一种磺胺类抗生素污染土壤修复方法

技术领域

本发明属于污染土壤修复技术领域，更具体地说，涉及一种磺胺类抗生素污染土壤修复方法。

背景技术

作为新兴污染物，抗生素和抗生素抗性基因(ARGs)在不同环境基质中的出现引起了越来越多的关注。预计在未来十年，兽医抗生素的使用将增加67％，大约105,000t的抗生素将在中国、美国、巴西、印度和墨西哥使用。然而，动物吸收的抗生素只有10-70％，大部分残留的抗生素通过有机肥的施入进入田间土壤，对土壤和地下水造成抗生素和抗性基因污染的潜在风险。磺胺甲恶唑(SMX)是处方和使用频率最高的抗生素之一，随着SMX的广泛应用，其检出率和在土壤中的积累不断增加，这将导致某些特定微生物形成适应抗生素攻击的保护机制，如细胞核遗传物质的突变，最终产生抗生素抗性基因ARGs。ARGs可以通过基因间的垂直和水平转移复制或繁殖，然后在土壤中长期存在，极易造成土壤动物携带抗性基因的风险，并增加抗性基因通过食物链(例如用蚯蚓做养殖鱼类的饵料)进入人体的极大可能。因此，加快SMX在土壤中的降解，降低抗性基因污染的生态风险具有重要意义。

目前我国对抗生素污染土壤修复的研究尚处于初探阶段，抗生素污染土壤修复方法主要有生物降解、吸附降解和光降解等方式，生物降解是植物和微生物通过一系列代谢活动将抗生素降解或转化为其他物质，从而使污染土壤得到修复，但生物降解周期长，对生物生长的环境要求较高，这在一定程度上限制了生物修复技术的发展。利用生物炭、铁锰氧化物等吸附材料吸附降解土壤中的抗生素也是污染土壤修复的重要方法，但该方法对土壤中抗生素的去除效率较低，因此还需开发高效且可回收再利用的材料。光降解是光照射到表层土壤时形成自由基、过氧化物等强氧化性物质，促进土壤中抗生素的降解，但光降解主要发生在土壤表面，对深层土壤没有去除作用。综上所述，目前抗生素污染土壤修复方法还不完善，需要在现有生物修复技术的基础上进行探索和优化，研发更高效更绿色的修复方法。

针对上述问题也进行了相应的改进，如中国专利申请号CN201910643999.4，公开日为2019年10月11日，该专利公开了一种磺胺类抗生素污染土壤间接热脱附处理方法，将磺胺类抗生素污染土壤经预处理之后，依次进入低温热脱附窑炉和高温热脱附窑炉中，污染物经加热后蒸发或降解进入尾气，尾气经催化降解和吸附后排放，达到彻底去除土壤中污染物的效果。该专利的不足之处在于：虽不产生二次污染，但是整体依赖热源和电源，成本较高且修复效率慢。

又如中国专利申请号CN201910892252.2，公开日为2019年12月27日，该专利公开了一种磺胺类抗生素污染土壤原位微生物消解制剂及制备方法与应用。本发明通过将磺胺类抗生素降解菌液、能量供给菌菌液、磁介质菌菌液、表面活性剂和发酵培养基混合，得到混合液；发酵，得到磺胺类抗生素污染土壤原位微生物消解制剂。该专利的不足之处在于：虽能耗低和环境又好，但是整体制备成本高。

发明内容

1、要解决的问题

针对现有抗生素污染土壤修复效果差且存在二次污染的问题，本发明提供一种磺胺类抗生素污染土壤修复方法。本发明通过秸秆与蚯蚓的联合作用，避免了复杂的工艺流程和高成本的工艺材料，在提高土壤有机质及无机氮素的同时，还可短期内高效去除土壤中残留的磺胺类抗生素及其抗性基因；同时不会产生二次污染，有利于维护磺胺类抗生素污染土壤中细菌、真菌群的多样性和稳定性，并降低了蚯蚓本身参与土壤抗生素降解带来的后续食物链风险。

