一种去除红壤中胞外DNA/胞外抗生素抗性基因的方法

技术领域

本发明属于环境污染治理领域，尤其涉及一种去除红壤中胞外DNA/胞外抗生素抗性基因的方法。

背景技术

自20世纪以来，抗生素被广泛应用于畜牧业、农业、医疗卫生等领域，为人类和畜禽疾病的治疗和动植物生长的促进起着重要的作用。在畜禽养殖业中，抗生素进入动物体内，一部分会被吸收利用，但绝大部分会以代谢物的形式随粪便排出体外。抗生素在动物养殖过程中的长期使用及滥用，会让动物粪便成为抗生素和抗性基因的重要来源。

红壤是经过脱硅富铝化过程以及生物富集作用发育而成的铁铝土，生产潜力巨大。但高温、降雨等因素会导致红壤中的土壤有机质快速分解，极大地降低了红壤中的N、P、K等养分含量，使得红壤耕地产能降低。因此，农业生产中往往会向红壤中施加有机肥，以此来提高土壤肥力、改善土壤质量、增加作物产量。畜禽粪便作为有机肥施用到土壤中，会大幅度提高红壤中抗生素和抗性基因的丰度，加速环境中抗性基因在细菌间的传播和扩散，造成环境抗性传播风险。

畜禽粪便中的微生物大多来自于动物肠道。动物肠道和土壤的pH值不同，因此来源于动物肠道中的微生物无法在土壤中生存下来，导致土壤中存在大量死亡的肠道微生物。微生物死亡后通常会裂解，造成细胞质内容物的释放，这其中包括胞外抗生素抗性基因(eARGs)。我们通常会把胞内抗生素抗性基因(iARGs)和胞外抗生素抗性基因(eARGs)作为一个整体来评估抗性风险，但胞外抗生素抗性基因(eARGs)是一种潜在的抗性传播风险。它只有通过转化进入到细胞中，成为胞内抗生素抗性基因(iARGs)，才会造成真正的抗性传播风险。eDNA去除剂是一种能够去除红壤中胞外DNA(eDNA)及胞外抗生素抗性基因(eARGs)的化学试剂。该化学试剂可以降解掉红壤中的胞外DNA(eDNA)，进而阻止细胞质内容物的释放，降低红壤中胞外抗生素抗性基因的丰度，帮助我们正确认识红壤中抗生素抗性基因带来的抗性传播风险。

发明内容

针对红壤中胞外DNA/胞外抗生素抗性基因污染这一问题，本发明提供一种去除红壤中胞外DNA/胞外抗生素抗性基因的方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是：

本发明保护一种去除红壤中胞外DNA/胞外抗生素抗性基因的方法，通过eDNA去除剂，降解红壤中的胞外DNA(eDNA)以及存在于胞外DNA中的抗生素抗性基因(eARGs)，从而达到消除红壤中胞外DNA(eDNA)及胞外抗生素抗性基因(eARGs)的目的。

在具体的实施方案中，所述方法通过以下具体步骤实现：

(一)配制eDNA去除剂，待用；

(二)称取红壤，加入步骤(一)配制的eDNA去除剂，混匀；室温下静置；

其中，红壤和eDNA的质量体积比为1：0.5～1.5。

在具体的实施方案中，所述红壤和eDNA的质量体积比为1：1。在具体的实施方案中，所述的eDNA去除剂主要包括以下物质：10～30mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、5～15mM L-抗坏血酸、1～3mM五水合硫酸铜、0.2～2mM乙二胺四乙酸、0.01～0.035mM过氧化氢。

优选的，所述的eDNA去除剂主要包括以下物质：20mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、10mM L-抗坏血酸、2mM五水合硫酸铜、1mM乙二胺四乙酸、0.025mM过氧化氢。

