一种具有创面抑菌作用的人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂及其制备方法

本发明属于药物制剂领域，涉及一种具有创面抑菌作用的重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂及其制备方法。

技术背景

碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是人体内存在的一种微量蛋白质，属成纤维细胞生长因子家族的一个成员，是一种关键的多细胞组织修复因子，对与创伤修复有关的细胞生长有显著促进作用，可以促进创面毛细血管新生，加速肉芽组织形成，加速神经纤维再生等。皮下组织（皮肤深层）90%以上的细胞均是成纤维细胞，成纤维细胞的增生也是创面愈合的核心环节。因此，其更是一种很好的皮肤深层修复因子，对来源于中胚层和外胚层的多种类型的细胞具有广泛的生物学活性。临床上，重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂是一种外用制剂，对溃疡面、创伤、组织损伤等有明显的修复作用。用于烧伤创面（包括浅Ⅱ度、深Ⅱ度、肉芽创面等）、慢性难愈合性创面（包括口腔溃疡、宫颈糜烂、残余创面、血管性溃疡、糖尿病足溃疡、褥疮等）；手术创伤（包括植皮、妇科手术、骨科、肛肠外科手术等），治疗效果显著。还可以改善组织结构和强度，减少病理性瘢痕的产生，使愈合的效果更接近于正常皮肤面。因其治疗效果显著，毒副作用极小，应用广泛。

重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂具有显著的临床治疗优势，但长年使用中也逐渐显现出一些问题和短板，如：（一）对创面的抑菌能力与感染控制的作用有限。由于人碱性成纤维细胞生长因子是一种大分子蛋白类药物，因此在与碘伏、双氧水、乙醇等常用化学消毒剂配合使用时，会发生变性并影响其生物活性。患者创面的感染控制又是临床治疗的重点，创面的微生物负荷、感染程度对愈合进程有重要影响。在促进创面愈合的同时不能有助于伤口感染的控制，是制约这类促愈合药物进一步扩大其临床应用范围的一个关键所在。（二）为防止其储存期内及多次使用中的污染变质，其制剂中往往会添加小分子的化学防腐剂，而这并不利于患者的健康。（三）因人碱性成纤维细胞生长因子的分子结构特点，其在含水制剂中的稳定性不理想，仅有18个月的保质期，降低了使用中的便利性，对其在更大范围的应用也有一定的限制。（四）人碱性成纤维细胞生长因子制剂的治疗效果依然存在提升空间。

关于问题（一）和（二）：烧烫伤、慢性难愈合及新鲜创面的潮湿环境与失活组织为各种微生物的感染和定植提供了比较适宜的环境（Tredget, E, E,等. Epidemiology ofInfections with Pseudomonas aeruginosa in Burn Patients: The Role ofHydrotherapy[J]. Clinical Infectious Diseases, 1992.）。因此创面感染是常见的并发症，严重时可引起脓毒症(sepsis)、脓毒性休克(septic shock)、多器官功能障碍综合征( multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，甚至死亡（Kwang Chear Lee, KavitaJoory, Naiem S. Moiemen. History of burns: The past, present and the future[J]. Burns & Trauma, 2014, 2(4):169-180.）。多项烧伤感染创面的动物实验研究显示，较高的微生物负荷会带来明显的创面炎症反应，显著增加模型动物的创面愈合时间（如，沈娟, 金小宝, 丁静, et al. 烧烫伤创面感染的小鼠模型构建[J]. 中国实验动物学报,2013(03):65-69.）。多项临床研究显示，在使用人碱性成纤维细胞因子进行烧伤及慢性等创面的治疗时，如果联合使用抗生素控制创面感染，能够加速愈合，获得更好的治疗效果。例如：李公英等在探究外用重组人碱性成纤维细胞生长因子联合莫匹罗星治疗烧伤患者残余创面并耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染临床疗效时发现联合采用外用重组人碱性成纤维细胞生长因子、莫匹罗星治疗，可有效杀灭感染患者创面的MRSA，显著加速创面愈合，进一步提高治疗效果。（李公英.外用重组人碱性成纤维细胞生长因子联合莫匹罗星治疗烧伤患者残余创面并MRSA感染临床研究[J]. 海峡药学, 2019, 031(001):110-111.）。潘德标、叶冠雄等人探讨联合应用重组人碱性成纤维细胞生长因子与磺胺嘧啶对慢性难愈性创面愈合过程的影响时发现重组人碱性成纤维细胞生长因子与磺胺嘧啶联合应用，相比常规处理组及单药组，明显缩短了创面愈合时间，提高了创面愈合率。（潘德标, 叶冠雄,吴成军, 等.重组人碱性成纤维细胞生长因子与磺胺嘧啶银霜联合应用对慢性难愈性创面愈合过程的修复效应[J]. 温州医科大学学报, 2014, 44(4).）。孙春沿、王丽萍等人在重组人碱性成纤维细胞生长因子与磺胺嘧啶银联合治疗烧伤的观察中发现两药联合应用于烧伤创面，充分发挥了促进组织修复、抗菌、消炎、收敛的作用，能够加速创面愈合的效果，提高愈合率，减轻患者痛苦。（孙春沿, 王丽萍. 重组人碱性成纤维细胞生长因子与磺胺嘧啶银联合治疗烧伤的观察[J]. 山西医药杂志, 2012, 03(v.41):71-71.）。这些研究无一例外地以抗生素来发挥抗感染的协同作用，均避免了bFGF与化学消毒剂的同时使用。但是，抗生素类药物有着众所周知的致耐药性、影响免疫系统、损伤肝肾等问题，一直以来在临床上都不提倡过多使用。因此，在使用人碱性成纤维细胞生长因子的同时能够顾及创面抑菌、抗感染的诉求，仍是难题所在。

