一种吡嘧磺隆水解酶基因pyfE及其编码的蛋白与应用

技术领域

本发明涉及一种吡嘧磺隆水解酶基因pyfE及其编码的蛋白与应用。

背景技术

在我国，化学农药的使用是保证农产品产量的重要措施。磺酰脲类除草剂是目前世界上使用量最大的除草剂之一，具有高效广谱、对哺乳动物低毒、使用方式多样、品种多、针对性强、便于储存和运输等优点。虽然磺酰脲类除草剂具有许多其它种类除草剂无可比拟的优点，但部分磺酰脲类除草剂残留期较长，其在土壤中的残留累积严重，会对下茬作物产生药害，从而造成巨大的经济损失。

吡嘧磺隆是磺酰脲类侧链氨基酸合成抑制剂，具有活性高、传导速度快、持效期长的特点，主要用于水稻田的阔叶杂草、莎草等恶性杂草的防治，但吡嘧磺隆在土壤中的半衰期长，移动性较强，易对土壤和地下水造成污染，尤其在吡嘧磺隆生产企业排出的工业废水中，吡嘧磺隆含量较高，对环境与作物安全性的影响大。利用功能微生物修复污染环境是一种原位生物修复技术，具有高效、经济，无二次污染等特点，是土壤和水体有机污染物修复技术的主流和发展方向。近年来，国内外有关磺酰脲类除草剂在土壤中的微生物降解研究已有报道，参与降解磺酰脲类除草剂的微生物有真菌、细菌和放线菌。而关于吡嘧磺隆微生物降解的研究较少，降解过程中关键酶基因未有报道，代谢途径与降解机制尚不清楚，严重制约了吡嘧磺隆污染环境的修复及生态安全方面的研究。

发明内容

本发明的一个目的是要提供一种吡嘧磺隆水解酶基因pyfE及其编码的蛋白与应用，从而安全、快速地提高吡嘧磺隆降解效率。

特别地，本发明提供了一种吡嘧磺隆水解酶基因pyfE，用于编码吡嘧磺隆水解酶蛋白，所述水解酶基因pyfE的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.1。

本发明还提供了一种吡嘧磺隆水解酶蛋白PyfE，所述吡嘧磺隆水解酶蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.2。

本发明还提供了一种吡嘧磺隆水解酶基因pyfE的表达载体pET29a-pyfE的构建方法，包括以下步骤：

S1：设计一对用于水解酶基因pyfE核酸序列的特异性引物，正向引物引入了NdeⅠ酶切位点，反向引物引入了HindⅢ酶切位点；

S2：通过PCR扩增含有酶切位点的pyfE基因，所述pyfE基因不含有终止密码子；

S3：将S2的PCR产物用限制性核酸内切酶NdeⅠ和HindⅢ双酶切，并用凝胶回收试剂盒纯化；

S4：将S3的产物与经过同样双酶切处理的pET29a载体通过T4 DNA连接酶连接，从而获得重组表达载体pET29a-pyfE。

优选的，所述特异性引物为，

正向引物：

S-F:5’-CTGATTGCATATGGAAACTGACAACGTGGAGCT-3’；

反向引物：

S-R:5’-TACAAGCTTGCTTTCGTTCTGATCTAAGC-3’。

本发明公开的从吡嘧磺隆降解细菌BI-1克隆得到的水解酶基因pyfE，为首个吡嘧磺隆降解基因，断裂吡嘧磺隆侧链的酯键，形成相应的酸，对吡嘧磺隆微生物降解机制及生态安全方面的研究有重要的意义，也可以通过现代生物技术将降解基因导入作物中，构建抗吡嘧磺隆的转基因作物，有效解除药害。

本发明公开的吡嘧磺隆降解基因pyfE的基因工程菌构建方法，将表达载体pET29a-pyfE导入表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)，大量表达吡嘧磺隆水解酶PyfE，纯化后施用于吡嘧磺隆污染土壤，可以快速、高效的降解土壤中的吡嘧磺隆，维持玉米的正常生长。玉米的茎叶长、根长、茎叶鲜重与根鲜重因土壤中吡嘧磺隆的存在而显著下降，抑制率分别为71.5％、87.9％、73.2％和82.3％。当添加PyfE水解酶处理后的反应液，玉米生长的各项指标与对照没有显著差异，表明反应产物对玉米生长没有影响。该酶投入污染土壤中，可有效降解吡嘧磺隆残留，代谢产物对作物没有毒性，保证作物的正常生长，后续可制成酶制剂用于原位修复，具有十分良好的应用前景。

根据下文结合附图对本发明具体实施例的详细描述，本领域技术人员将会更加明了本发明的上述以及其他目的、优点和特征。

附图说明

后文将参照附图以示例性而非限制性的方式详细描述本发明的一些具体实施例。附图中相同的附图标记标示了相同或类似的部件或部分。本领域技术人员应该理解，这些附图未必是按比例绘制的。附图中：