2、技术方案

为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。

一种磺胺类抗生素污染土壤修复方法，包括如下步骤：

S1：选取被磺胺甲恶唑抗生素污染的土壤，向土壤中添加秸秆，使得秸秆与土壤混合均匀；

S2：加入去离子水，保持土壤的含水率为20％～50％；

S3：秸秆与土壤混合8～12天后向土壤内加入蚯蚓，培养2～3个月后完成磺胺甲恶唑抗生素污染土壤的修复，在培养期间进行避光处理。

更进一步的，所述步骤S1中还包括对秸秆进行预处理：将秸秆在自然通风的条件下进行风干，风干后对秸秆进行打碎处理，得到1～3cm的秸秆碎屑，将秸秆碎屑添加至被磺胺甲恶唑抗生素污染的土壤中进行混合均匀。

更进一步的，秸秆碎屑的重量与土壤的重量之比为(1％～5％)：1。

更进一步的，步骤S1中还包括对磺胺甲恶唑抗生素污染的土壤进行预处理，预处理包括先对土壤进行清理石块和动植物残体；然后将清理后的土壤进行自然风干，自然风干后研磨过1～2mm筛。

更进一步的，所述步骤S1中将磺胺甲恶唑抗生素污染的土壤放入加仑花盆中，在加入秸秆后向土壤中添加氮素肥料调节土壤碳氮比。

更进一步的，向加仑花盆中加入蚯蚓后，用纱布包裹加仑花盆的上部。

更进一步的，所述步骤S3中蚯蚓在加入至土壤前先对蚯蚓进行排空蚯蚓肠道处理，蚯蚓选取为成熟且带环明显的威廉环毛蚓。

更进一步的，蚯蚓的数量选择原则为：1kg的土壤选择5～10条；且蚯蚓的体重为3～5g。

3、有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明通过在秸秆与被污染土壤混合一段时间后加入蚯蚓，因磺胺甲恶唑的快速降解发生在秸秆腐解初级阶段，在秸秆的作用下抗生素迅速分解成小分子化合物；但秸秆和磺胺甲恶唑进入共降解缓慢期时，引入蚯蚓可通过保持微生物活性促进秸秆腐解慢速阶段抗生素的去除；因此对蚯蚓加入的时机进行限定，避免过早接种蚯蚓对加快秸秆降解作用不大，甚至导致土壤养分降低；过晚接种蚯蚓都将导致蚯蚓无法参与秸秆后期腐解，秸秆中木质纤维素降解缓慢；通过秸秆-蚯蚓联合作用能迅速将磺胺甲恶唑去除，规避了抗性基因污染的风险；同时因为有秸秆存在，显著减少了蚯蚓肠道中sul1、sul2、sul3和int1的含量，大大降低抗性基因在蚯蚓肠道中的风险，也降低了通过食物链进入人体的风险；整个方法避免了复杂的工艺流程和高成本的工艺材料，在提高土壤有机质及无机氮素的同时，还可短期内高效去除土壤中残留的磺胺类抗生素及其抗性基因；同时不会产生二次污染，充分利用原有土著菌群，有利于维护磺胺类抗生素污染土壤中细菌、真菌群的多样性和稳定性，并降低了蚯蚓本身参与土壤抗生素降解带来的后续食物链风险；

(2)本发明通过对秸秆在自然通风条件下进行风干，保证其干燥性；同时对秸秆进行打碎处理，使其变成一定尺寸的秸秆碎屑，秸秆碎屑能够更好更全面的与污染土壤进行接触，使其充分混合均匀，保证秸秆碎屑对污染土壤的修复处理效果；且将秸秆碎屑与土壤之间的重量进行一个比例关联，避免秸秆碎屑过多造成资源浪费，秸秆碎屑过少起不到修复效果，在修复效果与经济成本之间得到了一个较好的平衡；对污染土壤进行预处理达到清除污染土壤表面杂质的效果，使其土壤表面具有较好的平整性，为后续与秸秆进行混合均匀提供保障；并且将土壤进行过筛成特定尺寸，进一步保障与秸秆碎屑进行更为充分的混合，提高修复效果的同时提高修复效率；