鱼精蛋白是一种碱性蛋白质，主要在鱼类（如鲑鱼、鳟鱼、鲱鱼等）成熟精子中存在。鱼精蛋白一般由30~50个氨基酸组成，分子量多在3000~10000范围。全序列富含精氨酸，能溶于水和烯酸，不易溶于乙醇、丙酮等有机溶剂，稳定性好，加热不凝固。众多文献资料显示，与化学合成防腐剂相比，硫酸鱼精蛋白是一种防腐性能良好、热稳定性好、安全性极高的纯天然防腐剂。在pH值中性及碱性时具有更好的抑菌性能。在医药、食品等行业中得到了越来越广泛的应用，相关文献报道例如：鱼精蛋白对金黄色葡萄球菌生物膜干预作用的初步研究[D]. 华中农业大学, 2014. 李文茹；鱼精蛋白抑菌机理及在食品防腐中的应用[J]. 微生物学通报, 2007, 34(4):0795-0798；吴磊燕, 彭超英. 新型食品防腐剂鱼精蛋白[J]. 现代食品科技, 2006, 22(2):263-266；栾金水, 王南舟, 钟立人, et al. 鲑鱼鱼精蛋白对食品防腐特性的研究[J]. 天然产物研究与开发, 2000, 12(3)；娄凡丽. 钟立人, 吕民主, 张合文, et al. 鱼精蛋白的抑菌机理[J]. 水产学报, 2001, 25(2)等。硫酸鱼精蛋白还是药典收载的一种药用辅料，在双时相胰岛素类产品中，其在适宜的条件下通过电荷作用能够与胰岛素分子形成共结晶，进而带来缓释的效果，这方面的使用浓度在0.2~0.4mg/ml。其本身也是一种促凝药物，用于中和肝素的抗凝作用或自发性出血的治疗。其静脉注射的单次给药剂量可达50~100mg/次，具备很高的安全性。多年的广泛临床应用也证明了其安全性。鱼精蛋白在人体中经代谢成为人体必需的氨基酸，常规使用的剂量下无毒副作用。是抑菌性能好、安全性很高的纯天然分子，能够在bFGF储存阶段及多次使用时取代化学防腐剂，也具备了在治疗阶段发挥协同抑菌、抗感染作用的可能性。

关于问题（三）和（四），人碱性成纤维细胞生长因子只有在单体状态下才具备生物活性，其肽链上含有4个半胱氨酸残基，分别位于第34、78、96和101位，其中78位、96位的半胱氨酸不形成二硫键，以游离的形式存在。当bFGF单体之间趋近时，会通过游离的半胱氨酸发生分子间的结合，形成多聚体而丧失活性，这是bFGF在含水介质中稳定性较差的主要原因所在，而这也得到了实验证实。有研究者定点突变获得了78、96位为Ser的突变体，其具有与天然bFGF相同的空间结构和促有丝分裂活性，但却不易形成多聚体（Fox G M ,Schiffer S G , Rohde M F , et al. Production, biological activity, andstructure of recombinant basic fibroblast growth factor and an analog withcysteine replaced by serine[J]. Journal of Biological Chemistry, 1988, 263(34):18452-8.）。另外，蛋白质类分子共有的在含水介质易降解的特性，也是影响其稳定性的一个重要原因。凝胶剂中的卡波姆虽然以交联网格状存在，但无法彻底阻止bFGF分子在介质中的迁移、聚集，也无法对蛋白质分子的自降解形成足够的保护。

重组人碱性成纤维细胞生长因子为一条分子量约为17KD的单链蛋白，活性功能部位主要集中于C端146氨基酸区域，包括肝素结合区和FGF受体结合区两部分。其整体呈碱性，结构中富含大量碱性氨基酸残基，如肝素结合区包括一个N-末端(Lys27-Arg31)和两个C-末端(Arg16l-Lys119)、(Lys128-Lys138)的富含碱性氨基酸区域。这些带有正电荷的碱性氨基酸残基与带有负电荷的肝素结合区相结合发挥作用（Heath W F , Cantrell A S ,Mayne N G , et al. Mutations in the heparin-binding domains of human basicfibroblast growth factor alter its biological activity.[J]. Biochemistry,1991, 30(22):5608.）。bFGF虽然也为碱性蛋白质，但其结构中也存在非碱性氨基酸富集区域，如N端富含Ser、Gly和Pro的1~17位暴露区域。因此依然可以与全序列富含碱性氨基酸的鱼精蛋白，在适宜的条件下通过电荷作用形成弱的可逆分离的复合物。由于bFGF的肝素结合区富含带正电的碱性氨基酸残基，所以鱼精蛋白不会与bFGF的功能位点发生结合而影响其活性。基于上述结构特点，鱼精蛋白有可能成为一种人碱性成纤维细胞生长因子的良好保护剂。专利CN102357242B中使用人血白蛋白作为重组牛碱性成纤维细胞生长因子的蛋白保护剂，但人血白蛋白不具有抑菌功能，也不具备与bFGF可逆结合的分子构象。而鱼精蛋白与bFGF之间可逆的弱结合作用，使其在作为保护剂使用时可能会获得更好的包合作用，进而更好地限制bFGF单体在含水介质中的迁移，使其无法发生形成聚合体而失活，并且还能起到抑菌的双重功效。