图1是野生型菌株BI-1和突变菌株△BI-1对吡嘧磺隆降解效果的HPLC图，A：吡嘧磺隆对照；B：吡嘧磺隆+BI-1；C：吡嘧磺隆+△BI-1；

图2是吡嘧磺隆水解酶PyfE的SDS-PAGE图；

图3是温度对酶活力和稳定性的影响；

图4是pH对酶活力和稳定性的影响。

图5是金属离子和化学试剂对酶活性的影响；

图6PyfE水解酶降解吡嘧磺隆的代谢途径，A：吡嘧磺隆一级质谱；B：吡嘧磺隆二级质谱；C：产物一级质谱；D：产物二级质谱。

具体实施方式

吡嘧磺隆水解酶基因pyfE，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，1197bp。

吡嘧磺隆水解酶PyfE的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，398aa。

BI-1，鉴定为Chenggangzhangella属的一株细菌，2019年7月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2019586。

本发明的目的是针对现有吡嘧磺隆微生物降解机制研究的缺乏，从菌株BI-1中克隆得到一个水解酶基因pyfE，该基因为第一个报道的关于吡嘧磺隆微生物降解的基因，其长度为1197bp，该基因编码的水解酶PyfE在40℃以下比较稳定，酶活力保持原有的70％以上。从40℃开始酶活力急剧下降，70℃时完全丧失活性。最适温度实验表明PyfE在15℃以下酶活力较低，随着温度的升高酶活力逐渐升高。在35-50℃之间的活性都很强，最适温度为40℃。在pH 6.0-9.0范围内PyfE比较稳定，相对酶活力仍有80％以上，在pH 7.5-8.0时最稳定。而在pH大于9.0或者小于5.0时，PyfE的相对酶活力急剧下降，pH 4.0时酶活力基本丧失。在pH 7.0～8.0范围内PyfE酶活力均较强，最适反应pH为7.5。1mM的Ag

吡嘧磺隆水解酶基因pyfE，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，长度1197bp。

ATGGAAACCGATAAAAAAACCGGAACGTCCCGCAGATCATTTGTGAAGGCTGCTGGAACCGGCGCAATAGGAATAGCGACGCTGCCGCTTTCGACTGCAACTGCTTTCGCGGAAACTGACAACGTGGAGCTTGCCCAATCGAAGCGGAAGGTTGTCCTTGCTGAACAAGGCAGTTTCTACATCGGGGGCAGAACAGTAACCGGGCCTGGAAAATTCGATCCGTCAAAGCCGGTAATT

吡嘧磺隆水解酶PyfE的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，长度398aa。

METDKKTGTSRRSFVKAAGTGAIGIATLPLSTATAFAETDNVELAQSKRKVVLAEQGSFYIGGRTVTGPGKFDPSKPVI

实施例1

一、获得吡嘧磺隆高效降解菌株BI-1内的水解酶基因pyfE

本发明所用的菌株是由发明人分离得到的吡嘧磺隆高效降解菌株Chenggangzhangella sp.BI-1，在无选择压力的R2A固体平板上持续划线传代，得到一个突变菌株，如图1所示，该菌株无法降解吡嘧磺隆，将该菌株命名为△BI-1，同时对野生型菌株BI-1和突变菌株△BI-1的基因组进行测序，通过比较基因组学发现，在菌株△BI-1基因组中缺失的片段中有一个开放阅读框(ORF)，其长度为1197bp，在NCBI数据库比对结果中，与Hansschlegelia zhihuaiae S113中推定的水解酶基因sulE在核酸水平和氨基酸水平的同源性均为99％，特将此基因命名为pyfE。基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

实施例2

二、提供了pET29a-pyfE重组载体的构建方法与水解酶PyfE的纯化方法

以菌株BI-1总DNA为PCR模板，根据吡嘧磺隆水解酶基因pyfE核酸序列设计一对特异性引物：

正向引物为

S-F:5’-CTGATTGCATATGGAAACTGACAACGTGGAGCT-3’(引入了Nde Ⅰ酶切位点)；

反向引物为

S-R:5’-TACAAGCTTGCTTTCGTTCTGATCTAAGC-3’(引入了HindⅢ酶切位点)。

通过PCR扩增含有酶切位点的pyfE基因(不含有终止密码子TGA)，以便于通过酶切，形成粘性末端，与具有同样粘性末端的表达载体pET29a连接，从而表达C端含有6×His尾的PyfE融合蛋白。

将吡嘧磺隆水解酶基因pyfE的PCR产物用限制性核酸内切酶Nde Ⅰ和HindⅢ双酶切并用凝胶回收试剂盒纯化后，与经过同样双酶切处理的pET29a载体通过T4 DNA连接酶连接，从而获得重组表达载体pET29a-pyfE。

由于E.coli BL21(DE3)感受态细胞转化效率远远低于E.coli DH5α，因此先把pET29a-pyfE转化到E.coli DH5α细胞中，涂布在含50mg·L

选择序列正确的重组表达质粒pET29a-pyfE转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，构建表达菌株。涂布到LB(含50mg·L

