一种果实挥发性成分的固相微萃取优化方法

技术领域

本发明涉及风味萃取技术领域，特别涉及一种果实挥发性成分的固相微萃取优化方法。

背景技术

冬瓜(Benincasa hispida Cogn.)属葫芦科冬瓜属一年生攀缘性草本植物，为夏秋季主要蔬菜之一。冬瓜原产于中国南部、东南亚以及印度等地，分布于亚洲的热带、亚热带及温带地区，由于其具有适应性广、抗逆性强、丰产稳产等特性，栽培范围广泛，经济价值较高。尽管冬瓜的品种较多，但绝大多数冬瓜品种的果实风味普通。近年来，育种工作者选育出具芳香型特征的冬瓜新品种--芋香冬瓜，皮色青绿美观，营养价值较高。芋香冬瓜极具特色，煮熟后香芋味更加浓郁，极具市场前景。芋香冬瓜是冬瓜中的稀有资源，由于品种的新颖性，口感的独特性，市场的广泛需求性，成为了冬瓜的高端品种。因此，芋香冬瓜是开展冬瓜香味性状研究的最佳材料，芋香冬瓜果实香气挥发性成分的综合分析也最能直观有效反映果实的风味特征，是评价果实风味品质特性最为重要的指标。但是目前还没有能够很好的萃取芋香冬瓜挥发性成分的有效方法。因此，需要寻找一种能够解决上述问题的方法。

发明内容

本发明的目的在于：针对提供一种最优萃取芋香冬瓜挥发性成分的方法，能够充分萃取芋香冬瓜的香气风味物质。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种果实挥发性成分的固相微萃取优化方法，包括以下步骤：

(1)样本采集：取待测样品成熟果实，取果实的果肉榨汁得到果汁，过滤，然后用移液管取过滤后的汁液置于样品瓶中，加入氯化钠和正己烷作为内标，4℃冷藏保存备用；

(2)固相微萃取：将步骤(1)中制备好的样品瓶加入磁力搅拌子，置于磁力加热装置卡槽内，并将萃取针头插入样品瓶中进行吸附，吸附完成后将萃取针头取出备用；

(3)气相色谱-质谱分析：将步骤(2)中吸附完成的萃取针头插入气相色谱-质谱分析仪的进样口中解吸后，启动仪器采集挥发性物质数据；

(4)二次响应面回归模型的建立：选取若干个影响萃取的因素，采用Des i gnExpert 8.0.6软件对步骤(3)中测定的挥发性物质总峰面积结果进行多元回归拟合分析，并分别建立回归模型；

(5)分析确定最佳工艺：对所得回归方程进行回归分析，以挥发性物质的总峰面积为目标变量，取当响应值达到最大值时所对应的因变量，为最佳工艺取值。

进一步地，在步骤(1)中，所述置于样品瓶中的汁液的量为6ml,所述氯化钠的加入量为2-4g,所述正己烷为2μL，浓度0.667g/ml。

进一步地，在步骤(2)中，所述磁力搅拌子为PTFE圆柱形磁力搅拌子，磁力搅拌转速为1800r/min，所述萃取针头在插入前需进行老化。

进一步地，所述老化是将萃取针头在250℃老化30min，所述吸附前先将萃取针头在62℃下平衡预热6.5min，萃取时间为43min。

进一步地，在步骤(3)中，所述解吸温度为250℃，解吸时间4.5min，所述色谱升温过程为柱温初始温度为45℃，保持3min，随后以5℃/min的速率上升至250℃，保持6min。

进一步地，所述质谱中离子源温度为240℃，接口温度为250℃，扫描模式为全扫35-500m/z。

进一步地，在步骤(4)中，所述因素包括预热时间、萃取温度、萃取时间和解吸时间。

进一步地，在步骤(5)中，所述因变量还可根据具体数值修正后得到便于实际操作的工艺参数。

香气物质研究的常规技术手段有固相微萃取(SPME)和气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)。固相微萃取(SPME)是一种新型实用的萃取技术，该技术集萃取，富集，进样于一体，具有操作简便，挥发性物质损耗小等特性，广泛用于气味分析等领域研究。气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)可以有效鉴别样品中所包含的挥发性物质，可以对挥发性物质进行定性和定量分析，目前已广泛用于南瓜、草莓、葡萄、芒果等果实香气物质的检测与鉴别研究。响应面分析法(RSM)是通过对回归方程的分析优化工艺参数预测响应值的一种统计方法，此方法可以直观的反应出不同因素之间对试验结果的交互影响，能有效弥补普通正交优化法在单因素条件下对试验结果的影响。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

