利用线粒体基因编辑系统培育植物雄性不育系的方法

技术领域

本发明属于植物基因工程育种领域。

背景技术

植物雄性不育系，是雄蕊发育不正常但雌蕊发育正常的植物品系，不能产生正常功能的花粉，但能接受正常花粉而结实。

植物不育系在植物育种，尤其是农作物育种中具有重要地位。其可降低杂交种子生产成本，提高杂种质量，扩大杂种优势的利用范围。著名的三系杂交水稻就使用了胞质雄性不育系。

雄性不育系中有一种特殊表型称为雄蕊瓣化表型，在园艺领域具有较为重要的地位。雄蕊瓣化是雄蕊发育成花瓣的现象，该现象能使花卉产生重瓣(重瓣牡丹、重瓣百合均在此列)，增加观赏性。

胞质雄性不育系，即细胞质的基因引起的雄性不育，通常为线粒体内基因突变引起的雄性不育。植物atp9基因是线粒体基因，使用RNAi敲低atp9可形成无雄蕊的胞质雄性不育植株(陶瑶.orf25和atp9基因干扰对烟草雄性不育性的影响[D].江西农业大学.2017)。但RNAi敲低产生的表型不能随着传代稳定维持下来，在育种工作中的应用意义不大。

近年来发展起来的基因组编辑技术，因其在DNA特异位点引入突变，且表型能较稳定地遗传，成为功能基因组研究和精准育种的有力工具。基因组编辑技术的原理是利用可修饰的核酸内切酶在基因组特异位点引入DNA双链断裂，并利用细胞的修复机制实现目的基因组区域的DNA序列改变。

第一代和第二代基因编辑系统分别为ZFNs系统和TALENs系统，都是依赖经过设计的、序列特异性的DNA结合元件和非特异性的DNA切割结构域组成的核酸酶分子，对特定序列进行切割。这两种基因编辑系统由于需要复杂的序列特异性的DNA结合元件，并获得特异性的融合蛋白，流程较为复杂，成本较高。

第三代基因编辑系统为CRISPR/Cas系统(以CRISPR/Cas9系统为代表)，其依赖gRNA与Cas酶形成复合体，对靶基因进行编辑，设计更为简单，成本更低，而且编辑效率高，是目前最为流行的基因编辑系统。

尽管与ZFNs和TALENs系统相比具有较强的优势，CRISPR/Cas系统却很难对植物线粒体进行基因编辑。

基于上述原因，目前尚未见使用CRISPR/Cas系统对植物线粒体基因进行编辑的技术，更未见使用CRISPR/Cas系统构建胞质雄性不育系的研究，对植物线粒体的基因编辑技术主流仍是复杂的TALENs系统。

发明内容

本发明要解决的问题是：

1)提供一种利用CRISPR/Cas系统编辑植物线粒体基因的方法；

2)提供一种利用该原理培育胞质雄性不育系的方法；

3)提供一种利用CRISPR/Cas系统培育雄蕊瓣化不育系的方法。

本发明的技术方案如下：

一种用于植物线粒体基因编辑的质粒，所述质粒包括如下2个表达框：

(1)表达Cas9蛋白的表达框，由启动子、靶向线粒体的信号肽基因、Cas9基因和终止子组成；

(2)表达sgRNA的表达框，由启动子、靶点序列和gRNA序列组成；

所述靶点序列是与待编辑靶基因同源的长度16～24bp的序列；所述的“同源”指序列一致。

进一步地，所述Cas9基因序列如SEQ ID NO.6所示；

和/或，所述表达框(1)中的信号肽基因如SEQ ID NO.5所示。

进一步地，所述表达框(1)中的启动子为35S启动子；

和/或，所述表达框(1)中的终止子为nos终止子；

和/或，所述表达框(2)中的启动子为拟南芥U3启动子。

进一步地，所述表达框(2)中靶点序列的靶基因为植物atp9基因；

优选地，所述靶点序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述质粒包括序列如SEQ ID NO.2所述的序列；