然而，bFGF和其他FGF一样，是通过双受体系统介导其生物学活性的，其受体分为酪氨酸激酶受体(FGFR)s和肝素硫酸蛋白多糖(HSPG)两部分，bFGF与肝素结合为复合物后再作用于细胞膜上的(FGFR)s才能发挥其全效的生物活性（郑莉,柳川,王会信.成纤维细胞生长因子双受体系统.生物化学与生物物理学进展1998,25:122-125.）。如果没有肝素或硫酸肝素的协助，其与FGFR的结合力会有明显降低。另外，结合有肝素的bFGF不易降解，从而延长了其半衰期与作用时间。鱼精蛋白同样会与肝素结合而产生竞争性抑制，降低bFGF的生物活性。因此，需要针对性的设计来降低鱼精蛋白对bFGF活性配体-肝素的竞争结合作用。如，开发与bFGF结合力相对更强的类肝素分子并将之预先与bFGF结合为复合物，以更好地抵御鱼精蛋白的影响。肝素分子结构的主要特征是氨基葡萄糖和艾杜糖醛酸通过（1→4）糖苷键连接的二糖单元的重复贯连；而bFGF与肝素分子的结合为一个N-末端(Lys27-Arg31)和两个C-末端(Arg16l-Lys119)、(Lys128-Lys138) 的富含碱性氨基酸区域，其结合面的空间又是较小的。因此，推测截短的类肝素分子或小分子肝素应当也可以与bFGF结合为配体，促使其完全活性的产生。S.Faham, R.E. Hileman等人对肝素进行消化并纯化后获得了长度均一的肝素片段，研究显示这样的肝素片段不但能够与bFGF结合形成复合物，还能获得与完整肝素分子相当的促bFGF活性作用（S. Faham,R. E. Hileman,J. R. Fromm,R. J. Linhardt,D. C. Rees. Heparin Structure and Interactions with BasicFibroblast Growth Factor[J]. Science,1996,271(5252).）。他们还通过晶体结构分析，认为肝素分子上沿着螺旋轴的八个糖残基大致是与bFGF的结合宽度，约为34埃，因此理论上一个肝素分子上可以结合不止一个bFGF分子。据此，我们推测更短的肝素分子片段在与bFGF结合后会增加鱼精蛋白的结合难度，进而避免竞争性抑制的产生。并且这样的复合物也能够促进bFGF与(FGFR)s的结合，具有与完整肝素相当的促bFGF活性作用。

bFGF为碱性蛋白质，等电点约为9.6-9.8，对胰蛋白酶、糜蛋白酶和丝氨酸蛋白酶等敏感。实验显示，bFGF在-70℃可以保存几年，4℃中仅可以保存1周，60℃处理1min即可使之失活，可见温度对bFGF的稳定性影响非常之大。人类创面患处的温度一般在37℃左右，这一温度下bFGF敏感的各种蛋白酶的活性也往往最高，不利于bFGF分子的稳定性；创面部位是白细胞、中性粒细胞、肥大细胞等免疫细胞的聚集地，这些免疫细胞又会分泌更大量的蛋白酶，而这对于bFGF在治疗阶段的稳定性显然会更加不利；每克凝胶剂中的人碱性成纤维细胞生长因子一般在3~15μg，低剂量药品的属性会更进一步放大患处蛋白酶的攻击为其疗效带来的负面影响。而bFGF虽然是一种低剂量药物，但在使用时也需保证一定的浓度，才可以发挥最佳疗效。王小兵等人开展的重组人碱性成纤维细胞生长因子对离体人表皮细胞增殖的影响研究中发现，bFGF在1~100ng/ml时，对体外培养的人表皮细胞有明显的促增生作用，在100ng/ml时达到最佳效果，随着bFGF浓度的继续增加，促增殖作用又会有所下降（王小兵, 王晓健, 张宝林. 不同浓度的重组人碱性成纤维细胞生长因子对离体人表皮细胞增殖的影响[J]. 中国药物与临床, 2008, 8(012):969-970.）。综上可见，bFGF在创面环境的稳定性与剂量维持是进一步提高其疗效的关键所在。

