尿液足细胞来源的迁移体在预测肾小球足细胞早期损伤中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及迁移体作为生物标志物在制备预测肾小球足细胞早期损伤药物中的应用。

背景技术

足细胞病是大多数进行性肾脏疾病最终导致终末期肾病（ESRD）的主要原因，足细胞以其复杂的形态结构控制肾小球的通透性，蛋白尿的发展通常与足细胞损伤有关，例如足细胞足突消失和细胞丢失。由于足细胞是终末分化细胞并且缺乏更新能力，因此检测足细胞早期损伤对于肾小球疾病治疗的成功至关重要。

目前临床上常用的足细胞损伤诊断方法有组织病理诊断，如肾脏穿刺、尿蛋白检测等；病因诊断，如询问药物服用史、询问家族史等。这些方法操作比较复杂，诊断比较滞后。

细胞外囊泡（EVs），尤其是外泌体，是一类介导细胞间通讯的信号分子。尽管外泌体释放与细胞损伤之间联系的分子基础尚不清楚，但在肾脏疾病的早期阶段，多种细胞释放的EVs通常会增加，并且多项研究表明肾内细胞释放的循环EVs与不同肾脏疾病的进展有关，这引起了人们对于肾脏细胞释放外泌体作为新生肾脏疾病敏感生物标志物的潜力的极大兴趣。由于尿液也是EVs的丰富来源，因此尿液中EVs的升高可能是肾脏损伤的一种非侵入性指标。但是鉴于尿液EVs尤其是外泌体的细胞来源很难确定，因此尿液外泌体作为足细胞损伤的非侵入性标志物的重要性被削弱。

最近，有研究发现了一类独特的细胞外囊泡称为迁移体，可以在细胞迁移过程中被细胞分泌。足细胞在生理状态下是相对静止的，但在受到外界刺激时，则表现出比其他肾脏细胞更高的迁移性。近年来研究表明尿液外泌体可以用于多种肾脏疾病的前期诊断和治疗指导，但还没有关于足细胞可以释放迁移体以及尿液足细胞来源迁移体用于预测肾小球足细胞早期损伤的报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种用于预测足细胞早期损伤的细胞外分泌囊泡（迁移体）；本发明的第二个目的是提供尿液足细胞来源的迁移体作为生物标志物在制备预测或辅助预测足细胞早期损伤产品中的应用；本发明的第三个目的是提供检测待测样本中尿液足细胞来源的迁移体的物质在制备预测或辅助预测足细胞早期损伤产品中的应用；本发明的第四个目的是提供检测待检者的尿液足细胞来源的迁移体的物质在制备预测或者辅助预测足细胞早期损伤产品中的应用；本发明第五个目的提供一种分离及检测足细胞来源的迁移体的方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种细胞外分泌囊泡，该细胞外囊泡为足细胞来源的迁移体。

与足细胞早期损伤预测相关的生物标志物，该标志物为尿液足细胞来源的迁移体。

优选的，所述标志物为：①粒径为400-2000nm的囊泡，单层膜结构；②内部含有较小的囊泡；③表达蛋白质，TSPAN4等。

尿液足细胞来源的迁移体作为生物标志物在制备预测或辅助预测足细胞早期损伤产品中的应用。

检测待测样本中尿液足细胞来源的迁移体的物质在制备预测或辅助预测足细胞早期损伤产品中的应用。

检测待检者的尿液足细胞来源的迁移体的物质在制备预测或者辅助预测足细胞早期损伤产品中的应用。

优选的，所述尿液足细胞来源的迁移体为：①粒径为400-2000nm的囊泡，单层膜结构；②内部含有较小的囊泡；③表达蛋白质。

一种预测或辅助预测足细胞早期损伤的产品，其包括前文检测待测样本中尿液足细胞来源的迁移体的物质，或，前文检测待检者的尿液足细胞来源的迁移体的物质。

优选的，所述产品为试剂盒。

本发明还保护一种分离及检测足细胞来源的迁移体的方法。

优选的，所述方法包括以下步骤：

（1）收集正常对照及肾病患者（FSGS患者）的尿液至50ml离心管中；

（2）下面的步骤均在4℃进行，使用4℃预冷的高速离心机1000g离心10min，弃沉淀回收上清，之后4000g离心20min，弃沉淀回收上清，之后20000g离心30min，沉淀即为分离得到的迁移体；