优选地，所述质粒为将所述表达框(1)、(2)连入线性化的pCambia1300载体骨架中所得质粒。

一种线粒体基因编辑试剂盒，所述试剂盒包括前述的质粒。

一种重组菌，所述重组菌含有前述质粒。

一种培育植物雄性不育系的方法，包括如下步骤：

1)将前述质粒(所述表达框(2)中靶点序列的靶基因为植物atp9基因)转染进入植物组织；

2)将步骤1)的组织培养成再生植株；

3)通过花器官变异筛选不育系。

进一步地，所述植物为烟草。

进一步地，所述不育系为雄蕊瓣化植株。

本发明的有益效果如下：

本发明在表达Cas酶的质粒中构建靶向线粒体的信号肽片段，使Cas酶能够进入线粒体内部，实现植物线粒体基因的编辑。

通过本发明的方法编辑植物atp9基因，可得到一定比例的雄性不育系，对育种具有较良好的意义。

本发明的方法虽然导致烟草叶片atp9基因的低表达，但意外地导致烟草花中atp9高表达，进而引起雄蕊瓣化，可用于培养观赏花卉的新品种。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：CRISPR/mtCas9载体和atp9基因靶位点的示意图。a.CRISPR/mtCas9载体示意图；b.atp9基因靶位点所在位置示意图。RB：右边界；35S：35S启动子；HPT：潮霉素磷酸转移酶基因；PolyA：PolyA终止子；MtLP：靶向线粒体的信号肽；pCas9：根据植物密码子偏爱性优化后的Cas9序列；Tnos：nos终止子；AtU3：拟南芥的U3启动子；T：靶点序列，用于结合靶DNA；gRNA：sgRNA的锚定序列，用于结合Cas9蛋白。

图2：烟草花器官突变类型及种子。注：WT为野生型；SAF为雄蕊瓣化型；APT为花粉败育型；竖线为标尺，均为5cm。

图3：野生型和突变型烟草叶片中线粒体的相对拷贝数。

图4：atp9基因的序列比对。

图5：atp9基因在叶片和花中的相对表达量。

具体实施方式

实施例1烟草雄性不育系的构建

1.CRISPR/mtCas9表达载体构建

去除密码子优化后的Cas9基因核苷酸序列两端核定位序列，并在其5’端加入靶向线粒体的信号肽核苷酸，利用组成型启动子35S驱动Cas9基因表达，为mtCas9表达框；在线粒体基因atp9的5’端编码区设计靶点序列，并置于gRNA片段的5’端，利用拟南芥U3启动子驱动sgRNA表达，为sgRNA表达框。mtCas9表达框和sgRNA表达框全长为5500bp，由金唯智生物科技有限公司进行基因合成。合成的基因片段名为mtCas9-sgRNA，mtCas9-sgRNA经HindⅢ和KpnI酶切后，连入线性化的pCambia1300载体骨架中，得到了靶向线粒体基因编辑的表达载体CRISPR/mtCas9(图1)。

所述靶点序列(SEQ ID NO.1)为：

GCTTCAGCGGGAGCTGCTAT

mtCas9-sgRNA的序列(SEQ ID NO.2)为：

序列中的标识释义：

(1)：35S(SEQ ID NO.3)；(2)：5’UTR(SEQ ID NO.4)；(3)：MtLP(SEQ ID NO.5)；(4)：pCas9(SEQ ID NO.6)；(5)：Tnos(SEQ ID NO.7)；(6)：LacZ(SEQ ID NO.8)；(7)：AtU3(SEQ ID NO.9)；(8)：T(SEQ ID NO.1)；(9)：gRNA(SEQ ID NO.10)。

2.转基因烟草的获得与表型观察

转基因烟草的获得：将CRISPR/mtCas9载体通过冻融法转入农杆菌LBA4401中，携带CRISPR/mtCas9载体的农杆菌培养物侵染小块烟草幼嫩叶片后，经共培养、恢复培养、愈伤筛选和再生筛选培养，获得76株烟草再生植株。提取烟草叶片的基因组DNA，并以基因组DNA为模板，利用HYG引物进行PCR检查，结果显示76株烟草再生植株均为转基因植株。

