一种用于诱导多能干细胞的无血清培养基及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种无血清培养基，尤其涉及一种用于诱导多能干细胞的无血清培养基及其制备方法。

背景技术

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS cells)是用反转录病毒将多能性基因Sox2、Klf4、OCT4和c-Myc转染至体细胞，并使之重编程为能够无限增殖与分化的一类细胞，它与胚胎干细胞类似，体内外均能无限增殖，可分化为人体内几乎所有类型的细胞；同时，诱导多能干细胞具有取材简便、无免疫排斥反应、无道德伦理争议等优点，从而成为再生医学治疗研究中理想的种子细胞。

然而，目前限制人诱导多能干细胞进行临床转化和药物筛选等相关应用的一个关键的因素是缺乏稳定的、可大量扩增的培养基，因此，对于广泛的研究应用和病患需求，现有技术条件无法满足短时间内生产出足够数量的高质量的诱导多能干细胞。

诱导多能干细胞的最初采用的培养条件都需要明胶包被和饲养层细胞的支持。此外，传统培养基还采用成分复杂的血清替代品作为主要的培养基添加剂。由传统培养条件产生的诱导多能干细胞，因为长期暴露在富含动物制品的培养环境中，在移植后容易产生人体排斥反应，不能作为合适的细胞来源。同时，传统培养条件还很不稳定，不能满足实验和临床的应用需求。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种诱导多能干细胞的无血清培养基，成分明确，使用安全，可显著提高诱导多能干细胞的增殖效率。

本发明的目的之二在于提供一种用于诱导多能干细胞的无血清培养基的制备方法。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种用于诱导多能干细胞的无血清培养基，包括基础培养基，添加在基础培养基中的以下成分：胰岛素、二氯酚嗪、硫酸肝素糖蛋白、呋喃二烯、D-薄荷酮、卡瓦内酯、IFN-γ、EGF、柠檬酸锌。

进一步地，以终浓度计各组分的用量如下：胰岛素10-15μg/mL、二氯酚嗪1-4μg/mL、硫酸肝素糖蛋白15-20μg/mL、呋喃二烯1-5ng/mL、D-薄荷酮2-7ng/mL、卡瓦内酯10-15μg/mL、IFN-γ5-10ng/mL、EGF10-15ng/mL、柠檬酸锌12-17μg/mL。

进一步地，以终浓度计各组分的用量如下：胰岛素12μg/mL、二氯酚嗪3μg/mL、硫酸肝素糖蛋白18μg/mL、呋喃二烯3ng/mL、D-薄荷酮5ng/mL、卡瓦内酯12μg/mL、IFN-γ8ng/mL、EGF12ng/mL、柠檬酸锌15μg/mL。

进一步地，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

上述用于诱导多能干细胞的无血清培养基的制备方法，包括以下步骤：

(1)向基础培养基中加入胰岛素、二氯酚嗪、硫酸肝素糖蛋白、IFN-γ、EGF搅拌混合均匀；

(2)向步骤(1)的混合物中加入呋喃二烯、D-薄荷酮、卡瓦内酯、柠檬酸锌，继续搅拌至混合均匀后静置，过滤除菌后即得。

进一步地，步骤(2)中采用0.22μm的滤菌膜过滤除菌。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供的诱导多能干细胞的无血清培养基在基础培养基中添加胰岛素、二氯酚嗪、硫酸肝素糖蛋白、呋喃二烯、D-薄荷酮、卡瓦内酯、IFN-γ、EGF、柠檬酸锌等成分。培养基中添加的二氯酚嗪、硫酸肝素糖蛋白和卡瓦内酯协同作用调控诱导多能干细胞的有丝分裂周期，加快细胞代谢，缩短细胞分裂周期，使细胞保持较高的增殖速度。呋喃二烯、D-薄荷酮有助于诱导多能干细胞保持增殖活性和较好的生长状态，为保证细胞增殖的稳定性发挥作用。IFN-γ、EGF、柠檬酸锌为细胞的增殖提供营养供给，和基础培养基一起为诱导多能干细胞的增殖提供能量。

本发明的无血清培养基在上述成分的共同作用下，成分明确，使用安全，可显著提高诱导多能干细胞的增殖效率，缩短诱导多能干细胞的培养时间，能在短时间内提供大量高质量的诱导多能干细胞，为诱导多能干细胞的临床应用提供保障。

本发明还提供了一种用于诱导多能干细胞的无血清培养基的制备方法，通过在基础培养基中添加有效成分制备得到，过程简便易于操作，为产品的商业化提供便利。

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

实施例1

一种用于诱导多能干细胞的无血清培养基，由基础培养基，添加在基础培养基中的以下成分：胰岛素、二氯酚嗪、硫酸肝素糖蛋白、呋喃二烯、D-薄荷酮、卡瓦内酯、IFN-γ、EGF、柠檬酸锌组成；以终浓度计各组分的用量如下：胰岛素12μg/mL、二氯酚嗪3μg/mL、硫酸肝素糖蛋白18μg/mL、呋喃二烯3ng/mL、D-薄荷酮5ng/mL、卡瓦内酯12μg/mL、IFN-γ8ng/mL、EGF12ng/mL、柠檬酸锌15μg/mL。