(3)本发明通过将污染土壤放置至加仑盆中，加仑盆耐挤压、不易变形且不易破损，有效保障污染土壤不受外界的干扰；同时加仑盆内含抗老化的添加剂，使用寿命相对较长，减少修复期间成本投入；同时加仑花盆的上部进行纱布包裹，保证透气的同时防止蚯蚓从加仑花盆中爬出影响后续修复效果；同时对蚯蚓的数量以及重量进行限定，避免造成资源的浪费，在保证修复效果的同时控制成本。

附图说明

图1为90天试验期内土壤中秸秆腐解情况示意图；

图2为90天试验期内不同处理土壤中磺胺甲恶唑浓度变化示意图；

图3(a)为90天试验期内sul1在不同处理下土壤中丰度变化示意图；

图3(b)为90天试验期内sul2在不同处理下土壤中丰度变化示意图；

图3(c)为90天试验期内sul3在不同处理下土壤中丰度变化示意图；

图3(d)为90天试验期内Int1在不同处理下土壤中丰度变化示意图；

图4为90天试验期内不同处理下土壤养分变化示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明进一步进行描述。

实施例1

一种磺胺类抗生素污染土壤修复方法，包括如下步骤：

S1：选取被磺胺甲恶唑抗生素污染的土壤，向土壤中添加秸秆，使得秸秆与土壤混合均匀；为了保证土壤的使用效果且避免土壤受到外界环境的干扰，将磺胺甲恶唑抗生素污染的土壤放入加仑花盆中，在加入秸秆后向土壤中添加氮素肥料调节土壤碳氮比；

在该S1步骤中具体的，包括对秸秆进行预处理：将秸秆在自然通风的条件下进行风干2周，风干后对秸秆用小型粉碎机进行打碎处理，得到1～3cm的秸秆碎屑，将秸秆碎屑添加至被磺胺甲恶唑抗生素污染的土壤中进行混合均匀；并且秸秆采用当年的水稻、紫云英等农作物秸秆；对秸秆进行预处理的操作则使其二者充分接触，进一步保证了秸秆与土壤的混合效果；同时该步骤中秸秆碎屑的重量与土壤的重量之比为(1％～5％)：1，避免秸秆碎屑过多造成资源浪费，秸秆碎屑过少起不到修复效果，在修复效果与经济成本之间得到了一个较好的平衡；

包括对磺胺甲恶唑抗生素污染的土壤进行预处理，预处理包括先对土壤进行清理石块和动植物残体，保证土壤内无杂质或杂物，便于后续与秸秆碎屑的混合；然后将清理后的土壤进行自然风干，自然风干后研磨过1～2mm筛；当然，具体的，磺胺甲恶唑抗生素污染的土壤制备方法如下：采集秸秆长期未还田的农田土壤，除去动植物残体、石块等杂物；自然风干研磨过1～2mm筛，称取一定量的土壤装入PVC瓶中，将制备好的浓度为10-80mg/kg磺胺甲恶唑污染液导入，放入摇瓶机翻转振荡30分钟，随机重复取样3次进行测定土壤中磺胺甲恶唑浓度，结果偏差不超过5％，使其磺胺甲恶唑污染初始浓度达到设定要求；

S2：加入去离子水，保持土壤的含水率为20％～50％；

S3：秸秆与土壤混合8～12天后向土壤内加入蚯蚓，培养2～3个月后完成磺胺甲恶唑抗生素污染土壤的修复，在培养期间进行避光处理，同时保持水分以及室温恒定；

在该S3步骤中具体的在向加仑花盆中加入蚯蚓后，用纱布包裹加仑花盆的上部，即对花盆起到包裹作用，纱布既允许与空气进行气体交换，减少水分蒸发；又能避免蚯蚓逃逸出加仑花盆外；且蚯蚓在加入至土壤前先对蚯蚓采用滤纸法进行排空蚯蚓肠道，蚯蚓选取为成熟且带环明显的威廉环毛蚓；且蚯蚓的数量选择原则为：1kg的土壤选择5～10条；且蚯蚓的体重为3～5g，避免蚯蚓数量过多造成资源的浪费，蚯蚓数量过少达不到对土壤的修复效果，在保证修复效果的同时控制经济成本。