转基因烟草的表型：76株转基因烟草中68株表型与野生型一致，而另外8株转基因烟草的花器官发育异常。花器官的变异类型两种：第一种为雄蕊瓣化型(SAF)，瓣化的雄蕊上有发育异常的花药，授粉后蒴果可以发育，成熟蒴果比野生型小，结实率下降了23.6％-48.3％；第二种为花粉败育型(APT)，花丝变短，花药开裂异常，花粉量少，授粉后蒴果基本上没有发育，果实内没有种子，结实率为0(图2)。在8株花器官异常发育的转基因烟草中，每株烟草具有的花器官类型均有差异，突变株Nmu44、Nmu52、Nmu70和Nmu80同时具有野生型和雄蕊瓣化型，Nmu43和Nmu46同时具有雄蕊瓣化型和花粉败育型，而Nmu58和Nmu81只有花粉败育型(表1)。

表1转基因烟草的花器官类型

注：WT为野生型；SAF为雄蕊瓣化型；APT为花粉败育型；--为无；+为有。

上述结果表明，本发明的方法可以成功得到一定比例的雄性不育植株，其中包括一定数量的雄蕊瓣化植株。

3.Hi-TOM基因编辑位点检测

为了分析线粒体在野生型和突变型烟草中拷贝数的变化，分别提取了野生型、Nmu43、Nmu58和Nmu80烟草的叶片DNA，将其作为为荧光定量PCR的模板。在线粒体不同区域分别设计两对引物，以Tubulin为内参，进行荧光定量PCR，计算烟草叶片中线粒体的相对拷贝数。结果显示野生型、Nmu43、Nmu58和Nmu80烟草叶片中的线粒体拷贝数差异不显著，表明野生型烟草和突变型烟草线粒体拷贝数基本一致(图3)。

分别提取野生型、Nmu43、Nmu58和Nmu80烟草的叶片基因组DNA和花基因组DNA，并以其为模板，利用atp9基因特异性引物(携带Bridging sequence)进行第一轮PCR扩增，之后以第一轮PCR产物做模板，加入Hi-TOM Mix，进行第二轮PCR扩增。回收的PCR扩增产物由天津诺禾致源生物信息科技有限公司进行高通量测序。测序数据上传到Hi-TOM网址(http://www.hi-tom.net/hi-tom/)进行解析。结果显示在野生型烟草叶片中野生型atp9基因(wtatp9)的比例为79.94％，而Nmu43、Nmu58和Nmu80叶片的比例分别为58.34％、52.06％和64.81％。在野生型烟草花中wtatp9的比例为81.63％，而Nmu43、Nmu58和Nmu80花的比例分别为57.00％、53.11％和49.77％(表2)。与野生型烟草相比，突变型烟草叶片和花中的wtatp9比例均有明显的下降，下降比例15.13％-31.86％。

前述结果说明突变型烟草中有15％-32％wtatp9拷贝的序列发生了突变。

表2 Hi-TOM基因编辑位点检测结果

注：WT为野生型；SAF为雄蕊瓣化型；APT为花粉败育型。

4.atp9基因的TA克隆及测序

为了检测atp9基因的编辑位点，利用atp9基因的特异性引物扩增野生型烟草和花粉败育型烟草Nmu80基因组DNA的atp9基因片段，进行TA克隆，分别挑取50个阳性克隆送至上海生物工程有限公司进行测序。

测序结果分析发现有Nmu80中有两个克隆在靶位点有95个碱基的缺失(图4)，并且这种变异的atp9基因类型在野生型中没有。

该结果进一步表明，线粒体atp9基因被成功地编辑。

5.atp9基因的表达量鉴定

为了分析atp9基因在野生型和突变型烟草中相对表达量的变化，分别提取了野生型、Nmu43、Nmu58和Nmu80烟草的叶片和花的RNA，反转录为cDNA，以其为荧光定量PCR的模板。根据atp9基因的序列，设计荧光定量PCR所需引物。以Tubulin为内参，进行荧光定量PCR，并计算样品的相对表达量。

结果显示，与野生型烟草相比，突变型烟草叶片中atp9基因的表达量均下降，分别为野生型烟草的47％、56％和38％；而突变型烟草花中atp9基因的表达量显著增加，分别为野生型烟草的9.2倍、9.3倍和2.1倍(图5)。

