在下一步纯化中需增加对样品的稀释处理，所以本发明限定的缓冲液B2的成分和含量比较适用于抗TSLP单克隆抗体的纯化；
实施例21照例3相比，本发明阴离子交换层析选用NanoGel-50Q，不但能够有效地去除残留杂质，而且能够提高蛋白收率，高效分离酸碱异构体，提高主峰含量；而对照例3选择GE公司的Capto Q，阴离子交换层析后的残留HCP无法有效控制，显著高于实施例21，所以本发明优选NanoGel-50Q。
实施例21与对照例4相比，本发明阳离子交换层析选用NanoGel-50SP，不但能够有效地去除残留杂质及聚集体，使样品最终的纯度在99％以上，而且能够分离酸碱异构体，提高主峰含量；而对照例3选择GE公司的Capto SP，阴离子交换层析后的蛋白纯度及蛋白收率明显低于实施例21，残留HCP也显著高于实施例21，所以本发明优选NanoGel-50SP。此外，由于本发明中步骤S3中阳离子交换层析的平衡条件与步骤S2中阴离子交换层析的流穿条件一致，所以阴离子交换层析收集的样品，无需处理可直接进入阳离子交换层析，大大的节约了纯化时间，很好地衔接提高了纯化效率。
通过实施例22与其他实施例对比得知，本发明实施例22在实施例21的基础上进一步限定的缓冲液B1、缓冲液B2、缓冲液B3、缓冲液B4和缓冲液B5的成分、含量及pH，对残留HCP和残留DNA有显著地去除效果，同时去除酸性异构体，显著提高蛋白纯度，所以本发明实施例22为最佳实施例，能够比较适应于抗TSLP单克隆抗体的纯化。
实验三、抗TSLP单克隆抗体的结合活性及生物学活性检测
针对本发明上述实施例及对照例1-4提供的纯化方法纯化的抗TSLP单克隆抗体，本发明采用ELISA手段，分析纯化后的抗TSLP单克隆抗体与TSLP的特异性结合能力，以评价纯化后抗体的活性，检测结果如下：
从上表可看出，通过本发明上述实施例提供的方法纯化得到的抗TSLP单克隆抗体，结合活性及生物学活性均较好，在90％±20％范围内，说明通过大量实验条件筛选下，本发明提供的方法限定的条件纯化得到的抗TSLP单克隆抗体具有较好的生物学活性。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>北京东方百泰生物科技股份有限公司
<120>一种抗TSLP单克隆抗体的纯化方法
<160>38
<170>SIPOSequenceListing 1.0
<210>1
<211>5
<212>PRT
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>1
Ser Tyr Trp Met His
1 5
<210>2
<211>17
<212>PRT
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>2
Leu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 1015
Gly
<210>3
<211>8
<212>PRT
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>3
Ser Leu Asp Gly Tyr Phe Asp His
1 5
<210>4
<211>11
<212>PRT
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>4
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210>5
<211>7
<212>PRT
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>5
Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu
1 5
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>6
Gln His His Tyr Gly Thr Pro Trp Thr
1 5
<210>7
<211>5
<212>PRT
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>7
Thr Tyr Trp Met His
1 5
<210>8
<211>17
<212>PRT
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>8
Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Ile Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 1015
Gly
<210>9
<211>8
<212>PRT
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>9
Ser Leu Asp Gly Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210>10
<211>7
<212>PRT
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>10
Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu
1 5
<210>11
<211>17
<212>PRT
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>11
Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 1015
Gly
<210>12
<211>11
<212>PRT
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>12
Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210>13
<211>7
<212>PRT
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>13
Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp
1 5
<210>14
<211>9
<212>PRT
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>14
Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr
1 5
<210>15
<211>7
<212>PRT
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>15
Asn Thr Lys Thr Leu Ala Asp
1 5
<210>16
<211>9
<212>PRT
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>16
Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210>17
<211>117
<212>PRT
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>17
Gln Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 1015
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
202530
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
354045
Gly Leu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
505560
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65707580
Met Gln Leu Gly Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
859095
Ser Arg Ser Leu Asp Gly Tyr Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115
<210>18
<211>107
<212>PRT
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>18
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 1015
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
202530
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
354045
Tyr Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
505560
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65707580
Glu Asp Phe Gly Ser Phe Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Trp
859095
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>19
<211>117
<212>PRT
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>19
Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 1015
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
202530
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
354045
Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Ile Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
505560
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65707580
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
859095
Thr Arg Ser Leu Asp Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115
<210>20
<211>107
<212>PRT
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>20
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 1015
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
202530
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
354045
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
505560
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65707580
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Trp
859095
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>21
<211>117
<212>PRT
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>21
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 1015
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
202530
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
354045
Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
505560
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Val Tyr
65707580
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
859095
Thr Arg Ser Leu Asp Gly Tyr Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115
<210>22
<211>107
<212>PRT
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>22
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 1015
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
202530
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
354045
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
505560
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65707580
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp
859095
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>23
<211>117
<212>PRT
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>23
Gln Val Lys Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 1015
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
202530
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
354045
Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
505560
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65707580
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
859095
Thr Arg Ser Leu Asp Gly Tyr Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115
<210>24
<211>107
<212>PRT
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>24
Asp Ile Val Ile Thr Gln Thr Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 1015
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
202530
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
354045
Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
505560
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65707580
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Tyr
859095
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>25
<211>106
<212>PRT
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>25
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
1 5 1015
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
202530
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
354045
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
505560
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
65707580
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
859095
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210>26
<211>323
<212>PRT
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>26
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1 5 1015
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
202530
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
354045
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
505560
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val
65707580
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
859095
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100 105 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115 120 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
130 135 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145 150 155 160
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165 170 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
180 185 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195 200 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
210 215 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
245 250 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
260 265 270
Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275 280 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290 295 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305 310 315 320
Ser Pro Gly
<210>27
<211>330
<212>PRT
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>27
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
1 5 1015
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
202530
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
354045
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
505560
Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile
65707580
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
859095
Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
145 150 155 160
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
165 170 175
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
180 185 190
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
195 200 205
Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
210 215 220
Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
245 250 255
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
260 265 270
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
275 280 285
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
290 295 300
Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
305 310 315 320
Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
325 330
<210>28
<211>336
<212>PRT
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>28
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly
1 5 1015
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
202530
Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
354045
Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Met
505560
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val
65707580
Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Thr Val Asp Lys Lys
859095
Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu
130 135 140
Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro
145 150 155 160
Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala
165 170 175
Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg Val Val
180 185 190
Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe
195 200 205
Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr
210 215 220
Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Ile Leu
225 230 235 240
Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys
245 250 255
Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser
260 265 270
Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp
275 280 285
Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser
290 295 300
Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg His Glu Gly
305 310 315 320
Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
325 330 335
<210>29
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