本申请的发明人通过查阅大量文献得知添加外源有机底物形成共代谢体系是提高抗生素等药物生物降解的有效策略。通过添加有机物，提高氨氧化效率，可以提高SMX的去除率。秸秆作为肥料还施农田是目前并将继续成为我国最广泛采用的秸秆的利用途径；秸秆还田在腐解时尤其是在腐解初级阶段可为微生物提供多种易被微生物代谢利用的碳源，这可能有利于抗生素SMX通过微生物的共代谢过程被共降解。现阶段，秸秆还田还存在腐解速度慢、病害增加、加剧土壤氮素流失等问题。发明人做过大量试验与研究，其表明蚯蚓可通过自身代谢活动辅助腐解植物残体，促进土壤有机碳转化，使有机氮转化为无机氮，从而补充土壤中的速效氮肥，增加土壤中氮碳比，从而创造有利于秸秆腐解的条件。另外在生物堆肥试验中发现添加蚯蚓是加强四环素、环丙沙星、金霉素等抗生素以及相关ARGs生物降解的有效方法。因此本申请的发明人尝试建立一种秸秆-蚯蚓协同降解体系彼此扬长补短，如图1所示，磺胺甲恶唑的快速降解发生在秸秆腐解初级阶段(0-10天)，在秸秆的作用下，前6天内抗生素迅速分解为小分子化合物，磺胺甲恶唑降解率达85％，因为此阶段微生物易于利用的碳源含量丰富；而当秸秆腐解转入慢速阶段(10-90天)时，磺胺甲恶唑的降解则受到限制；因此在秸秆腐解初期完成后引入蚯蚓，构建了秸秆-蚯蚓体系；秸秆作为蚯蚓的食物使蚯蚓保持活性，另一方面蚯蚓也快速将秸秆难分解的纤维素木质素分解，转化为土壤腐殖质；蚯蚓将秸秆中有机氮转化为无机氮，显著提高了土壤有效氮的含量，避免了秸秆腐解对植物生长所需氮的争夺，也间接调节了碳氮比，更有利于秸秆的腐解；蚯蚓通过自身肠道和激发外部土壤纤维素、木质素降解菌(真菌和细菌)，促进了秸秆难降解组分的快速腐解；本发明的修复方法由秸秆提供碳源，蚯蚓消化秸秆后释放的碳源变为易被土著微生物利用，并通过蚯蚓对秸秆难降解物质的促降解，使得土壤和蚯蚓肠道中的抗生素降解菌群始终保持活跃状态，对土壤中磺胺类抗生素及抗性基因的降解去除具有快速显著的效果。与其他修复方法相比，本发明具有操作简便、环境友好、无二次污染等优点，是磺胺甲恶唑污染土壤修复的一种较好的方法，同时操作简单、普适性强，可以在多种类型的土壤中应用。还可将该方法用于农业废弃物堆肥、湿垃圾生物处理等生产过程。