（3）对分离得到的尿液迁移体分别进行电镜检测、Nanosight粒径检测及黏附实验检测。对比分析正常人及肾病患者尿液迁移体检测的结果。

本发明的检测方法具体步骤如下：

免疫电镜检测：（1）将分离得到的尿液迁移体使用2.5%戊二醛4℃固定过夜；（2）使用PBS 4℃漂洗；（3）使用1%四氧化锇4℃后固定；（4）分别使用浓度梯度的乙醇和丙酮4℃进行脱水；（5）使用丙酮、树脂进行浸透；（6）使用纯树脂60℃包埋过夜；（7）超薄切片，镍网捞片；1% NaIO

Nanosight粒径检测：（1）将分离到的尿液迁移体用0.22μm滤器滤过的适量PBS重悬；（2）将重悬的尿液迁移体使用Nanosight NS 300 system进行检测分析。

黏附实验检测：（1）使用human fibronectin包被事先铺有细胞爬片的24孔板；（2）将分离到的正常人和肾病患者的尿液迁移体分别接种到铺有细胞爬片并包被过的24孔板中，37℃孵育30min；（3）之后吸去上清，使用一定浓度的PKH67 Green Fluorescent CellLinker对爬片上的迁移体避光染色15min，之后PBS洗3次；（4）之后使用4%多聚甲醛固定10min，之后PBS洗3次，封片，显微镜观察。

一种分离及检测足细胞来源的迁移体的方法在制备预测或辅助预测足细胞早期损伤产品中的应用。

本发明的有益效果：

首先，尿液相对容易获得，不仅稳定、微创、易于检测，且定量较精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类细胞外分泌囊泡（迁移体）的成功发现是对以外泌体为主的新型生物标志物的进一步拓展延伸，将为足细胞早期损伤的预测开创新的局面。其次，尿液迁移体来源清晰，在肾脏疾病的早期主要来源于足细胞，以其作为生物标志物具有一定的准确性和特异性。本发明提供的足细胞来源迁移体作为预测足细胞早期损伤的指标，有助于在尿蛋白等其他现有临床指标依旧正常的情况下提示足细胞损伤风险，有助于医师及时结合临床症状、病史或其他检查信息对患者制定适当的预防或治疗方案，将足细胞损伤控制在萌芽阶段，以避免发展为更加严重的肾脏损伤，具有极重要的临床应用潜力和价值。

附图说明

图1 本发明的尿液迁移体分离方法图。

图2 低蛋白尿FSGS患者尿液迁移体的免疫电镜图。

图3 显示正常人和低蛋白尿FSGS患者24h尿蛋白和尿液迁移体浓度散点图。

图4 显示正常人和低蛋白尿FSGS患者黏附实验荧光图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。

实施例1

尿液迁移体分离及检测方法包括以下步骤(见图1)：

（1）收集正常对照及肾病患者（FSGS患者）的尿液至50ml离心管中；

（2）下面的步骤均在4℃进行，使用4℃预冷的高速离心机1000g离心10min，弃沉淀回收上清，之后4000g离心20min，弃沉淀回收上清，之后20000g离心30min，沉淀即为分离得到的迁移体；

（3）对分离得到的尿液迁移体分别进行电镜检测、Nanosight粒径检测及黏附实验检测；对比分析正常人及肾病患者尿液迁移体检测的结果。

实施例2

检测方法具体步骤如下：

免疫电镜检测：（1）将分离得到的尿液迁移体使用2.5%戊二醛4℃固定过夜。（2）使用PBS 4℃漂洗。（3）使用1%四氧化锇4℃后固定。（4）分别使用浓度梯度的乙醇和丙酮4℃进行脱水。（5）使用丙酮、树脂进行浸透。（6）使用纯树脂60℃包埋过夜。（7）超薄切片，镍网捞片。1% NaIO

Nanosight粒径检测：（1）将分离到的尿液迁移体用0.22μm滤器滤过的适量PBS重悬（2）将重悬的尿液迁移体使用Nanosight NS 300 system进行检测分析。

黏附实验检测：（1）使用human fibronectin包被事先铺有细胞爬片的24孔板。（2）将分离到的正常人和肾病患者的尿液迁移体分别接种到铺有细胞爬片并包被过的24孔板中，37℃孵育30min。（3）之后吸去上清，使用一定浓度的PKH67 Green Fluorescent CellLinker对爬片上的迁移体避光染色15min，之后PBS洗3次。（4）之后使用4%多聚甲醛固定10min，之后PBS洗3次，封片，显微镜观察。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。