一株能够降解海藻渣的溶磷马赛菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株能够降解海藻渣的溶磷马赛菌及其应用，属于土壤调理技术领域。

背景技术

我国海洋海藻资源十分丰富，有经济价值的海藻有褐藻、红藻、绿藻和少量蓝藻等大型种类。迄今为止，海藻已在食品、海洋药物、动物饲料、有机肥料、化妆品及生物能源等领域和范围体现出巨大的开发潜力和经济价值。在海藻的加工利用过程中，由于现有工艺条件的限制，海藻中的养分不能被完全提取出来，剩余的部分残留在废弃的海藻渣中。这些海藻渣除含有部分水分外，还含有海藻酸、甘露醇、甜菜碱、壳聚糖、多酚、海藻纤维、果胶、蛋白质、木质素等物质，具有丰富的营养。因此，如何将海藻渣进一步加工利用，最大程度地发挥其价值，成为人们日益关心的问题。

海藻裂解酶可通过分解藻酸盐、海藻酸、海藻多糖和海藻胶等降解海藻渣。海藻裂解酶按照产酶位置可分为胞内酶和胞外酶，按照酶切方式可分为内切酶和外切酶。海藻裂解酶来源广泛，种类多样，目前，已有接近100种海藻裂解酶从海洋细菌、陆地细菌、海洋软体动物和藻类等不同物种中被分离、鉴定、克隆和纯化出来。其中，海洋细菌是海藻裂解酶最主要的来源，海洋弧菌属(Vibrio sp.)和假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.)等从腐烂的海带中分离的细菌均能分泌海藻盐裂解酶。但是，这些来源于海洋的能分泌海藻裂解酶的细菌难以适应土壤环境，这限制了它们在农业中的应用发展。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一株溶磷马赛菌(Massilia phosphatilytica)SD-1，所述溶磷马赛菌SD-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19791，保藏日期为2020年05月09日。

所述溶磷马赛菌SD-1来源于山东省青岛市即墨区中国农业科学院烟草研究所即墨试验基地的多年植烟土壤样本，该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列进行核酸序列比对，结果显示菌株为溶磷马赛菌。

本发明还提供了一种溶磷方法，所述方法包括：将上述溶磷马赛菌SD-1接种至含有难溶性无机磷化合物的培养体系中进行培养，以将培养体系中的难溶性无机磷化合物转化为可溶性磷。溶磷作用，亦称解磷作用。是指在微生物作用下，土壤中有机磷化合物转化为磷酸盐(POT)或将土壤中难溶性磷转变为可溶性磷的过程。能增加土壤中可给性磷的含量，有利于植物生长。土壤中的溶磷(解磷)作用分酶解型及酸解型两种。前者指土壤微生物利用其酶系统对诸如核酸、卵磷脂及植素等有机磷化合物逐步降解，最终转化为磷酸盐。后者指借助某些微生物的酸性代谢产物，如各种有机酸及碳酸、硫酸或硝酸等的溶解作用，提高土壤中磷酸钙或磷灰石的溶解度。土壤中溶磷(解磷)作用的强弱主要取决于基质的种类、数量以及影响参与解磷微生物活动的生态因子，如通气、水分及土壤pH等状况。

本发明的一种实施方式中，所述培养的温度为25～40℃。

本发明还提供了一种降解海藻渣的方法，所述方法包括：将上述溶磷马赛菌SD-1接种至含有海藻渣的培养体系中进行培养，以对培养体系中的海藻渣进行降解。

本发明的一种实施方式中，所述培养的温度为25～40℃。

本发明还提供了上述溶磷马赛菌SD-1或上述溶磷方法在溶磷中的应用。

本发明还提供了上述溶磷马赛菌SD-1或上述降解海藻渣的方法在降解海藻渣中的应用。

本发明还提供了溶磷马赛菌在制备产品中的应用，其特征在于，所述产品具有如下任一所示的功能：

(a)溶磷；

和/或，(b)降解海藻渣。

本发明的一种实施方式中，所述产品包括土壤调理剂和/或生物肥料。

本发明还提供了一种产品，所述产品含有上述溶磷马赛菌SD-1。

本发明的一种实施方式中，所述产品具有如下任一所示的功能：

(a)溶磷；

和/或，(b)降解海藻渣。

本发明的一种实施方式中，所述产品包括土壤调理剂和/或生物肥料。

本发明技术方案，具有如下优点：

本发明提供了一株溶磷马赛菌(Massilia phosphatilytica)SD-1，此溶磷马赛菌SD-1的保藏编号为CGMCC No.19791。此溶磷马赛菌SD-1能够分泌多种海藻降解酶，产酶发酵时间短，并且，转化利用海藻渣能力强，能够以海藻提取后的废渣为原料，通过微生物降解的方法提取海藻渣中剩余有机营养物质以生产能够提供植物生长所需有机营养元素的生物肥料，从而为海藻渣的废物利用在农业中的应用开辟途径。同时，此溶磷马赛菌SD-1能够溶解磷矿石产生可溶性磷素以为植物生长提供所需无机营养元素，具有改良土壤的作用。另外，此溶磷马赛菌SD-1来源于农田土壤，这区别于海洋环境来源的菌株，能够直接应用于农业生产，对土壤环境具有较强的抗性和适应性。综上，此溶磷马赛菌SD-1在缓解作物抗逆、改良土壤和防治地下害虫等方面均能发挥重要的作用。