为了进一步验证本申请的效果，在本实施例中做出四组处理：1、仅仅在污染土壤中添加秸秆；2、对污染土壤不做处理；3、在污染土壤中采用本申请的方法：选用水稻、紫云英等作物秸秆自然风干，用小型粉碎机将风干秸秆打碎成1～3cm左右的秸秆碎屑备用；选取成熟且带环明显的蚯蚓威廉环毛蚓，挑选一定重量的个体，排空蚯蚓肠道；称重1000g磺胺甲恶唑污染初始浓度为10-80mg/kg土壤放入1加仑花盆中，将10～50g秸秆添加到土壤表面，将两者混合均匀，添加2-3g氮素肥料调节土壤碳氮比，加入去离子水使得土壤含水率为20～50％。将挑选好的蚯蚓放到花盆中，每个容器内放5-10条。培养期间避光，保持水分60-75％恒定及室温25℃，培养2-3月后土壤中磺胺甲恶唑污染物及抗性基因完成降解；4、仅仅在污染土壤中添加蚯蚓；其他处理与环境四组均相同，对四组中土壤中SMX进行浓度测量，如图2所示，磺胺甲恶唑的快速降解发生在秸秆腐解初级阶段(0-10天)，在秸秆的作用下，前6天内抗生素迅速分解为小分子化合物，磺胺甲恶唑降解率达85％，因为此阶段微生物易于利用的碳源含量丰富；而当秸秆腐解转入慢速阶段(10-90天)时，磺胺甲恶唑的降解则受到限制。当秸秆和磺胺甲恶唑进入共降解缓慢期时(第10天后)，引入蚯蚓可通过保持微生物活性促进秸秆腐解慢速阶段抗生素的去除，到第60天时土壤中抗生素未检出；同时如图4所示，采用本申请的方法进行土壤修复时，整个培养过程土壤有机质含量波动较小。

对比例1

在本实施中采用单一施用秸秆处理土壤，其具体如下：采用恒温实验室土培的方法进行处理，将秸秆、SMX与稻田土壤共培养。保持土壤含水率30％、温度25℃，SMX在土壤中初始浓度为20mg/kg土壤，水稻秸秆添加量1％～5％。共设置4组处理，分别为①稻田土壤②抗生素污染稻田土壤不添加秸秆③稻田土壤添加秸秆④抗生素污染稻田土壤添加秸秆。遮光培养过程中在2，4，6，10，20，30，60，90天时用土壤取样器五点取样法取土样，按照土壤提取SMX的标准方法提取并用氮吹仪浓缩定容提取液，之后采用HPLC(乙腈(30％)+水(70％，含1％甲酸)，流速0.8mL/min)方法监测SMX的浓度变化，采用LC-MS-MS检测各个阶段的降解产物。

土壤中SMX的残留浓度检测方法：土壤样品取样后冷冻干燥。2g冻干土样与10mL溶液(水:甲醇＝1:1,体积比)混合，经旋涡振荡，超声和离心(均重复3次)后合并提取液，氮吹仪浓缩提取液至1mL，去离子水定容至5mL，使得甲醇含量低于5％。采用高效液相色谱与紫外检测器耦合，2707Rheodyne进样阀对SMX的浓度进行定量测试。小柱选用4.6×150mm(5μmRP C18)Gemini(Waters,USA)，洗脱流速0.8ml min

从污染土壤不添加和添加秸秆组检测结果对比可知，秸秆的添加显著加速了磺胺甲恶唑的降解，在第2天，添加秸秆组的磺胺甲恶唑浓度从20mg/kg大幅度下降到3.6mg/kg，而不添加秸秆的SMX组仅下降到13.8mg/kg。添加秸秆组在60天时检测不到磺胺甲恶唑的残留，而不加秸秆组在第60天和第90天仍能检测到1.3mg/kg和0.4mg/kg的磺胺甲恶唑残留。计算磺胺甲恶唑的降解速率，添加秸秆组降解速率(0.15mg/kgd

实施例2

在本实施中采用本申请的方法处理土壤，其具体如下：采用恒温实验室土培的方法进行，将SMX污染土壤中加入水稻秸秆后再加入蚯蚓共同培养。保持土壤含水率30％、温度25℃，SMX在土壤中初始浓度为20mg/kg土壤，秸秆添加量1％～5％，蚯蚓接种时间为第10天后，接种量为5～8条。共设置4组处理，分别为①稻田土壤②SMX污染稻田土壤添加秸秆③稻田土壤添加秸秆④SMX污染稻田土壤中同时加入秸秆和蚯蚓。遮光培养过程中在2,4,6,10,20,30,60,90天时用土壤取样器五点取样法取土样，按照土壤提取SMX的标准方法提取并用氮吹仪浓缩定容提取液，之后采用HPLC(乙腈(30％)+水(70％，含1％甲酸)，流速0.8mL/min)方法监测SMX的浓度变化，采用LC-MS-MS检测各个阶段的降解产物。

