一种促进胃肠活力的含益生菌及四重营养素的复合配方奶粉、存储方法及其质量控制方法

技术领域

本发明涉及一种含益生菌的儿童配方奶粉、存储方法及质量控制方法。

背景技术

在儿童成长领域，3-6岁被称作儿童成长发育的黄金期，快速的发育速度促使儿童新陈代谢更加旺盛，儿童配方奶粉依据其丰富且科学的配方组成，能作为儿童生长发育的主要补充食物。儿童配方奶粉中含有的牛乳、乳清蛋白、聚葡萄糖、低聚半乳糖、牛磺酸、维生素和矿物质等,保证儿童能够及时补充生长所需的各类营养物质。

乳铁蛋白是一种铁结合型糖蛋白，产生于哺乳动物体内腺上皮细胞和中性粒细胞，乳铁蛋白生物活性多样，研究表明其具有抑菌、抗病毒、抗癌、抗炎、调节免疫和促骨生长等。添加入儿童配方奶粉对儿童免疫体系完善具有重要意义，为儿童健康成长筑建起一道更加坚固的免疫防线。

磷酯酰丝氨酸作为磷脂家族中唯一能够调控细胞膜关键蛋白功能状态的稀少磷脂，被称为“脑的营养素”, 其含量约占人脑神经细胞膜中磷脂干重的50%。我国卫生部在2010年第15号公告中将来源于大豆的磷酯酰丝氨酸列为了新资源食品。多项研究证明了磷酯酰丝氨酸具有神经保护和抗氧化作用, 提高认知力、预防老年痴呆、抗抑郁、抗压抑、辅助激活酶等作用。因此，作为儿童配方奶粉的重要营养成分，其能促进儿童大脑发育，有效提高大脑机能。

叶黄素是一种天然存在的类萝卜素，它是视网膜中黄斑色素的重要组成部分，广泛的存在于大脑内的各个部分，其含量占脑部总类胡萝卜素的５９％，研究表明叶黄素浓度与婴儿大脑发育和老年人认知功能呈正相关。此外，叶黄素由于具有过滤蓝光、抗氧化、抗炎等作用在预防一些视网膜疾病如AMD、糖尿病视网膜病变、葡萄膜炎和光诱导视网膜变性等疾病中受到了广泛关注。综上所述，叶黄素能保护儿童视力发育。

益生菌是一类摄入足够剂量之后会对机体产生有益影响的活的微生物。目前大量的研究表明，益生菌制剂具有抗氧化、增强黏膜屏障功能、调节机体免疫反应和改善肠道菌群的组成等生物活性。其中针对物双歧杆菌BF-L01的研究进一步证明，BF-L01能够补充机体正常生理菌群，调整失衡的肠道菌群，提高儿童肠道活力。

尽管上述营养物质添加入儿童配方奶粉对儿童生长发育有显著的促进作用，根据文献报道、专利公开情况为依据进行分析，儿童配方奶粉仍有两方面问题需要被重视并得以解决。一方面，益生菌作为活体生物，与一般营养元素有显著差异，是否会在奶粉储存过程中菌浓度降低导致有效活性降低仍未明确；另一方面，还未有一种快速有效的检测方法能通过一次测定对多种重要营养素同时进行定性、定量测定，所以还未能以重要营养元素为对象建立质量控制体系。

发明内容

因此，本发明公开了一种方法能有效解决目前市面上含益生菌奶粉在存储过程中益生菌数量降低导致的生物活性降低的问题。

并进一步公开了对多种营养元素同时测定从而有效建立儿童配方奶粉质量控制体系的方法。

所述配方奶粉涉及含有磷酯酰丝氨酸、益生菌、叶黄素、乳铁蛋白的儿童配方奶粉。

所述益生菌指动物双歧杆菌。

所述的动物双歧杆菌的优选是动物双歧杆菌BF-L01。

所述的存储方法涉及配方奶粉中添加牛磺酸和左旋肉碱。

所述的质量控制方法为高效液相色谱法同时测定磷酯酰丝氨酸、叶黄素、维生素A、维生素D、维生素E。

本发明的有益效果：本发明首次公开了一种基于高效液相色谱法对儿童配方奶粉中重要营养素同时测定的质量控制方法和添加牛磺酸和左旋肉碱建立稳态微环境，保证含益生菌儿童配方奶粉中益生菌的数量及生物活性稳定。本发明预期为解决配方奶粉及含益生菌奶粉的存储方法、质量控制方法提供新的途径。