花中atp9基因表达量增加与瓣化相关，已在Szklarczyk等(Mitochondrial atp9genes from petaloid male-sterile and male-fertile carrots differ in theirstatus of heteroplasmy,recombination involvement,post-transcriptionalprocessing as well as accumulation of RNA and protein product[J].Theoretical&Applied Genetics,2014.)在胡萝卜瓣化不育系的研究中被阐明。但是，本发明使用基因敲除的手段原本目的是敲除atp9基因，但反而导致花器官内atp9表达的提升，最终引起雄蕊瓣化，这是事先未曾预料到的。

发明人推测由于在突变型烟草中atp9基因的序列变异，导致功能正常的ATP9蛋白量下降，而在需要大量能量的花器官中，可能存在一种负反馈调控机制，增加了atp9基因的表达量。

综上，本发明的方法可以成功地对植物线粒体基因进行编辑，使其产生雄性不育表型，并包括了雄蕊瓣化表型。当将本发明的方法应用于其他植物，和/或改变靶基因、替换质粒转染方式(例如电转、基因枪等)，其中心构思并未改变，均在本发明的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院西北高原生物研究所

<120> 利用线粒体基因编辑系统培育植物雄性不育系的方法

<130> GY417-2020P0112116CC

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

gcttcagcgg gagctgctat 20

<210> 2

<211> 5488

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

gtggagcacg acacacttgt ctactccaaa aatatcaaag atacagtctc agaagaccaa 60

agggcaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg attccattgc 120

ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc 180

catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa 240

gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca 300

aagcaagtgg attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat 360

ccttcgcaag acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag gacgtcgaga 420