生物材料保藏

一株溶磷马赛菌(Massilia phosphatilytica)SD-1，分类学命名为Massiliaphosphatilytica，已于2020年05月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19791，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1：菌落示意图。

图2：透明圈观察结果(菌株降解能力的初步确认)。

图3：纯化菌落示意图。

图4：透明圈观察结果(菌株降解能力的再确认)。

图5：利用16S基因构建的系统进化树。

图6：管家基因的系统进化树。

图7：转录组测序韦恩图。图7中，SD-A为褐藻胶无机盐培养基所培养的菌体测得的结果，SD-G为葡萄糖无机盐培养基所培养的菌体测得的结果。

图8：转录组测序上调和下调的火山图。图8中，横坐标为基因在两组样本间表达差异的倍数变化值，即FC值。纵坐标为基因表达量变化差异的统计学检验值，即p值。p值越高则表达差异越显著，横纵坐标的数值都做了对数化处理。图中每个点代表一个特定的基因，红色点表示显著上调的基因，绿色点表示显著下调的基因，灰色点为非显著差异基因。将所有基因映射上去之后，可以获知，在左边的点为表达差异下调的基因，右边的点为表达差异上调的基因，越靠两边和上边的点表达差异越显著。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实验例1：溶磷马赛菌SD-1的获取、鉴定和保藏

具体步骤如下：

土壤采集及降解海藻酸钠菌株富集：采集山东省青岛市即墨区中国农业科学院烟草研究所即墨试验基地多年植烟土壤作为分离源样本。先将采集的土壤室温(25℃)风干过筛，去除大的石块等杂物，再取1kg土壤添加占土壤总质量1％的海藻酸钠粉末混合后放入花盆，浇足自来水，室温孵育四个星期。

菌株筛选：称取10g孵育土壤，溶于装有90mL无菌水的三角瓶内，充分震荡摇匀，得到10

菌株降解能力的初步确认：采用碘液染色法形成的透明圈，初步确定降解海藻酸钠的菌株，具体为：将1mL无菌水滴加到长有菌落的筛选平板上，利用玻璃涂布棒将菌体从筛选平板上剥离掉，滴加革兰氏碘液(购自上海生工生物工程公司，产品编号A642190)5mL，放置10min后观察透明圈大小(透明圈观察结果见图2)。

菌株的纯化和菌株降解能力的再确认：根据原始筛选平板上的透明圈大小，将对应备份筛选平板上的克隆挑取到ISP2平板(ISP2平板的配方：4g/L酵母浸粉、10g/L麦芽浸粉、4g/L葡萄糖和20g/L琼脂)上，置30℃培养箱中48小时后，挑取新长出的单克隆接种到5mL ISP2液体培养基(ISP2液体培养基配方在ISP2平板的基础上去除琼脂)内，30℃、200rpm下震荡培养24小时，得到培养液；培养过程中，观察菌株的生长情况，确认其生长良好。取5μL培养液点到筛选平板上，置30℃培养箱中培养24小时长出纯化菌落(纯化菌落见图3)后，再次通过碘液染色法检测透明圈(透明圈观察结果见图4)。对应的阳性菌株利用终浓度为20％(v/v)的甘油水溶液保存于-80℃冰箱。

16S基因鉴定试验：利用细菌通用引物16S-27F(SEQ ID NO.2：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和16S-1492R(SEQ ID NO.3：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)，对所分离菌株进行菌落PCR扩增，具体为：利用灭菌牙签蘸取菌落，放到50μL灭菌重蒸水中悬浮，得到稀释菌液；取2×Taq PCRMaster Mix 25μL、无菌水22μL、上下游引物(10μM)各1μL和上述稀释菌液1μL混合离心后，将得到的50μL PCR体系进行PCR扩增(扩增条件为：95℃预变性3min，95℃变性30second，55℃退火30second，72℃延伸1.5min，30个循环，最后72℃延伸10min)；扩增产物送交青岛擎科生物技术公司检测测序，得到所分离菌株的16SrRNA(菌株SD-1的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示)。将所分离菌株的16S rRNA在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库上进行BLAST比对分析后，再次在NZBioCloud网站(https://www.ezbiocloud.net/)上确认。从NCBI数据库下载近似菌株的16S序列，利用mega 6.0构建系统进化树(系统进化树见图5)。根据菌落大小，色泽，生长速度等特征，发现从筛选平板上鉴定到的菌株90％以上都是芽孢杆菌属，其中，菌株SD-1大约占到了富集菌株的3％。将菌株SD-1经过16S进一步比对鉴定发现，该菌与溶磷马赛菌12-OD1具有最大的相似性，达到了99.6％，所以将该菌命名为溶磷马赛菌(Massilia phosphatilytica)SD-1。将溶磷马赛菌SD-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19791，保藏日期为2023年04月27日。