附图说明

图1为高效液相色谱法同时测定配方奶粉中维生素A、维生素D、维生素E、磷酯酰丝氨酸色谱结果；

图2为不同高效液相色谱仪同时测定配方奶粉中维生素A、维生素D、维生素E、磷酯酰丝氨酸色谱结果对比；

图3为高效液相色谱法同时测定10批配方奶粉中维生素A、维生素D、维生素E、磷酯酰丝氨酸色谱结果对比；

图4为奶粉存放7天后高效液相色谱法同时测定配方奶粉中维生素A、维生素D、维生素E、磷酯酰丝氨酸色谱结果对比；

图5为奶粉存放14天后高效液相色谱法同时测定配方奶粉中维生素A、维生素D、维生素E、磷酯酰丝氨酸色谱结果对比；

图中：1、维生素A对应色谱峰；2、维生素D对应色谱峰；3、维生素E对应色谱峰；4、磷酯酰丝氨酸对应色谱峰

具体实施方式

本发明通过下述实施方案对含益生菌的儿童配方奶粉的存储方法进行研究。

菌株：BF-L01，购自恒瑞生物有限公司。

培养基：90mmMRS琼脂培养基（法国梅里埃生物公司）。

方法：体外厌氧培养和活菌技术法比较放置一个月对不同配方奶粉中活菌数的影响

本发明通过下述实施方案对含益生菌的儿童配方奶粉的质量控制方法进行研究。

仪器和设备：

十万分之一电子分析天平（MS205DU，瑞士Mettler Toledo 公司）。

万分之一电子分析天平（ME204，瑞士Mettler Toledo 公司）。

超纯水器（Simplicity，美国密理博Millipore 公司）。

数控超声波清洗器（KQ500DE，昆山市超声仪器有限公司）。

电热恒温水浴锅（HWS24，上海一恒科技有限公司）。

旋转蒸发仪（SB-1200 水浴锅，N-1100）。

Ultimate 3000 DGLC高效液相色谱仪（美国Dionex 公司，DGP-3600SD 双三元泵、SRD-3600 脱气机、WPS-3000SL 自动进样器、TCC3000-RS 柱温箱、DAD 检测器、Chromeleon6.8 数据处理软件）。

Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司，G1311B 四元泵、G1329B 自动进样器、G1316A 柱温箱、G1315D DAD 检测器、ChemStation Edition 数据处理软件）。

恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）。

十万分之一电子分析天平（德国Satorius公司，BP211D型）。

高压灭菌锅（GR 60DA）。

超声波震荡清洗器（昆山超声仪器有限公司，KQ-250DE型）。

移液枪（法国Gilson公司），麦氏比浊仪（27208 densitometer densichek kit220，VITEK 2 DensiCHEK Plus）。

麦氏比浊管（法国梅里埃公司）。

细菌恒温培养箱（常州诺基仪器有限公司，HPX-9162MBE电热恒温培养箱）。

方法：高效液相色谱法同时测定维生素A、D、E以及磷酯酰丝氨酸的含量。

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案

实施例1儿童配方奶粉的营养成分检测。

儿童配方奶粉各项营养成分的检测方法请参照相应国家标准GB10767-2010,检测结果如表1所示。

配方中含有磷脂酰丝氨酸，又称复合神经酸，是细胞膜的活性物质，尤其存在于大脑细胞中。被誉为继胆碱之后的一大新兴的“智能营养素”。其功能主要是改善神经细胞功能，调节神经脉冲的传导，增进大脑专注力和记忆功能。配方中含有的叶黄素和维生素A，与助力视网膜成长，有效保护儿童视力发育。此外，多种复合维生素和矿物质多维协同，为骨骼成长提供强有力的营养保证。

表1 儿童配方奶粉的营养成分（每100克奶粉计）

实施例2高效液相色谱法对多种重要营养素同时测定。

1实验方法。

1）样品处理。

准确称取0.5g配方奶粉至50ml容量瓶中，加入25ml超纯水，震荡涡旋后超声混匀，加入25mL甲醇混合，过滤，移至5mL容量瓶中待用。

2）色谱条件。

Hitachi High-Tech C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.2% 甲酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱：0-2 min，5%A；2-28 min，5%-95%A；28-32min,95%A,32-35min,95%-5%A;35-40min,5%A检测波长为280 nm；柱温25 ℃；流速为1.0 mL/min；进样量20 μL。

2实验结果

如图1所示，依本实施例所述测定方法能同时测定配方奶粉中4种重要的营 养素的含量，测试方法简单实用，能为配方奶粉的质量控制标准建立提供有效的 检测手段和实验数据支持。为评价改色谱方法稳定性，本实施例进一步对方法重 复性、稳定性进行了评价了检测。