gttctcaaca caacatatac aaaacaaacg aatctcaagc aatcaagcat tctacttcta 480

ttgcagcaat ttaaatcatt tcttttaaag caaaagcaat tttctgaaaa ttttcaccat 540

ttacgaacga tagccatgct ttcactacgt caatctataa gatttttcaa gccagccaca 600

agaactttgt gtagctctag atatctgctt cagcaaaaac ccgtggtgaa aactgcccaa 660

aacttagcag aagttaatgg tccagaaact ttgattggtc ctggtgctaa agagggtacc 720

cgtggatctt cacgtgttga aatggctggt attcacgggg tgcctgcggc tgacaagaag 780

tactccatcg gcctcgacat cggcaccaac agcgtcggct gggcggtgat caccgacgag 840

tacaaggtcc cgtccaagaa gttcaaggtc ctgggcaaca ccgaccgcca ctccatcaag 900

aagaacctca tcggcgccct cctcttcgac tccggcgaga cggcggaggc gacccgcctc 960

aagcgcaccg cccgccgccg ctacacccgc cgcaagaacc gcatctgcta cctccaggag 1020

atcttctcca acgagatggc gaaggtcgac gactccttct tccaccgcct cgaggagtcc 1080

ttcctcgtgg aggaggacaa gaagcacgag cgccacccca tcttcggcaa catcgtcgac 1140

gaggtcgcct accacgagaa gtaccccact atctaccacc ttcgtaagaa gcttgttgac 1200

tctactgata aggctgatct tcgtctcatc taccttgctc tcgctcacat gatcaagttc 1260

cgtggtcact tccttatcga gggtgacctt aaccctgata actccgacgt ggacaagctc 1320

ttcatccagc tcgtccagac ctacaaccag ctcttcgagg agaaccctat caacgcttcc 1380

ggtgtcgacg ctaaggcgat cctttccgct aggctctcca agtccaggcg tctcgagaac 1440

ctcatcgccc agctccctgg tgagaagaag aacggtcttt tcggtaacct catcgctctc 1500

tccctcggtc tgacccctaa cttcaagtcc aacttcgacc tcgctgagga cgctaagctt 1560

cagctctcca aggataccta cgacgatgat ctcgacaacc tcctcgctca gattggagat 1620

cagtacgctg atctcttcct tgctgctaag aacctctccg atgctatcct cctttcggat 1680

atccttaggg ttaacactga gatcactaag gctcctcttt ctgcttccat gatcaagcgc 1740

tacgacgagc accaccagga cctcaccctc ctcaaggctc ttgttcgtca gcagctcccc 1800

gagaagtaca aggagatctt cttcgaccag tccaagaacg gctacgccgg ttacattgac 1860

ggtggagcta gccaggagga gttctacaag ttcatcaagc caatccttga gaagatggat 1920

ggtactgagg agcttctcgt taagcttaac cgtgaggacc tccttaggaa gcagaggact 1980

ttcgataacg gctctatccc tcaccagatc caccttggtg agcttcacgc catccttcgt 2040

aggcaggagg acttctaccc tttcctcaag gacaaccgtg agaagatcga gaagatcctt 2100

actttccgta ttccttacta cgttggtcct cttgctcgtg gtaactcccg tttcgcttgg 2160

atgactagga agtccgagga gactatcacc ccttggaact tcgaggaggt tgttgacaag 2220

ggtgcttccg cccagtcctt catcgagcgc atgaccaact tcgacaagaa cctccccaac 2280

gagaaggtcc tccccaagca ctccctcctc tacgagtact tcacggtcta caacgagctc 2340

accaaggtca agtacgtcac cgagggtatg cgcaagcctg ccttcctctc cggcgagcag 2400

aagaaggcta tcgttgacct cctcttcaag accaaccgca aggtcaccgt caagcagctc 2460

aaggaggact acttcaagaa gatcgagtgc ttcgactccg tcgagatcag cggcgttgag 2520

gaccgtttca acgcttctct cggtacctac cacgatctcc tcaagatcat caaggacaag 2580

gacttcctcg acaacgagga gaacgaggac atcctcgagg acatcgtcct cactcttact 2640

ctcttcgagg atagggagat gatcgaggag aggctcaaga cttacgctca tctcttcgat 2700

gacaaggtta tgaagcagct caagcgtcgc cgttacaccg gttggggtag gctctcccgc 2760

aagctcatca acggtatcag ggataagcag agcggcaaga ctatcctcga cttcctcaag 2820

tctgatggtt tcgctaacag gaacttcatg cagctcatcc acgatgactc tcttaccttc 2880

aaggaggata ttcagaaggc tcaggtgtcc ggtcagggcg actctctcca cgagcacatt 2940

gctaaccttg ctggttcccc tgctatcaag aagggcatcc ttcagactgt taaggttgtc 3000

gatgagcttg tcaaggttat gggtcgtcac aagcctgaga acatcgtcat cgagatggct 3060

cgtgagaacc agactaccca gaagggtcag aagaactcga gggagcgcat gaagaggatt 3120

gaggagggta tcaaggagct tggttctcag atccttaagg agcaccctgt cgagaacacc 3180