上述用于诱导多能干细胞的无血清培养基的制备方法，包括以下步骤：

(1)向基础培养基中加入胰岛素、二氯酚嗪、硫酸肝素糖蛋白、IFN-γ、EGF搅拌混合均匀；

(2)向步骤(1)的混合物中加入呋喃二烯、D-薄荷酮、卡瓦内酯、柠檬酸锌，继续搅拌至混合均匀后静置，采用0.22μm的滤菌膜过滤除菌后即得。

实施例2

一种用于诱导多能干细胞的无血清培养基，由基础培养基，添加在基础培养基中的以下成分：胰岛素、二氯酚嗪、硫酸肝素糖蛋白、呋喃二烯、D-薄荷酮、卡瓦内酯、IFN-γ、EGF、柠檬酸锌组成；以终浓度计各组分的用量如下：胰岛素10μg/mL、二氯酚嗪1μg/mL、硫酸肝素糖蛋白15μg/mL、呋喃二烯1ng/mL、D-薄荷酮2ng/mL、卡瓦内酯10μg/mL、IFN-γ5ng/mL、EGF10ng/mL、柠檬酸锌12μg/mL。

上述用于诱导多能干细胞的无血清培养基的制备方法同实施例1。

实施例3

一种用于诱导多能干细胞的无血清培养基，由基础培养基，添加在基础培养基中的以下成分：胰岛素、二氯酚嗪、硫酸肝素糖蛋白、呋喃二烯、D-薄荷酮、卡瓦内酯、IFN-γ、EGF、柠檬酸锌组成；以终浓度计各组分的用量如下：胰岛素15μg/mL、二氯酚嗪4μg/mL、硫酸肝素糖蛋白20μg/mL、呋喃二烯5ng/mL、D-薄荷酮7ng/mL、卡瓦内酯15μg/mL、IFN-γ10ng/mL、EGF15ng/mL、柠檬酸锌17μg/mL。

上述用于诱导多能干细胞的无血清培养基的制备方法同实施例1。

对比例1

对比例1提供一种诱导多能干细胞的无血清培养基，和实施例1的区别为：省去二氯酚嗪，其余均和实施例1相同。

对比例2

对比例2提供一种诱导多能干细胞的无血清培养基，和实施例1的区别为：省去硫酸肝素糖蛋白，其余均和实施例1相同。

对比例3

对比例3提供一种诱导多能干细胞的无血清培养基，和实施例1的区别为：将硫酸肝素糖蛋白替换为转铁蛋白，其余均和实施例1相同。

对比例4

对比例4提供一种诱导多能干细胞的无血清培养基，和实施例1的区别为：省去卡瓦内酯，其余均和实施例1相同。

对比例5

对比例5提供一种诱导多能干细胞的无血清培养基，和实施例1的区别为：省去呋喃二烯，其余均和实施例1相同。

对比例6

对比例6提供一种诱导多能干细胞的无血清培养基，和实施例1的区别为：省去D-薄荷酮，其余均和实施例1相同。

对比例7

对比例7提供一种诱导多能干细胞的无血清培养基，和实施例1的区别为：省去呋喃二烯，将D-薄荷酮的用量调整为8ng/mL，其余均和实施例1相同。

对比例8

对比例8提供一种诱导多能干细胞的无血清培养基，和实施例1的区别为：省去柠檬酸锌，其余均和实施例1相同。

将诱导多能干细胞用实施例1至3，对比例1至8的培养基重悬，重悬后的细胞密度为1×10

表1

由表1可以看出实施例1至3的培养基用于传代培养得到的诱导多能干细胞的数量远远高于对比例1至8。对比例1至4中分别省去二氯酚嗪、硫酸肝素糖蛋白和卡瓦内酯中的一种，或者将硫酸肝素糖蛋白替换为转铁蛋白，制备的培养基在用于诱导多能干细胞的培养后，细胞的增殖速度明显不及实施例1至3，说明培养基中添加的二氯酚嗪、硫酸肝素糖蛋白和卡瓦内酯协同作用调控诱导多能干细胞的有丝分裂周期，加快细胞代谢，缩短细胞分裂周期，使细胞保持较高的增殖速度。

对比例5至8中分别省去呋喃二烯、D-薄荷酮、柠檬酸锌，以及将呋喃二烯省去后调整D-薄荷酮的用量，制备的培养基在用于诱导多能干细胞的培养时，细胞的增殖数量和实施例1至3相比均有不同程度的下降，说明本发明培养基中的呋喃二烯、D-薄荷酮协同作用，有助于诱导多能干细胞保持增殖活性和较好的生长状态，为保证细胞增殖的稳定性发挥作用。柠檬酸锌为细胞的增殖提供营养供给，和IFN-γ、EGF、基础培养基一起为诱导多能干细胞的增殖提供能量。

综上，本发明的无血清培养基在上述成分的共同作用下，成分明确，使用安全，可显著提高诱导多能干细胞的增殖效率，缩短诱导多能干细胞的培养时间，能在短时间内提供大量高质量的诱导多能干细胞，为诱导多能干细胞的临床应用提供保障。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。