(1)本发明在样本采集阶段将果实打成汁液后便于果肉中的风味物质充分挥发出来，且4℃冷藏保存可保持新鲜，防止变质；

(2)通过在萃取条件的优化过程中，结合响应面优化法，选取多个试验因素进行交叉分析，充分弥补了普通正交优化法在单因素条件下对试验结果影响的单一性，使得固相微萃取更加精准，对物质解析的程度更加全面；

(3)本发明将响应面优化法用于葫芦科作物果实中进行香味萃取，相对于现有的萃取方法增加萃取准确度。

附图说明

图1为萃取温度(B)和预热时间(A)对总峰面积的响应面；

图2为萃取温度(B)和预热时间(A)对总峰面积的等高线；

图3为萃取时间(C)和预热时间(A)对总峰面积的响应面；

图4为萃取时间(C)和预热时间(A)对总峰面积的等高线；

图5为解吸时间(D)和预热时间(A)对总峰面积的响应面；

图6为解吸时间(D)和预热时间(A)对总峰面积的等高线；

图7为萃取温度(B)和萃取时间(C)对总峰面积的响应面；

图8为萃取温度(B)和萃取时间(C)对总峰面积的等高线；

图9为萃取温度(B)和解吸时间(D)对总峰面积的响应面；

图10为萃取温度(B)和解吸时间(D)对总峰面积的等高线；

图11为解吸时间(D)和萃取时间(C)对总峰面积的响应面；

图12为解吸时间(D)和萃取时间(C)对总峰面积的等高线；

图13为挥发性成分总离子流色谱图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。

一、材料与方法

1.1原料与设备

本实施例取种植于广西南宁市的芋香冬瓜果实为试验材料。化学试剂：正己烷，天津富宇精细化工有限公司。

50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头，美国Supleco公司；固相微萃取(solid phasemicro extraction，SPME)系统包括手柄，GHAJ-5190-4048直型超高惰性衬管，石英毛细管柱HP-INNOWAX(60m×0.250mm×0.25um)，15mL专用固相微萃取样品瓶，Agilent 7890A-5975C气质联用仪，美国安捷伦科技有限公司；榨汁机JYL-C16V，九阳股份有限公司；移液枪(2.5uL，10ml)，德国Eppendorf。

1.2方法

1.2.1样本采集及处理

试验芋香冬瓜采样时间为授粉后30d的成熟果，选取长势基本一致，无病虫害的果实，进行3次生物学重复取样，取样后放入保鲜袋带回实验室，进行削皮、除瓤，果肉榨汁处理，用干净的三层纱布过滤得到芋香冬瓜果汁，用10ml移液枪吸取6ml过滤后的汁液置于15ml样品瓶，加入2.5g分析纯NaCl和2μL正己烷(0.667g/ml)作为内标，每个样品进行3个实验重复，4℃冷藏保存，备用。

1.2.2固相微萃取(SPME)

SPME条件：在制备好的样品瓶中加入PTFE圆柱形磁力搅拌子，将其置于磁力加热装置卡槽内，磁力搅拌转速为1800r/min。萃取针头为DVB/CAR/PDMS(50/30μm)，萃取前应先对萃取头进行老化，250℃老化30min。在62℃下平衡预热6.5min，萃取时间为43min，随后将吸附后的萃取头取出后插入气相色谱仪进样口，于250℃解吸4.5min，同时启动仪器采集数据。

1.2.3气相色谱-质谱(GC-MS)分析

色谱条件：色谱柱为HP-INNOWAX(60m×0.250mm×0.25um)，载气为氦气(99.999％)，分流比为：60:1，流速为1.2mL/min；进样模式为SPME手动进样；进样口温度为250℃；升温过程采用程序化升温：柱温初始温度为45℃，保持3min，随后以5℃/min的速率上升至250℃，保持6min。