cagctccaga acgagaagct ctacctctac tacctccaga acggtaggga tatgtacgtt 3240

gaccaggagc tcgacatcaa caggctttct gactacgacg tcgaccacat tgttcctcag 3300

tctttcctta aggatgactc catcgacaac aaggtcctca cgaggtccga caagaacagg 3360

ggtaagtcgg acaacgtccc ttccgaggag gttgtcaaga agatgaagaa ctactggagg 3420

cagcttctca acgctaagct cattacccag aggaagttcg acaacctcac gaaggctgag 3480

aggggtggcc tttccgagct tgacaaggct ggtttcatca agaggcagct tgttgagacg 3540

aggcagatta ccaagcacgt tgctcagatc ctcgattcta ggatgaacac caagtacgac 3600

gagaacgaca agctcatccg cgaggtcaag gtgatcaccc tcaagtccaa gctcgtctcc 3660

gacttccgca aggacttcca gttctacaag gtccgcgaga tcaacaacta ccaccacgct 3720

cacgatgctt accttaacgc tgtcgttggt accgctctta tcaagaagta ccctaagctt 3780

gagtccgagt tcgtctacgg tgactacaag gtctacgacg ttcgtaagat gatcgccaag 3840

tccgagcagg agatcggcaa ggccaccgcc aagtacttct tctactccaa catcatgaac 3900

ttcttcaaga ccgagatcac cctcgccaac ggcgagatcc gcaagcgccc tcttatcgag 3960

acgaacggtg agactggtga gatcgtttgg gacaagggtc gcgacttcgc tactgttcgc 4020

aaggtccttt ctatgcctca ggttaacatc gtcaagaaga ccgaggtcca gaccggtggc 4080

ttctccaagg agtctatcct tccaaagaga aactcggaca agctcatcgc taggaagaag 4140

gattgggacc ctaagaagta cggtggtttc gactccccta ctgtcgccta ctccgtcctc 4200

gtggtcgcca aggtggagaa gggtaagtcg aagaagctca agtccgtcaa ggagctcctc 4260

ggcatcacca tcatggagcg ctcctccttc gagaagaacc cgatcgactt cctcgaggcc 4320

aagggctaca aggaggtcaa gaaggacctc atcatcaagc tccccaagta ctctcttttc 4380

gagctcgaga acggtcgtaa gaggatgctg gcttccgctg gtgagctcca gaagggtaac 4440

gagcttgctc ttccttccaa gtacgtgaac ttcctctacc tcgcctccca ctacgagaag 4500

ctcaagggtt cccctgagga taacgagcag aagcagctct tcgtggagca gcacaagcac 4560

tacctcgacg agatcatcga gcagatctcc gagttctcca agcgcgtcat cctcgctgac 4620

gctaacctcg acaaggtcct ctccgcctac aacaagcacc gcgacaagcc catccgcgag 4680

caggccgaga acatcatcca cctcttcacg ctcacgaacc tcggcgcccc tgctgctttc 4740

aagtacttcg acaccaccat cgacaggaag cgttacacgt ccaccaagga ggttctcgac 4800

gctactctca tccaccagtc catcaccggt ctttacgaga ctcgtatcga cctttcccag 4860

cttggtggtg attaggtccg caaaaatcac cagtctctct ctacaaatct atctctctct 4920

atttttctcc agaataatgt gtgagtagtt cccagataag ggaattaggg ttcttatagg 4980

gtttcgctca tgtgttgagc atataagaaa cccttagtat gtatttgtat ttgtaaaata 5040

cttctatcaa taaaatttct aattcctaaa accaaaatcc agtgactgac attgtaggac 5100

tatattgctc taataaagga ggcagctatg ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg 5160

gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg 5220

cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc 5280

taaataagct tatgatttct tttttcttac gaattttgcg tcccacatcg gtaagcgagt 5340

gaagaaataa ctgctttata tatggctaca aagcaccatt ggtcagcttc agcgggagct 5400

gctatgtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa 5460

aaagtggcac cgagtcggtg cttttttt 5488

<210> 3

<211> 322

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

gtggagcacg acacacttgt ctactccaaa aatatcaaag atacagtctc agaagaccaa 60

agggcaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg attccattgc 120

ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc 180

catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa 240

gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca 300

aagcaagtgg attgatgtga ta 322

<210> 4

<211> 213

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag acccttcctc tatataagga agttcatttc 60