实验例2：溶磷马赛菌的性能验证

实验过程如下：

基因组测序分析碳水化合物利用酶系基因实验

利用ISP2液体培养基30℃、200rpm下震荡培养溶磷马赛菌SD-1到对数生长期后，离心收集菌体送交上海美吉测序公司。构建该菌的基因组草图，发现溶磷马赛菌SD-1基因组大小为7,311,277bp，组装成92个Scaffold，GC含量为66.03％，编码6411个蛋白质，含有82个tRNA，1个rRNA。组装情况如下：框架总长Large Scaf Bases(bp)7,311,277bp，框架总数92个；大框架数目为75个，最长框架Largest Scaf Len(bp)为554,169bp；Scaf N50(bp)为316,925bp，Scaf N90(bp)为61,074bp，测序深度为219.64倍。

溶磷马赛菌SD-1的碳水化合物降解酶系分析结果为：糖苷水解酶GH家族159个，糖基转移酶72个，碳水化合物酯酶68个，具有降解木质素活性的单元有26个，碳水化合物结合域6个，另外还有15个PL家族多糖水解酶。分泌系统预测仅发现两个I型分泌系统，18个II型分泌系统，25个VI分泌系统，没有发现IIII，IV，V型分泌系统。III型分泌系统是重要的植物毒力效应子分泌系统，所以没有潜在的植物病原性。

根据全基因组测序构建系统树，通过与本地数据库对比，基于31个看家基因(dnaG、frr、infC、nusA、pgk、pyrG、rplA、rplB、rplC、rplD、rplE、rplF、rplK、rplL、rplM、rplN、rplP、rplS、rplT、rpmA、rpoB、rpsB、rpsC、rpsE、rpsI、rpsJ、rpsK、rpsM、rpsS、smpB、tsf)选择在种属水平上最接近的19株菌，通过MEGA 6.0软件选择NJ(Neighbor-Joining)法构建系统进化树(系统进化树见图6)，显示溶磷马赛菌SD-1与恶臭马赛菌亲缘关系最近。恶臭马赛菌能够产生二甲基二硫醚，能够杀灭土壤线虫、土壤病原真菌和地下害虫(参照文献Massilia putida sp.nov.,a dimethyl disulfide-producing bacterium isolatedfrom wolfram mine tailing Int J Syst Evol Microbiol.2016)，所以在防治地下病害方面，所筛选的溶磷马赛菌SD-1具有巨大的潜力。

转录组测序比较分析降解酶系实验

利用ISP2液体培养基30℃、200rpm下震荡培养溶磷马赛菌SD-1到OD

溶磷马赛菌SD-1在褐藻胶无机盐培养基和葡萄糖无机盐培养基中的转录组测序原始数据质控分析中Raw Q20和Raw Q30都分别达到了96％和90％，clean reads分别达到了2911万条和3200万条，clean bases分别达到了3910Mb和4137Mb。

溶磷马赛菌SD-1在褐藻胶无机盐培养基中的转录组测序总共得到了Total Reads数目为29111506，比对到基因组中的有28245619个，占比97.03％，独一比对率为96.25％。在葡萄糖无机盐培养基中的转录组测序总共得到了Total Reads数目为32002274个，其中有30791265个比对到了该菌株的基因组，比对率为96.22％，独一比对率为95.50％。

溶磷马赛菌SD-1基因组中的15个多糖水解酶，其中有八个在海藻酸培养基中得到了高表达。PL9家族(主要编码果胶裂解酶，外切半乳糖醛酸裂解酶，内切鼠李糖半乳糖醛酸酶，硫肽聚糖裂解酶)有三个基因高表达，分别是基因2913、2922和3351，log2FC分别到了3.25、5.45、3.16。PL5家族有基因4551(log2FC 3.58)；PL4-1家族(鼠李糖半乳糖醛酸内切酶)有基因2136(log2FC 1.76)；PL22家族(低聚半乳糖醛酸裂解酶)有基因3194(log2FC2.22)；PL18家族基因1035的表达量最高，log2FC达到了12.02，通过碳水化合物活性酶数据库CAZy数据库查询发现编码褐藻胶裂解酶的PL18家族蛋白大部分来源于海洋细菌Pseudoalteromonas和Alteromonas，这可能是海洋细菌来源的降解酶通过水平基因转移的策略转到了农田微生物体内。除了PL5家族的基因4551被预测为褐藻胶裂解酶之外，其余的基因都是推定蛋白质。