在具体的实施方案中，所述步骤(二)中红壤可以根据实际情况过筛后再经eDNA去除剂处理。

本发明的有益效果：

(1)在eDNA去除剂的作用下，红壤中胞外DNA的去除率超过95％。

(2)eDNA去除剂不对活体细菌的胞内DNA产生影响。

(3)eDNA去除剂能够降解掉红壤中的胞外DNA(eDNA)，从而去除掉eDNA中携带的胞外抗生素抗性基因(eARGs)，降低红壤中胞外抗生素抗性基因丰度。

附图说明

图1为基于PVPP法，土壤沉淀和上清液中gfp基因拷贝数变化；

图2为不同浓度的PMA试剂对红壤胞外DNA中gfp基因拷贝数变化；

图3为红壤体系下，胞外DNA中gfp基因拷贝数变化；

图4为不同土壤体系下，胞外DNA中gfp基因拷贝数变化；

图5为红壤体系下，胞内DNA中gfp基因拷贝数变化；

图6为施用有机肥红壤中抗生素抗性基因丰度变化情况。

具体实施方法

以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。

本发明请求保护一种去除红壤中胞外DNA/胞外抗生素抗性基因的方法，通过以下步骤实现：

(一)配制eDNA去除剂，待用；

(二)称取0.3g红壤于10mL离心管中，加入3mL的eDNA去除剂，涡旋，制成土壤悬浮液；室温下，静置10min。

下文举例说明本发明优选的具体的实施方式，但本发明不限于此。

实施例1eDNA去除剂去除红壤中的胞外DNA

采集未施用任何肥料的红壤(SCon)、施用有机肥的红壤(SM)以及施用无机肥的红壤(SNPK)样本，过2mm筛，均一化处理；均质后的土壤样本称取0.3g置于10mL透明离心管中，加入10ul、携带4.3×10

结果如图3所示，经eDNA去除剂处理土壤后，gfp基因拷贝数与对照组相比显著降低，去除率在95％以上，表明eDNA去除剂能够有效地去除红壤当中的胞外DNA。

对比例1PVPP法洗脱红壤中的胞外DNA

采集红壤样本，过2mm筛，均一化处理；称取0.2g土壤于2mL透明离心管中，加入1mL0.1M的PBS缓冲液；加入10ul、携带4.3×10

结果如图1所示，土壤沉淀中的gfp基因拷贝数显著高于上清液中的gfp基因拷贝数，表明加入红壤中超过95％的外源质粒DNA被土壤吸附。与图3相比，PVPP不能有效地洗脱掉红壤中的eDNA。

表1gfp基因引物

对比例2PMA法结合红壤中的胞外DNA

称取0.3g均一后的红壤样本于10mL透明离心管中，加入3mL 0.01M的PBS缓冲液；随即加入10ul、携带4.3×10

结果如图2所示，经PMA处理的土壤中，其gfp基因拷贝数与CK相比没有显著差异。与图3相比，PMA无法有效地结合掉红壤样本中的eDNA。

对比例3eDNA去除剂对不同土壤中胞外DNA的去除效果

采集安徽(AH)、河南(HN)以及山东(SD)三地的土壤样本，过2mm筛，均一化处理；均质后的土壤样本称取0.3g置于10mL透明离心管中，加入10ul、携带4.3×10

结果如图4所示，与CK相比，经eDNA去除剂处理土壤样本中的gfp基因拷贝数没有显著降低。与eDNA去除剂能有效去除红壤中95％以上的eDNA相比，该实验表明eDNA去除剂不能有效去除安徽、山东以及河南三地土壤样本中的eDNA。

实施例2eDNA去除剂对红壤中胞内DNA的影响

采集未施用任何肥料的红壤(SCon)、施用有机肥的红壤(SM)以及施用无机肥的红壤(SNPK)样本，过2mm筛，均一化处理；8种携带gfp基因片段的菌按照培养条件培养(表2)；取等量的菌液置于2mL离心管中，无菌水洗涤3次，制成混合菌群；均质后的土壤样本称取0.3g置于10mL离心管中，加入10ul、携带3×10

结果如图5所示，经eDNA去除剂处理后，红壤胞内DNA中的gfp基因拷贝数没有显著下降，表明eDNA去除剂不对活体细菌的胞内DNA产生影响。

表2菌群信息

实施例3

一种去除红壤中胞外DNA/胞外抗生素抗性基因的方法是按下列步骤进行的：对施加有机肥30天的红壤样本进行采样，过2mm筛，均一化处理；称取均质后的土壤样本0.3g置于10mL离心管中，加入3mL无菌水/eDNA去除剂，混匀，静置10min；10000g离心2min，弃上清；加入3mL 0.1M的磷酸钠缓冲液(pH＝7.4)，充分混匀，10000g离心2min，弃上清，重复三次；用DNeasy PowerSoil Pro Kit(购自Qiagen)试剂盒提取土壤DNA；利用宏基因组测序方法，比较eDNA去除剂处理前后，红壤中抗生素抗性基因丰度(图6)及抗生素种类(表3)的变化情况。

结果如图6和表3所示，eDNA去除剂处理红壤样本后其抗生素抗性基因的丰度和种类与CK相比有明显差异，表明eDNA去除剂可以有效去除红壤中的胞外DNA以及胞外抗生素抗性基因。

表3施用有机肥红壤中抗生素种类变化情况

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围为准。