有研究显示，游离bFGF对雪旺细胞促分裂增殖作用效应期短，而聚乙二醇bFGF缓释微球制剂能在较长时期内促进雪旺细胞的分裂增殖（Perrone L , Peluso G , MeloneM A . RAGE recycles at the plasma membrane in S100B secretory vesicles andpromotes Schwann cells morphological changes[J]. Journal of CellularPhysiology, 2010, 217(1):60-71.）；也有研究显示采用复乳法优化处方制备的bFGF-聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球，在关节液内可持续稳定释放bFGF长达10天以上（胡隽宇, 段宏, 邹远文, 等.缓释碱性成纤维细胞生长因子微球在兔膝关节液中的降解和释药性质[J] .中国组织工程研究和临床康复, 2008, 12(23):4401 -4405.），但是微球制剂仅能够起到缓释的作用，却不能给已释放的游离人碱性成纤维细胞生长因子予以保护，并且微球缓释制剂也不适用于创面患处。而同为碱性蛋白的鱼精蛋白在制剂中的含量远高于bFGF时，便可于创面微环境中形成背景保护，屏蔽各种蛋白酶对bFGF的攻击，进而延长游离bFGF的作用时间。肝素片段与bFGF的结合也会形成阻隔效应，使bFGF不易被降解，有助于其药物浓度的维持与半衰期的提高（B, Boilly, and, et al. FGF signals for cellproliferation and migration through different pathways[J]. Cytokine & GrowthFactor Reviews, 2000.）。这些都将有助于人碱性成纤维细胞因子凝胶剂治疗效果的提升。此外，创面愈合大致分为三个过程：1、局部炎症反应阶段；2、细胞增殖分化阶段；3、组织塑形重建阶段。前两个阶段是影响愈合周期的关键所在。阶段1中患处血液的凝固是一个关键所在，阶段2中成纤维细胞增生与血管发生则是重点所在。而鱼精蛋白可能带来的创面促凝血作用，协同bFGF的促成纤维细胞增生作用，也可能进一步提升人碱性成纤维细胞因子凝胶的治疗效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂。通过大量文献、技术资料调研与针对性的设计、研究，本发明人开发的重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂解决了现有技术存在的问题，诸如，储存期限短、于创面无法同时发挥促愈及抗菌作用、产品含一定的化学防腐剂等。并获得了更优的治疗效果。

首先，为实现重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂在加速创面愈合的同时发挥抑菌功能的目的，对乙醇、碘伏、苯酚、洁尔灭、苯扎溴铵、对氯间二甲苯酚、三氯叔丁醇等具有消毒功能的化学物质进行了大量配伍筛选。实验结果显示绝大多数的小分子化学抑菌剂或对人碱性成纤维细胞生长因子的生物活性有影响，或对凝胶剂的性状有影响，均无法与人碱性成纤维细胞生长因子实现协同使用。对氯间二甲苯酚对碱性成纤维细胞生长因子活性的影响相对较小，但其抑菌时长较短，且长期使用对人体具有一定的毒副作用，也易产生耐药菌，因此弃选。抗生素的使用易引发耐药性，临床上提倡减少使用，故未在本研究中予以考虑。进一步扩大研究范围后，惊喜地发现与人碱性成纤维细胞生长因子同属碱性蛋白质的鱼精蛋白与多聚赖氨酸，对bFGF生物活性的影响相对较小，且在一定的剂量下于创面能够产生足够的抑菌、防感染作用，对凝胶的性状也无负面影响。除此之外再难找到次优选项。

随后，通过试验摸索确认了制剂中的鱼精蛋白在0.1~50mg/g的用量范围时具有非常好的抑菌性能，对于金黄色葡萄球菌（26003）、大肠埃希菌（44102）、铜绿假单胞菌（10104）、白色念珠菌（98001）等有很好的杀灭效力，对于黑曲霉（99003）也有一定的抑制作用。其表现符合药典中的A级标准。而且，因为鱼精蛋白的分子量较大，普遍在3000~10000之间，不易扩散，有利于其在创面的留存时间，发挥长效抗菌作用。以不含鱼精蛋白的人碱性成纤维细胞因子凝胶剂为参照进行了含有鱼精蛋白的人碱性成纤维细胞因子凝胶剂于创面的抗感染能力考察，将两种制剂分别施涂于随机分组的Sprague Dawley（SD）大鼠烧伤感染模型的创面，作用一定时间后，取样皮肤组织进行微生物负荷的检测。实验结果显示，鱼精蛋白在大鼠创面也能够对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等微生物产生良好的抑制与杀灭作用。因此，鱼精蛋白的引入可以在产品储存阶段发挥足够的防腐作用，使人碱性成纤维细胞因子凝胶剂产品中移除了小分子化学防腐剂成分-如对羟基苯甲酸乙酯等。在治疗阶段，可长时间停留于创面对多类微生物发挥长效的抑菌作用，降低微生物负荷，与人碱性成纤维细胞生长因子形成协同作用，有助创面的更好康复。这在以SD大鼠建立的烧伤感染动物模型的创面治疗实验中得到了证实。

人碱性成纤维细胞生长因子只有在单体状态下才具备生物活性，其中78位、96位的半胱氨酸不形成二硫键，以游离的形式存在。在含水介质中易通过游离的半胱氨酸发生分子间的聚合而导致生物活性的丧失，富水环境中其自身也易发生降解导致失活。凝胶剂中的卡波姆虽然以交联网格状存在，但无法彻底阻止bFGF分子在介质中的迁移、聚集，也无法对蛋白质分子的自降解形成保护。bFGF虽然也为碱性蛋白质，但是其序列上存在非碱性氨基酸富集区，如N端富含Ser、Gly和Pro的1~17位暴露区域。因此，其依然可以与全序列富含碱性氨基酸的鱼精蛋白，在适宜的条件下形成可逆分离的复合物。基于Balb/c 3T3细胞株的体外生物活性测试确认了二者的结合强度相对较弱，而这种弱结合恰有利于药物活性分子bFGF在使用时的释放，实验结果也显示鱼精蛋白的存在仅会造成bFGF释药曲线的小幅右移，不构成实质性影响。研究中进一步增大鱼精蛋白的用量，使其形成对bGFG分子的包合，可显著增强人碱性成纤维细胞生长因子在含水介质中的稳定性。其原因在于该包合作用，可以更好地限制bFGF单体在含水介质中的迁移，使其无法形成聚合体而失活，同时其空间遮蔽与锁定作用，也使bFGF分子不易发生自身降解。也因此，随后的加速稳定性试验与长期稳定性试验中，均显示本发明所提供的重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂的储存期限可达30个月，明显优于当前同类产品的18个月。