质谱条件：电子电离源；电离能量为70eV；离子源温度240℃；接口温度250℃；扫描模式为全扫：35-500m/z。

1.2.4挥发性成分的定性定量方法

芋香冬瓜挥发性成分的定性：由GC-MS分析得到的质谱数据经计算机在NIST11及香精香料标准谱库的检索进行对比定性分析，选择匹配度得分大于80％的物质作为有效的香气物质，结合相关资料进行分析鉴定。

挥发性成分的定量：采用内标法进行定量分析，内标选用正己烷(0.667g/ml)，通过内标物的峰面积与各组分的峰面积比值，对挥发性物质进行定量检测。计算公式如下：

公式中：Ci为待测组分i的含量/(μg/ml)；Cs为加入内标物s的浓度/(g/ml)；Ai和As分别为待测组分i和内标物s的峰面积；Vs为内标物的体积/ml；V总为样品的总体积/ml。

1.3数据分析

利用Design-Expert 8.0.6Trial软件进行二次响应面回归模型的建立与分析；采用Masshunter定性分析软件对芋香冬瓜所采集到的全扫数据进行解卷积检索分析；利用EXCEL 2010进行数据收集和整理。

二、优化分析

2.1响应曲面法优化SPME

2.1.1二次响应面回归模型的建立与分析

响应面分析法(RSM)是通过对回归方程的分析、优化工艺参数预测响应值的一种回归拟合统计方法。因此，本研究以芋香冬瓜作试验对象，通过设置不同的条件参数指标，选择四个SPME参数条件(预热时间、萃取温度、萃取时间和解吸时间)进行优化处理，以香气物质的总峰面积Y作为考察指标。各因素水平表见表1，试验方案设计及结果见表2，共有29个试验点，其中零点实验有5个，以便最大化的减少试验误差，优化分析出考察对象的最佳反应条件，为芋香冬瓜果实内活性物质的鉴定和提取提供理论依据。

表1芋香冬瓜果实内活性物质测定条件优化Box-Behnken试验因素与水平

表2 Box-Behnken试验设计表与试验结果

采用Design Expert 8.0.6软件对表2中所测定的挥发性物质总峰面积结果进行多元回归拟合分析，并分别建立回归模型，得到香气物质的总峰面积Y与各因素变量之间二次方程模型为：Y＝8.844×10

对回归模型及各因素进行方差分析，结果见表3。结果分析可知：模型F＝51.29，p<0.0001表明模型高度显著；失拟项F＝2.15，p＝0.2403>0.05，说明模型失拟度不显著，模型的拟合程度良好；回归模型拟合度R

表3回归模型各项系数方差分析结果

注：*，差异显著(p<0.05)；**，差异极显著(p<0.01)

Note：*，significant difference(p<0.05)；**，extremely significantdifference(p<0.01)

2.1.2响应曲面分析

通过Design Expert 8.0.6软件分析，可以分析各因素在交互作用下对香气物质总峰面积的影响情况。对二次回归方程优化的响应面曲面及等高线见图1至图12，反映了预热时间(A)、萃取温度(B)、萃取时间(C)和解吸时间(D)四种因素在两两交互作用下对响应值的影响。等高线的形状为椭圆形表示各因素的交互作用显著，为圆形表示交互作用不显著。对图1至图12分析可知：6个响应曲面的开口均朝下，并且等高线的最小椭圆中心在选定图示的范围内，说明响应值在水平设计的范围内均存在最大值。由图1和图6可知，预热时间(A)与萃取温度(B)、解吸时间(D)之间的交互关系，在预热时间(A)一定时，挥发性物质总峰的面积随着萃取温度(B)和解吸时间(D)的增加先升高后下降，但这两种情况下两因素交互作用均不显著。由图7和图10可知，萃取温度(B)与萃取时间(C)、解吸时间(D)之间的交互关系，在萃取温度(B)一定时，物质总峰的面积随着萃取时间(C)和解吸时间(D)的增加先升高后下降，两因素交互作用显著。由图3、图4和图11、图12可知，萃取时间(C)与预热时间(A)、解吸时间(D)的交互关系，在萃取时间(C)一定时，物质总峰的面积随着预热时间(A)和解吸时间(D)的增加先升高后下降，两因素的交互作用显著。