atttggagag gacgtcgaga gttctcaaca caacatatac aaaacaaacg aatctcaagc 120

aatcaagcat tctacttcta ttgcagcaat ttaaatcatt tcttttaaag caaaagcaat 180

tttctgaaaa ttttcaccat ttacgaacga tag 213

<210> 5

<211> 186

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 5

atgctttcac tacgtcaatc tataagattt ttcaagccag ccacaagaac tttgtgtagc 60

tctagatatc tgcttcagca aaaacccgtg gtgaaaactg cccaaaactt agcagaagtt 120

aatggtccag aaactttgat tggtcctggt gctaaagagg gtacccgtgg atcttcacgt 180

gttgaa 186

<210> 6

<211> 4134

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 6

atggctggta ttcacggggt gcctgcggct gacaagaagt actccatcgg cctcgacatc 60

ggcaccaaca gcgtcggctg ggcggtgatc accgacgagt acaaggtccc gtccaagaag 120

ttcaaggtcc tgggcaacac cgaccgccac tccatcaaga agaacctcat cggcgccctc 180

ctcttcgact ccggcgagac ggcggaggcg acccgcctca agcgcaccgc ccgccgccgc 240

tacacccgcc gcaagaaccg catctgctac ctccaggaga tcttctccaa cgagatggcg 300

aaggtcgacg actccttctt ccaccgcctc gaggagtcct tcctcgtgga ggaggacaag 360

aagcacgagc gccaccccat cttcggcaac atcgtcgacg aggtcgccta ccacgagaag 420

taccccacta tctaccacct tcgtaagaag cttgttgact ctactgataa ggctgatctt 480

cgtctcatct accttgctct cgctcacatg atcaagttcc gtggtcactt ccttatcgag 540

ggtgacctta accctgataa ctccgacgtg gacaagctct tcatccagct cgtccagacc 600

tacaaccagc tcttcgagga gaaccctatc aacgcttccg gtgtcgacgc taaggcgatc 660

ctttccgcta ggctctccaa gtccaggcgt ctcgagaacc tcatcgccca gctccctggt 720

gagaagaaga acggtctttt cggtaacctc atcgctctct ccctcggtct gacccctaac 780

ttcaagtcca acttcgacct cgctgaggac gctaagcttc agctctccaa ggatacctac 840

gacgatgatc tcgacaacct cctcgctcag attggagatc agtacgctga tctcttcctt 900

gctgctaaga acctctccga tgctatcctc ctttcggata tccttagggt taacactgag 960

atcactaagg ctcctctttc tgcttccatg atcaagcgct acgacgagca ccaccaggac 1020

ctcaccctcc tcaaggctct tgttcgtcag cagctccccg agaagtacaa ggagatcttc 1080

ttcgaccagt ccaagaacgg ctacgccggt tacattgacg gtggagctag ccaggaggag 1140

ttctacaagt tcatcaagcc aatccttgag aagatggatg gtactgagga gcttctcgtt 1200

aagcttaacc gtgaggacct ccttaggaag cagaggactt tcgataacgg ctctatccct 1260

caccagatcc accttggtga gcttcacgcc atccttcgta ggcaggagga cttctaccct 1320

ttcctcaagg acaaccgtga gaagatcgag aagatcctta ctttccgtat tccttactac 1380

gttggtcctc ttgctcgtgg taactcccgt ttcgcttgga tgactaggaa gtccgaggag 1440

actatcaccc cttggaactt cgaggaggtt gttgacaagg gtgcttccgc ccagtccttc 1500

atcgagcgca tgaccaactt cgacaagaac ctccccaacg agaaggtcct ccccaagcac 1560

tccctcctct acgagtactt cacggtctac aacgagctca ccaaggtcaa gtacgtcacc 1620

gagggtatgc gcaagcctgc cttcctctcc ggcgagcaga agaaggctat cgttgacctc 1680

ctcttcaaga ccaaccgcaa ggtcaccgtc aagcagctca aggaggacta cttcaagaag 1740

atcgagtgct tcgactccgt cgagatcagc ggcgttgagg accgtttcaa cgcttctctc 1800

ggtacctacc acgatctcct caagatcatc aaggacaagg acttcctcga caacgaggag 1860

aacgaggaca tcctcgagga catcgtcctc actcttactc tcttcgagga tagggagatg 1920

atcgaggaga ggctcaagac ttacgctcat ctcttcgatg acaaggttat gaagcagctc 1980

aagcgtcgcc gttacaccgg ttggggtagg ctctcccgca agctcatcaa cggtatcagg 2040

gataagcaga gcggcaagac tatcctcgac ttcctcaagt ctgatggttt cgctaacagg 2100

aacttcatgc agctcatcca cgatgactct cttaccttca aggaggatat tcagaaggct 2160

caggtgtccg gtcagggcga ctctctccac gagcacattg ctaaccttgc tggttcccct 2220

gctatcaaga agggcatcct tcagactgtt aaggttgtcg atgagcttgt caaggttatg 2280