然而，在进一步的深入研究中，却发现鱼精蛋白的存在对于人碱性成纤维细胞生长因子的生物活性存在一定的下调作用，对治疗效果会产生一定的负面作用。经过系深入的试验研究与分析后，发现了导致该问题的原因所在。人碱性成纤维细胞生长因子的活性部位主要集中于C端146氨基酸区域，包括结合位点、肝素结合位点以及同源二聚化位点。在人体内bFGF首先与肝素结合形成复合物，再进一步与细胞膜上(FGFR)s（即bFGF的受体）的胞外区结合，启动胞内区酪氨酸激酶的活化，经一些列胞内信号传导后，发挥bFGF的促增殖活性。而当bFGF没有与肝素结合形成复合物时，其也能够与(FGFR)s结合发挥生物活性，但结合力会有所降低，进而导致活性的降低。同时没有结合肝素的bFGF也更易发生降解，从而缩短了其半衰期，影响治疗效果。而bFGF分子结构中与肝素结合区域的特征正是富含大量的碱性氨基酸。因此，鱼精蛋白的存在会竞争性地结合肝素，拮抗bFGF与肝素分子的结合。针对这一难题，进行了更进一步的研究与再开发。通过文献调研与体外实验摸索，发现事先将bFGF和经消化与纯化获得的肝素片段或低分子肝素孵育形成复合物后，会明显降低鱼精蛋白对于类肝素分子的竞争性结合。而随着类肝素分子的糖链长度与分子量的降低，鱼精蛋白竞争性结合的亲和力会有更近一步的下降。基于BIACORE的体外亲和力研究显示，鱼精蛋白对于低分子肝素（如Enoxaparin）与bFGF组成的复合物的亲和力，明显低于普通肝素（UFH）与bFGF组成的复合物，更是远低于对于肝素单体的亲和力。而鱼精蛋白对于分子量在3500Da以下的肝素片段与bFGF组成的复合物的亲和力，则略低于低分子肝素（LMWH）与bFGF组成的复合物的亲和力。因此，率先将bFGF与LMWH或肝素片段（分子量低于3500Da）共同孵育形成复合物后，即便体系中有鱼精蛋白的存在也很难将bFGF竞争置换下来。

之后，将bFGF分别与Enoxaparin、分子量小于3500Da的肝素片段孵育结合后再以Balb/c 3T3细胞株进行活性测试发现，其活性保留很高，与常规检测方法下bFGF单体的活性结果无显著差异。说明bFGF与LMWH/肝素片段形成复合物后，在其协同作用下也基本上能发挥完全的生物活性。因此，将凝胶剂的制备工艺程序设计为先将bFGF与LMWH/肝素片段于5~45℃共同孵育形成一级复合物，再将之与鱼精蛋白进行共混，使发生可逆的弱结合包合，形成二级复合物。如是，在给药于患处后，二级复合物扩散于体液后，在体液的稀释作用下，由于结合力的差异，弱包合的鱼精蛋白与一级复合物发生解离，解除包合作用。使bFGF与LMWH/肝素片段的一级复合物释放于病灶，发挥促愈合的生物活性，而解离后的鱼精蛋白则在患处发挥其抑菌与背景保护作用。虽然解离后的鱼精蛋白同时也可能会竞争结合体内的肝素类物质，但bFGF分子已经与LMWH/肝素片段形成了更加牢固的复合物，因此在体内不受此影响，可发挥完全的生物活性。而LMWH/肝素片段在此设计中仅发挥信号通路的一个环节中的类似于辅酶的配合物作用，因此其用量极低，仅在1×10

LMWG/肝素片段与bFGF的结合还能够使bFGF在创面微环境中不易被降解，有助于其药物浓度的维持与半衰期的提高。同时，制剂中含量远高于bFGF且同属于碱性蛋白的鱼精蛋白，在创面微环境中能够形成背景保护，屏蔽各种蛋白酶对bFGF的攻击，进而延长游离bFGF的作用时间。以当前市面上的人碱性成纤维细胞因子凝胶剂为参照，在烧伤创面的动物模型上，对本发明提供的人碱性成纤维细胞因子凝胶剂进行了创面剂量维持的研究考察。将供试品与参照品，分别作用于已随机分组的深II度烧伤模型动物的创面，一定时间后对患处组织进行取样，利用建立的ELISA方法检测并比对bFGF的含量变化情况。实验结果显示，本发明提供的人碱性成纤维细胞因子凝胶剂中的活性成分在创面微环境中的滞留时间明显更长。

综上，本发明提供的人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂，在发挥其促愈合作用的同时还实现了创面抑菌的协同功能，而较低的微生物负荷更有利于创面的愈合速度。同时，活性成分bFGF在患处获得了多维度的保护，延缓了37℃左右的温度下大量蛋白酶的降解作用，其稳定性、浓度维持与作用时间也得到明显提升。另外，鱼精蛋白可能会带来的凝血作用也有利于创面愈合的进程。因此，这些协同功能，也令人惊喜地产生了显著的治疗增效作用。在以SD大鼠建立的烧伤动物模型的促愈合实验中，本发明提供的人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂在治疗时结痂形成时间以及创面愈合所用时间显著地短于以当前的人碱性成纤维细胞生长因子凝胶的参照组。在创面愈合率及愈合时间上具有明显优势。整体相较，鱼精蛋白也是优于多聚赖氨酸的选择。