2.1.3最佳提取工艺确定及验证试验

利用Design Expert 8.0.6软件对所得回归方程进行回归分析，以挥发性物质的总峰面积(Y)为目标变量，当响应值(Y)达到最大值时，所对应的因变量分别为A＝6.58，B＝61.77，C＝42.86，D＝4.51，此时Y＝907618000。考虑到实际操作的便利性，将最佳工艺参数修正为：预热时间(A)为6.5min、萃取温度(B)为62℃、萃取时间(C)为43min，解吸时间(D)为4.5min。在此条件下，进行三次重复性实验，实际测得总峰面积为8.6913×10

2.2芋香冬瓜挥发性成分分析

2.2.1挥发性成分总离子流图

试验采用GC-MS分析芋香冬瓜的挥发性成分，在最佳优化条件下测得挥发物成分的总离子流色谱图如图13，各挥发物出峰与分离情况均良好。

2.2.2挥发性成分的定性和定量

试验采用NIST11谱库检索系统与自动质谱解卷积鉴定系统(AMDIS)进行数据分析，由内标法计算各组分的含量。具体各类挥发性物质及含量见表4。

表3挥发性成分组成与含量

2.2.3挥发性成分分析

由表4得知，芋香冬瓜共检测出44种挥发性物质，挥发性物质类别主要以醛类、醇类物质为主，共鉴定出醛类物质15种，醇类9种，酮类、酯类、芳香类各4种，酸类3种，此外还有少量炔烃类物质和其他物质。

芋香冬瓜果实中醛类物质的种类和含量在总体香气化合物中占比最大。醛类在香气特征的描述中，通常被描述为新鲜植物和水果的香气，主要以C6醛为主，例如(E)-2-己烯醛、正己醛和(E，E)-2，4-己二烯醛，C6醛类物质使得果实呈现青香、青草气味。(E)-2-己烯醛，又称青叶醛，在挥发性物质中的含量最高，具有浓郁的青香和水果香，对整体香气贡献最大(于立志等，2015)。(E)-2-壬烯醛具有黄瓜味、烤肉味(杨帆等，2020)；苯甲醛具有苦杏仁味、樱桃及坚果香气(黄婧，2014)；壬醛具有强烈的油脂气味和甜橙等香气(陈慧敏等，2018)。

醇类化合物在芋香冬瓜中累计被检测出9种，主要以C6、C8醇为主，功能基中的羟基能使这些物质具有挥发性并呈现特征香气。包括正己醇、2-乙基己醇、正辛醇、1-辛烯-3-醇、(E)-2-己烯醇等，这些挥发性物质主要赋予果实青草味、青香味和花果香味(程焕，2017；LinaMayuoni-kirshinbaum et al.，2012；李华等，2007)。酸类化合物共检测出3种，酸类物质的含量均位于前列，棕榈酸含量位列第二，具有泥土气息；己酸具有果味、甜味、蜂蜜味、药味等多样的风味；硬脂酸具有牛油气味。

此外，经鉴定的酮类、酯类、芳香类均有4种，还有少量的炔烃类物质和其他物质，这些物质虽然含量较低，但对这些化合物在芋香冬瓜中均存在，可能也对芋香冬瓜的风味也作出了一定的贡献。

三、总结

本实施例采用响应面法优化出芋香冬瓜挥发性成分的最佳萃取工艺，最佳萃取结果：预热时间为6.6min、萃取温度为62℃、萃取时间为43min，解吸时间为4.5min。且各因素对挥发性物质的总峰面积影响程度依次为：萃取温度>解吸时间>预热时间>萃取时间。考虑到实际操作等问题，将萃取参数修正为：预热时间6.5min、萃取温度62℃、萃取时间43min，解吸时间4.5min。在此条件下，进行三次重复性实验，实际测得的挥发物种类为44种，总峰面积为8.6913×10

利用固相微萃取和气质联用技术，结合响应面优化的最佳萃取工艺，对芋香冬瓜挥发性物质进行解析，共检出44种挥发物，包含醛类15种，醇类9种，酮类4种、酯类4种、芳香4种，酸类3种，此外还有少量炔烃类物质和其他物质，其中对芋香冬瓜的香气成分起主要贡献物质的是醛类和醇类。

利用响应面法对芋香冬瓜挥发性物质的固相微萃取条件进行优化，结合气质联用技术对其挥发性成分进行定性和定量分析，可深度解析芋香冬瓜挥发性物质的具体成分，这对芋香冬瓜香气性状和品质的进一步挖掘具有重要意义。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。