如图2所示，用两台高效液相色谱仪以实施例所述色谱条件、检测条件对相 同批次的配方奶粉进行关键营养素含量测定结果显示4种关键营养素出峰位置 及峰面积稳定性强，提示该方法能稳定、准确的对配方奶粉中的4种关键营养素 进行同时测定。

如图3所示，10批次配方奶粉中的测定结果对比发现，该方法重复率强，出 峰位置稳定，提示该方法能有效、准确的同时测定配方奶粉4种关键营养素，能 为奶粉的质量控制标准提供可信的实验支撑。

如图4、图5所示，与图1相比，常温、阴凉存储和环境下的配方奶粉其关 键营养素的性质、含量均为显著降低，提示本配方奶粉在常温阴凉存储环境下质 量稳定。

实施例3

完整成分(含牛磺酸、左旋肉碱)儿童配方奶粉的长期存储后益生菌数量测 定

1实验方法。

1）样品处理。

将完整成分待测样品按50g称取，无菌操作称取两份，一份直接进行活菌数测定，标记为第0天，另一份按照配方奶粉贮存和使用方法放在阴凉干燥通风处，室温放置。

2）奶粉中BF-L01细菌培养和活菌浓度计数方法。

取第0天的配方奶粉放置于室温下50分钟，使其与室温相同，无菌操作取20g样品溶解于180ml无菌生理盐水中，混合均匀，以10倍稀释法逐渐稀释，增加3个梯度浓度后分别去样品液100μL接种到MRS琼脂平板培养基中，37℃厌氧培养48h后选取菌落数落在30-300之间的培养皿进行单菌落技术，重复2次，结果记为两个平皿的平均数。于第30天对另一份待测样品进行菌落技术，实验步骤同上所述。

活菌数计算公式为活菌数量（cfu/g）=平板计数数量×稀释倍数×10。

2实验结果。

在室温条件下，含有牛磺酸和左旋肉碱完整成分配方奶粉BF-L01活菌数如表2所示。

表2的结果表明，在室温条件下，含有牛磺酸和左旋肉碱的儿童配方奶粉中益生菌BF-L01的活菌数随储存时间的延长而降低，但是仍处于相同数量级，稳定性较好，有报道表明加入牛磺酸的培养基能有效保证细菌生长，减少细菌凋亡，其机制可能与调节微环境稳态有关。此外，研究发现左旋肉碱在细胞超低温保存中能发挥作用，减少细胞损伤。综上所述，牛磺酸和左旋肉碱加入儿童配方奶粉中除起到营养作用外可能还能增强含益生菌儿童配方奶粉的稳定性，保证活菌数数量的稳定。

表2 完整配方奶粉保存时间30天BF-L01益生菌活菌数变化

实施例4不含牛磺酸、左旋肉碱的儿童配方奶粉的长期存储后益生菌数量测定。

不含牛磺酸、左旋肉碱的儿童配方奶粉的长期存储后益生菌数量测定。

1实验方法。

1）样品处理。

牛磺酸、左旋肉碱缺失儿童配方奶粉样品由湖南中牧乳业有限公司配置提供，将待测样品按50g称取，无菌操作称取两份，一份直接进行活菌数测定，标记为第0天，另一份按照配方奶粉贮存和使用方法放在阴凉干燥通风处，室温放置。

2）奶粉中BF-L01细菌培养和活菌浓度计数方法。

取第0天的配方奶粉放置于室温下50分钟，使其与室温相同，无菌操作取30g样品溶解于250ml无菌生理盐水中，混合均匀，以10倍稀释法逐渐稀释，增加3个梯度浓度后分别去样品液100μL接种到MRS琼脂平板培养基中，37℃厌氧培养48h后选取菌落数落在30-300之间的培养皿进行单菌落技术，重复2次，结果记为两个平皿的平均数。于第30天对另一份待测样品进行菌落技术，实验步骤同上所述。

2实验结果。

在室温条件下，不含牛磺酸和左旋肉碱完整成分配方奶粉BF-L01活菌数如表3所示。

表3的结果表明，在室温条件下，不含有牛磺酸和左旋肉碱的儿童配方奶粉中益生菌BF-L01的活菌数随储存时间的延长而降低，整体活菌数降低了1个数量级，提示与含有牛磺酸和左旋肉碱的完整成分益生菌添加儿童配方奶粉相比，不含有上述的益生菌儿童配方奶粉中益生菌的活菌数随时间降低有显著下降，提示配方中加入牛磺酸和左旋肉碱对益生菌活菌数的稳定性有显著提升，添加牛磺酸和左旋肉碱的益生菌活菌数更加稳定。

表3 不含牛磺酸、左旋肉碱配方奶粉保存时间30天BF-L01益生菌活菌数变化