基于上述的研究与开发工作，获得了具有多方面显著优势的人碱性成纤维细胞生长因子制剂新组方及其制备工艺，本发明的技术方案如下：

所述凝胶剂组方含有：人碱性成纤维细胞生长因子、鱼精蛋白、甘氨酸、氯化钠、甘油、pH调节剂、活性辅助因子、凝胶基质，以水做溶媒。

进一步的，所述组方中含有的人碱性成纤维细胞生长因子是采用大肠杆菌或酵母菌等基因工程菌发酵表达并纯化制得的重组人碱性成纤维细胞生长因子。其在制剂中的处方量在1000IU/g-20000IU/g。

进一步的，所述组方中鱼精蛋白包括硫酸鱼精蛋白、盐酸鱼精蛋白等成盐形式。其使用量在0.1~50mg/g。

进一步的，所述组方中甘氨酸使用量为5~25mg/g。

进一步的，所述组方中氯化钠使用量为1~15mg/g。

进一步的，所述组方中甘油使用量为20~100mg/g。

进一步的，所述组方中pH调节剂选自盐酸、硫酸、氢氧化钠、三乙醇胺中的一种或多种，将pH调节至6.0~9.0范围。

进一步的，所述组方中活性辅助因子为低分子肝素或者肝素分子片段。肝素分子片段的分子量在3500Da以下，使用量为0.1~20μg/g。低分子肝素选自Enoxaparin、Dalteparin、Nadroparin中的一种或多种，使用量为0.1~20μg/g。

进一步的，所述组方中凝胶基质选自卡波姆、甲基纤维素、羟丙甲纤维素、纤维素衍生物、交联的丙烯酸聚合物、泊洛沙姆、海藻酸、玻璃酸钠、结冷胶、聚乙烯吡咯烷酮、交联聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇中的一种或多种。使用量为2~50mg/g。

进一步的，所述组方中水溶媒为符合中国药典规定质量标准的注射用水或纯化水。

本发明所述的带有抑菌功能的重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂，能够以下述方法和步骤制备：

①. 将重组人碱性成纤维细胞生长因子按照在终产品中1000IU/g-20000IU/g的投料量，加入注射用水或纯化水进行溶解，再加入活性辅助因子0.0001‰~0.02‰，5~45℃孵育0.5h以上，以0.45μm、0.22μm滤膜进行除菌过滤，即为A液。

②. 将占总重量百分比为0.01-5.0%的硫酸鱼精蛋白，加入注射用水或纯化水进行溶解，以0.45μm、0.22μm双层滤膜进行除菌过滤，即为B液。

③. 将占总重量百分比为0.5%~2.5%的甘氨酸、0.1%~1.5%的氯化钠、2%~10%的甘油，以及能够将终产品pH值控制在6.0~9.0之间的适量三乙醇胺，加入注射用水或纯化水进行溶解，121~124℃进行灭菌，即为C液。

④. 将占总重量百分比为0.2%~5.0%的凝胶基质，加入注射用水进行溶解，搅拌使其充分溶解制成凝胶溶液，121~124℃进行灭菌，即为D液。

⑤. 将上述已经过灭菌处理的A液、B液与C液、D液分别混合，再混合于乳化搅拌罐。经均质处理，得到本发明所述的重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂。

有益效果

本发明的有益效果在于：所提供的重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂，通过基于亲和力差异的二级复合物的设计，显著提升了bFGF在含水介质中的稳定性，使其储存有效期达到了30个月，明显优于当前市面产品的18个月。并使在保证bFGF生物活性的前提下，同时实现了加速创面愈合与抑制创面微生物、防感染的协同功效。在加速创面愈合的同时能够降低微生物负荷，协助人体免疫系统对抗创面部位的微生物感染。同时，活性成分bFGF在患处获得了多维度的保护，延缓了37℃左右的温度下大量蛋白酶的降解作用，其稳定性与作用时间也得到明显提升。另外，鱼精蛋白可能会带来的凝血作用也有利于创面愈合的进程。这些协同也带来了令人惊喜的显著治疗增效作用。另外，新开发的组方中也弃用了小分子化学防腐剂，更加有益于患者的健康。综上，本发明所提供的技术方案解决了当前产品存在的问题，消除了多个短板，提升了产品的综合性能。将进一步扩大重组人碱性成纤维细胞生长因子的临床应用范围与便利性，提高其治疗收益与临床应用价值，为患者带来更优选择。

附图说明

图1 测试例5中实施例与对比例的重组人碱性成纤维细胞生长因子长期稳定性试验中生物活性的变化趋势。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可根据公开的实施例直观了解到本发明的优点及功效。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均视为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径得到。

实施例

本发明提供的一种重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂的制备：

根据重组人碱性成纤维细胞生长因子原液的效价检测结果，按照总投料量1.3×10

称取52g硫酸鱼精蛋白，加入3380g注射用水，搅拌至完全溶解，再以0.45μm、0.22μm双层PVDF滤膜进行除菌过滤，标记为B液。

称取甘油910g、氯化钠312g以及适量的三乙醇胺，加入5850g注射用水中，搅拌溶解，配制成甘油、氯化钠、三乙醇胺的水溶液，121~124℃灭菌30~35min，标记为C液。