ggtcgtcaca agcctgagaa catcgtcatc gagatggctc gtgagaacca gactacccag 2340

aagggtcaga agaactcgag ggagcgcatg aagaggattg aggagggtat caaggagctt 2400

ggttctcaga tccttaagga gcaccctgtc gagaacaccc agctccagaa cgagaagctc 2460

tacctctact acctccagaa cggtagggat atgtacgttg accaggagct cgacatcaac 2520

aggctttctg actacgacgt cgaccacatt gttcctcagt ctttccttaa ggatgactcc 2580

atcgacaaca aggtcctcac gaggtccgac aagaacaggg gtaagtcgga caacgtccct 2640

tccgaggagg ttgtcaagaa gatgaagaac tactggaggc agcttctcaa cgctaagctc 2700

attacccaga ggaagttcga caacctcacg aaggctgaga ggggtggcct ttccgagctt 2760

gacaaggctg gtttcatcaa gaggcagctt gttgagacga ggcagattac caagcacgtt 2820

gctcagatcc tcgattctag gatgaacacc aagtacgacg agaacgacaa gctcatccgc 2880

gaggtcaagg tgatcaccct caagtccaag ctcgtctccg acttccgcaa ggacttccag 2940

ttctacaagg tccgcgagat caacaactac caccacgctc acgatgctta ccttaacgct 3000

gtcgttggta ccgctcttat caagaagtac cctaagcttg agtccgagtt cgtctacggt 3060

gactacaagg tctacgacgt tcgtaagatg atcgccaagt ccgagcagga gatcggcaag 3120

gccaccgcca agtacttctt ctactccaac atcatgaact tcttcaagac cgagatcacc 3180

ctcgccaacg gcgagatccg caagcgccct cttatcgaga cgaacggtga gactggtgag 3240

atcgtttggg acaagggtcg cgacttcgct actgttcgca aggtcctttc tatgcctcag 3300

gttaacatcg tcaagaagac cgaggtccag accggtggct tctccaagga gtctatcctt 3360

ccaaagagaa actcggacaa gctcatcgct aggaagaagg attgggaccc taagaagtac 3420

ggtggtttcg actcccctac tgtcgcctac tccgtcctcg tggtcgccaa ggtggagaag 3480

ggtaagtcga agaagctcaa gtccgtcaag gagctcctcg gcatcaccat catggagcgc 3540

tcctccttcg agaagaaccc gatcgacttc ctcgaggcca agggctacaa ggaggtcaag 3600

aaggacctca tcatcaagct ccccaagtac tctcttttcg agctcgagaa cggtcgtaag 3660

aggatgctgg cttccgctgg tgagctccag aagggtaacg agcttgctct tccttccaag 3720

tacgtgaact tcctctacct cgcctcccac tacgagaagc tcaagggttc ccctgaggat 3780

aacgagcaga agcagctctt cgtggagcag cacaagcact acctcgacga gatcatcgag 3840

cagatctccg agttctccaa gcgcgtcatc ctcgctgacg ctaacctcga caaggtcctc 3900

tccgcctaca acaagcaccg cgacaagccc atccgcgagc aggccgagaa catcatccac 3960

ctcttcacgc tcacgaacct cggcgcccct gctgctttca agtacttcga caccaccatc 4020

gacaggaagc gttacacgtc caccaaggag gttctcgacg ctactctcat ccaccagtcc 4080

atcaccggtc tttacgagac tcgtatcgac ctttcccagc ttggtggtga ttag 4134

<210> 7

<211> 211

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 7

gtccgcaaaa atcaccagtc tctctctaca aatctatctc tctctatttt tctccagaat 60

aatgtgtgag tagttcccag ataagggaat tagggttctt atagggtttc gctcatgtgt 120

tgagcatata agaaaccctt agtatgtatt tgtatttgta aaatacttct atcaataaaa 180

tttctaattc ctaaaaccaa aatccagtga c 211

<210> 8

<211> 197

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 8

tgacattgta ggactatatt gctctaataa aggaggcagc tatgctggcc gtcgttttac 60

aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc 120

ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc 180

gcagcctgaa tggctaa 197

<210> 9

<211> 122

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 9

ataagcttat gatttctttt ttcttacgaa ttttgcgtcc cacatcggta agcgagtgaa 60

gaaataactg ctttatatat ggctacaaag caccattggt cagcttcagc gggagctgct 120

at 122

<210> 10

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 10

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcaccgagt cggtgctttt ttt 83