表1溶磷马赛菌SD-1中高表达多糖裂解酶系

菌株的碳源利用实验

各种单一碳水化合物的利用情况实验采用添加0.5g/L碳源放入培养基进行。碳水化合物利用实验所用培养基的配方如下：1.0g/L硝酸铵、1.0g/L磷酸二氢钾、1.0g/L磷酸氢二钾、0.2g/L七水硫酸镁、0.02g/L氯化钙、0.05g/L氯化铁、0.8g/L酵母提取物和5g/L碳源。利用接种针从筛选平板上挑取溶磷马赛菌SD-1的单个菌落接种至100mL碳水化合物利用实验所用培养基中，30℃、200rpm下震荡培养两小时候测定OD

API鉴定实验

利用接种针从筛选平板上挑取溶磷马赛菌SD-1的单个菌落至0.9％(w/v，g/100mL)灭菌生理盐水中，仔细研磨震荡，使菌体均一，按照API试剂盒使用说明书，将菌悬液充满管部或者杯部，部分小孔用矿物油覆盖以形成厌氧环境，盖上培养盒，孵育24小时。发现溶磷马赛菌SD-1能够利用乳糖、蛋白胨、淀粉、酪氨酸、吐温-20、吐温-80、果胶、羧甲基纤维素、半乳糖醛酸、酒石酸钾钠，不能利用岩藻糖、甘露醇、壳聚糖，能够利用己二酸、阿拉伯糖、葡萄糖、苹果酸、麦芽糖、甘露糖、苯乙酸、葡萄糖酸钾和柠檬酸三钠产酸，不能利用癸酸、甘露醇和N-乙酰氨基葡萄糖；硝酸盐还原和氧化酶呈阳性，而吲哚生成未发现；β-葡萄糖苷酶、蛋白酶和β-半乳糖苷酶的酶活性为阳性，而精氨酸二氢酶和脲酶的酶活性为阴性。

溶磷能力实验

利用PVK固体培养基和PVK液体培养基进行实验(PVK液体培养基参照文献“Nautiyal CS.An efficient microbiological growth medium for screeningphosphate solubilizing microorganisms.FEMS Microbiol Lett 1999；170:265-270”，配方为：10g/L葡萄糖、0.5g/L硫酸铵、0.2g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、0.1g/L七水硫酸镁、0.002g/L一水硫酸锰、0.002g/L七水硫酸铁和5g/L碱式磷酸钙，固体培养基为在液体培养基基础上，添加20g/L琼脂)。利用接种针从筛选平板上挑取溶磷马赛菌SD-1的单个菌落接种至ISP2液体培养基中，30℃、200rpm下震荡培养至OD600＝3.0，得到菌液。取菌液在PVK固体培养基划线，30℃培养箱培养48小时后，明显观察到PVK固体培养基上有菌落生成，而对照的大肠杆菌不能生长。将菌液以1％(v/v)的接种量接种至PVK液体培养基中，30℃、200rpm下震荡培养48小时后，取菌液离心(12,000g，5min)，上清液利用钼酸蓝方法(钼酸蓝方法参照文献“Murphy J,Riley JP.A modified single solution method for thedetermination of phosphate in natural waters.Anal Chim Acta1962；27:31-36”)检测可溶性磷素含量，可以检测到可溶性磷素达到40μg/L。

海藻渣降解利用试验

利用添加有2.5g/L海藻渣(干重)的无机盐铵盐培养基作为降解培养基进行实验(海藻渣由青岛明月海藻有限公司提供，含水量80％，无机盐铵盐培养基购自青岛海博生物技术公司，产品编号HB8761，无机盐铵盐培养基的配方为：磷酸二氢钾3.0g/L、七水硫酸镁0.1g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、无水氯化钙0.01g/L以及乙二胺四乙酸二钠0.01g/L)。利用接种针从筛选平板上挑取溶磷马赛菌SD-1的单个菌落接种至ISP2液体培养基中，30℃、200rpm下震荡培养至OD600＝3.0，得到菌液。将菌液以1％(v/v)的接种量接种至降解培养基中，30℃、200rpm下震荡培养一周后，取培养液40目筛子(孔径0.45mm)过滤称重，取上清液得到海藻液肥。以海藻渣培养前后的干物质减少量作为提取率的指标，计算得到溶磷马赛菌SD-1能够在一周的培养时间内降解掉95％的海藻渣。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。