称取甘氨酸312g，加入11700g注射用水，搅拌至完全溶解。再称取卡波姆260g，加入其中，搅拌使其充分溶解制成卡波姆凝胶溶液，121~124℃灭菌30~35min，标记为D液。

将已经过除菌处理的A液、B液与C液、D液分别混合后，按顺序依次加入乳化搅拌罐中，补加150g左右的灭菌注射用水，调节至总量26000g。使各辅料的最终浓度为：1.2%甘氨酸、0.2%硫酸鱼精蛋白、1.0%卡波姆、Enoxaparin 0.01‰、1.2%氯化钠、3.5%甘油，重组人碱性成纤维细胞生长因子最终浓度为每1g含5000IU，适量的三乙醇胺调pH值至7.40~7.50。开启乳化罐搅拌装置，转速60r/min，搅拌30min以上即得半成品。将检测合格的半成品通过封尾灌装机进行分装，即得本发明提供的重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂。

对比例

本对比例的凝胶剂的制备方法同实施例，不同之处在于配方不同。本对比例的凝胶剂按重量百分含量计包括：1.0%卡波姆、0.2%聚山梨酯80、0.1%对羟基苯甲酸乙酯、5.0%甘油、重组人碱性成纤维细胞生长因子最终浓度为每1g含5000IU，适量的三乙醇胺调pH值至7.40~7.50。溶媒同为注射用水。

测试例1

实施例与对比例的重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂的主要药学质量测试：

（1）外观：目检二者为无色透明的粘稠凝胶。

（2）pH值：使用PHSJ-4F型pH计进行检测，实施例的凝胶剂pH值为7.47，对比例的凝胶剂pH值为7.44。

（3）粘度：使用NDJ-1型粘度计进行检测，实施例的凝胶剂粘度为12.8Pa·S，对比例的凝胶剂粘度为13.5Pa·S。

（4）无菌：按《中国药典》2015版的无菌检测方法进行检测，实施例与对比例的凝胶供试品管中均无菌生长，均符合规定。

测试例2

实施例与对比例的重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂的生物活性测试：

标准品溶液制备：取1支重组人碱性成纤维细胞生长因子标准品，按说明书复溶后，用维持培养基稀释至每1ml含40IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，做8个稀释度，每个稀释度做2个孔。以上操作在无菌条件下进行。

供试品溶液制备：使用无菌玻璃试管精密称取供试品0.5g左右，加入5ml灭菌生理盐水混匀，1000rpm离心10min，取上清液，用维持培养基稀释至每1ml含40IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，做8个稀释度，每个稀释度做2个孔。以上操作在无菌条件下进行。

活性测定：取Balb/c 3T3细胞株用完全培养液于37℃、5%CO

结果计算：试验数据采用计算机程序或直线回归计算法进行处理，并按下式计算结果：

供试品生物学活性（IU/ml）=Pr×Ds×Es/(Dr×Er)

式中Pr为标准品生物学活性，单位IU/ml；Ds为供试品预稀释倍数；Dr为标准品预稀释倍数；Es为供试品相当于标准品半效量稀释倍数；Er为标准品半效稀释倍数。

以该测活方法对，按照实施例与对比例的操作方法分别制备的各10批次重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂，进行生物活性的检测与数据分析。检测数据参见表1，结果显示各批次的生物活性均在标示量的80%-150%范围内，符合质量标准的规定。无超出标准限度的批次，且各批次的质量情况较为稳定。

表1 人碱性成纤维细胞因子生长因子的生物活性测试结果汇总

对两组试验结果进行正态分布检验与t检验，结果如表2。

表2 生物活性对比的统计分析表

独立样本检验

结果显示，sig值为0.209＞0.05，和说明方差是齐的。双尾概率p值为0.539＞0.05，表明实施例的重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶制剂与对比例相比，在生物活性上无显著差异。

测试例3

实施例的重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂的抑菌效力测试：

《中国药典》2015年版四部通则1121的“抑菌效力检查法”必须在液体中进行，凝胶状态下无法对鱼精蛋白的抑菌效力进行考察。卡波姆又是一种结构松散的惰性树脂，对于微生物没有明显的抑制或助生长作用。因此，在不加入卡波姆的条件下，进行鱼精蛋白的抑菌效力试验。按实施例中硫酸鱼精蛋白占比为2.0‰的配方进行不含卡波姆供试品的配制，再按照硫酸鱼精蛋白1.0‰与0.5‰同步配制两组不含卡波姆的供试品。

试验用菌种包括金黄色葡萄球菌（26003）、大肠埃希菌（44102）、铜绿假单胞菌（10104）、白色念珠菌（98001）和黑曲霉（99003），按照每1ml供试品中10

表3 抑菌效力测试供试品含菌量检测结果

表4 抑菌效力测分析结果汇总

注 NR：试验菌未恢复生长

从实验结果看，含硫酸鱼精蛋白的供试品对于金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌具有非常好的杀灭作用，对于黑曲霉菌也有着一定的抑制作用。随着硫酸鱼精蛋白占比的升高，其抑菌效力也随之提升。硫酸鱼精蛋白为1.0mg/ml与2.0mg/ml浓度时，其抑菌效力明显好于0.5mg/ml时。在药液中接种规定的供试菌后，1.0mg/ml与2.0mg/ml浓度下，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌在第24小时均未检测到有菌生长，6h时这四种菌的菌数下降均在6.0个对数单位以上。对黑曲霉不能完全杀灭，但其表现基本能够符合药典中的A级标准。黑曲霉菌在第7天菌数下降2个对数单位以上。而黑曲霉也非常见的创面致病菌。