土壤中SMX的残留浓度检测方法：土壤样品取样后冷冻干燥。2g冻干土样与10mL溶液(水:甲醇＝1:1,体积比)混合，经旋涡振荡，超声和离心(均重复3次)后合并提取液，氮吹仪浓缩提取液至1mL，去离子水定容至5mL，使得甲醇含量低于5％。采用高效液相色谱与紫外检测器耦合，2707Rheodyne进样阀对SMX的浓度进行定量测试。小柱选用4.6×150mm(5μmRP C18)Gemini(Waters,USA)，洗脱流速0.8ml min

秸秆-蚯蚓共同修复磺胺甲恶唑污染土壤时，其去除效率较单独添加蚯蚓有明显的提高。在第2天，添加秸秆-蚯蚓组的磺胺甲恶唑浓度从20mg/kg大幅度下降到2.8mg/kg，残留浓度显著低于实施例1中单独添加秸秆组的3.6mg/kg和不做处理组的13.8mg/kg；其降解率为85.7％，显著高于单独添加秸秆组的81.9％和不做任何处理污染组的31.0％。60天后，秸秆-蚯蚓处理组磺胺甲恶唑降解率为99.35％，高于单独添加秸秆组的99.2％和不做处理组的96.2％。90天后，秸秆-蚯蚓处理组土壤中磺胺甲恶唑未检出，未处理组残留浓度为0.14mg/kg

实施例3

在本实施中采用本申请的方法处理土壤，其具体如下：采用恒温实验室土培的方法进行研究，将SMX与稻田土壤、秸秆共培养。保持土壤含水率30％、温度25℃，SMX在土壤中初始浓度为20mg/kg土壤，秸秆添加量1％～5％，蚯蚓接种时间为第10天后，接种量为5-8条。共设置4组处理，分别为①SMX污染稻田土壤②SMX污染稻田土壤添加秸秆③SMX污染稻田土壤添加蚯蚓④SMX污染稻田土壤添加稻秆和蚯蚓。遮光培养过程中在2,4,6,10,20,30,60,90天时用土壤取样器五点取样法取土样。在培养第10、30、60和90天时破坏性取样，并对蚯蚓进行解剖，取肠道内容物进行抗性基因的定量测定。

3个磺胺类抗药基因(sul1,sul2和sul3)，1个整合子基因(int1)和16S rRNA采用高通量定量PCR系统(WafergenSmartchip)进行检测和定量。qPCR的响应程序为：95℃预变性5min,95℃变性15s，60℃延伸30s，40个循环。ARGs的相对丰度计算为ARGs拷贝数与16SrRNA拷贝数的比值。

检测结果显示，SMX污染土壤中以int1和sul1为主污染土壤中，sul1和int1的丰度明显高于sul2和sul3；SMX污染蚯蚓肠道内容物中以int1和sul3为主。SMX组土壤中ARGs和int1的总绝对丰度在试验期间持续增加，在第90天达到7.28×10

蚯蚓是许多养殖类动物的饵料，有通过食物链进入人体的潜在风险。通过对蚯蚓肠道抗性基因检测发现，秸秆-蚯蚓联合系统与污染土壤不处理组、单一秸秆处理组相比显著降低了蚯蚓肠道中sul1、sul2、sul3和int1的含量，与未受磺胺甲恶唑污染背景土壤的蚯蚓数值接近，说明秸秆-蚯蚓联合处理可大幅度降低抗性基因在蚯蚓肠道中的风险，同时也降低了抗性基因通过食物链进入人体的风险。

本发明所述实例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前提下，本领域工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的保护范围。