试验结果显示，鱼精蛋白具有广谱抑菌作用，处方量为0.2%时对微生物的杀灭效力良好。

测试例4

实施例与对比例的重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂对感染创面的抑菌能力测试：

深II度烫伤模型的建立：取60只SD大鼠，用1%戊巴比妥钠溶液按40mg/kg腹腔注射进行麻醉。背部剃毛，常规消毒。以自制的直径为3cm的烫伤板触压于大鼠背部脊椎两侧部位同时致伤9s，获得符合伤及真皮深层、尚残留皮肤附件、因变质的表层组织稍厚、水泡较小或较扁薄、皮温稍低等深II度烫伤标准的模型鼠（HE染色后进行组织学观察），单笼饲养，环境温度保持在20~25℃。饲养所用鼠笼、垫料、饲料与水等均经过高压消毒。致伤后筛选出精神状态尚可，进食较好的大鼠。随机分为6组，每组8只，雌雄各半。

烫伤创面感染模型的建立：在已建立的深II度烫伤模型基础上，选用常见的皮肤条件致病菌-金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌，进一步建立烫伤创面感染模型。

分别取金黄色葡萄球菌（26003）、铜绿假单胞菌（10104），复苏后接种于琼脂培养基上，35℃恒温培养18~22h，用接种环挑取菌落接种于血培养基上，再培养18~22h，稀释法配制为1×10

第1、4组创面采用实施例的人碱性成纤维细胞因子凝胶换药治疗；第2、5组创面采用对比例的人碱性成纤维细胞因子凝胶换药治疗；第3、6组创面采用普通纱布覆盖，每3天创面消毒、更换纱布1次。实验每组8只大鼠分别于伤后第3、6、9d天，于创面取少许组织，称重，剪碎，按1:10 的比例加入PBS缓冲液，电动搅拌器充分匀浆，取匀浆液按照1:10的比例稀释后，再取0.1mL稀释液接种于营养琼脂平板，35~37℃孵育18~24h，检测计算痂下细菌数量。含菌量（CFU/g）=菌落数（CFU）×稀释倍数/组织重量（g），实验结果参见表5。

表5 SD大鼠换药治疗的各时间点创面微生物负荷变化（x±s，n=8）

实验结果表明，实施例的重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂对于感染创面的金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌有明显的抑制作用，优势明显。

测试例5

实施例与对比例的重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂的稳定性试验：

对3批实施例和3批次对比例的重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂，以生物活性为指标进行长期稳定性试验考察。

取连续三批按照实施例方法制得的重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂（批次：S8、S9、S10）以及连续三批按照对比例方法制得的重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂（批号：D8、D9、D10），同步置于2~8℃的冷藏环境中。于放置的第0、3、6、9、12、18、24、30个月的月末分别取样，进行生物活性的检测与比对。试验结果参见表6，生物活性变化趋势见附图1。

结果显示：在2~8℃存放的长期稳定性试验条件下，对比例的重组人碱性成纤维细胞生长因子的生物学活性在第30个月的时候已全部低于标示量80%的质量标准规定的下限，在第24个月时也有两批次接近了80%的下限值。而实施例的重组人碱性成纤维细胞生长因子的生物学活性在第30个月的时候仍全部符合质量标准的规定。生物学活性下降速率明显更缓，稳定性表现更好，基本上可以达到30个月的储存效期。

表6 长期试验生物活性测试结果汇总

测试例6

实施例与对比例的重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂的促愈合效果比对试验：

深II度烫伤模型的建立：取60只SD大鼠，用1%戊巴比妥钠溶液按40mg/kg腹腔注射进行麻醉。背部剃毛，常规消毒。以自制的直径为3cm的烫伤板触压于大鼠背部脊椎两侧部位同时致伤9s，获得符合伤及真皮深层、尚残留皮肤附件、因变质的表层组织稍厚、水泡较小或较扁薄、皮温稍低等深II度烫伤标准的模型鼠（HE染色后进行组织学观察），单笼饲养，环境温度保持在20~25℃。饲养所用鼠笼、垫料、饲料与水等均经过高压消毒。致伤后筛选出精神状态尚可，进食较好的大鼠。随机分为3组，每组10只，雌雄各半。

建模完成后，第1组创面采用实施例的人碱性成纤维细胞因子凝胶换药治疗；第2组创面采用对比例的人碱性成纤维细胞因子凝胶换药治疗；第3组创面采用普通纱布覆盖，每3天创面消毒、更换纱布1次。以创面上皮化率＞95%认为创面愈合，分别记录各组大鼠创面的起痂时间与最终愈合时间。检测数据以均数±标准差(X±S)表示，采用SPSS 18.0软件进行t检验，组间比较用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。实验结果参见表7。

表7 各组实验的起痂时间与愈合时间（n=10）

从实验结果的比对可以看到实施例组大鼠的创面愈合时间最短，起痂时间也最短；对比例组次之；未施药组的创面起痂和愈合时间均为最长，三组之间比较P＜0.05，差异有统计学意义。在多重功效的作用下实施例的人碱性成纤维细胞生长因子凝胶实现了更快的创面愈合，表现出了更优的治疗效果。