NTA树脂再生前需要从层析柱下端流干所有的溶液，估计出NTA的树脂体积，按以下步骤将再生试剂加到层析柱里，待上一再生溶液流干后再加入下一再生溶液。步骤顺序如下：

加2倍体积剥镍缓冲液；加2倍体积的去离子水；加2倍体积剥镍缓冲液；加1倍体积25％的乙醇；加1倍体积50％的乙醇；加1倍体积75％的乙醇；加5倍体积100％的乙醇；加1倍体积75％的乙醇；加1倍体积50％的乙醇；加1倍体积25％的乙醇；加1倍体积的去离子水；加5倍体积剥镍缓冲液；加3倍体积的去离子水洗涤；加入5倍体积的荷电缓冲液；加入10倍体积的结合缓冲液，平衡树脂。

把10mL上清液(用结合缓冲液重悬，结合缓冲液中咪唑浓度为5mM)，分两次加到柱子中，调节流速大概为0.3-0.4mL·min

用10-20倍柱床体积的洗涤缓冲液(咪唑浓度为10mM)洗涤柱床。

关上流速阀，加入20倍柱床体积的洗脱缓冲液(咪唑浓度为100mM)，轻轻的搅动柱床，浸泡30min。

打开流速阀，开始洗脱，用5mL离心管收集穿过液，每2.5-3.0mL一管。

收集的样品将具有吡嘧磺隆水解酶酶活力的样品合并到一管中，采用Bradford方法测定蛋白浓度。用牛血清白蛋白作为标准蛋白质。由于镍离子对吡嘧磺隆水解酶的活力可能有一定的抑制作用，所以纯化后的蛋白需要通过透析去除镍离子。

由于大肠杆菌表达的吡嘧磺隆水解酶PyfE融合了6个His尾巴，可以通过Ni-NTA亲和层析柱对该蛋白实现纯化。纯化后的蛋白通过SDS-PAGE电泳，如图2所示，能得到清晰的目的条带，结合蛋白Marker可以判断，该水解酶单体的分子量约为41KDa，这与推测的蛋白大小基本一致。

实施例3

三、确定温度对PyfE水解酶的影响

以终浓度20μM的吡嘧磺隆作为底物，加入纯化后的PyfE至终浓度为0.02μg·mL

吡嘧磺隆浓度的测定(HPLC法)：向反应体系中加入25％的HCl调节至pH 2.0～3.0，加入等体积的二氯甲烷，充分震荡后静置分层，弃上层水相，有机相中加入过量无水硫酸钠去除多余水分，取5mL有机相至1.5mL离心管中，放置于通风橱中至溶剂完全挥发，然后用0.2mL甲醇浓缩重悬，并用0.22μm尼龙滤膜过滤后进行HPLC分析。液相色谱条件：液相色谱仪型号为岛津RID-10A；液相色谱柱为C18反相柱，规格为250mm×4.6mm×5μm；流动相为乙腈∶水∶乙酸(60∶40∶0.5)；柱温为40℃；流速1.0mL·min

如图3所示，吡嘧磺隆水解酶PyfE的热稳定性与最适温度。从结果可以看出，在40℃以下PyfE比较稳定，酶活力保持原有的70％以上。从40℃开始酶活力急剧下降，70℃时完全丧失活性。最适温度实验表明PyfE在15℃以下酶活力较低，随着温度的升高酶活力逐渐升高。在35-50℃之间的活性都很强，最适温度为40℃。

实施例4

三、确定pH值对PyfE水解酶的影响

根据常用缓冲液的可调范围：柠檬酸-氢氧化钠缓冲体系(pH 4.0-5.5)、磷酸盐缓冲体系(pH 5.0-8.0)、Tris-HCl(pH 7.5-9.0)、甘氨酸-氢氧化钠缓冲体系(pH 8.5-10.0)，调整缓冲液中不同组分比例，调节pH值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，终浓度统一调整为50mM，吡嘧磺隆作为底物，其终浓度为20μM，加入纯化后的PyfE至终浓度0.02μg·mL

如图4所示，吡嘧磺隆水解酶PyfE的酸碱稳定性与最适pH。从酸碱稳定性试验结果来看，在pH 6.0-9.0范围内PyfE比较稳定，在该pH范围内孵育纯化过的PyfE 1h后，相对酶活力仍有80％以上，在pH 7.5-8.0时最稳定。而在pH大于9.0或者小于5.0缓冲液中处理1h后PyfE的相对酶活力急剧下降，pH 4.0时酶活力基本丧失。在pH 7.0～8.0范围内PyfE酶活力均较强，最适pH为7.5。

实施例5

五、确定金属离子和化学试剂对PyfE水解酶的影响

在标准酶活反应体系中分别添加不同浓度的金属离子、表面活性剂、酶抑制剂和底物吡嘧磺隆，40℃水浴反应10min，HPLC定量检测吡嘧磺隆。实验同时设置不添加任何金属离子、表面活性剂、酶抑制剂的处理作为阴性对照。

如图5所示，1mM的Ag

实施例6

将上述纯化后的PyfE蛋白添加至10mL吡嘧磺隆反应体系中(50mM pH7.5的PBS缓冲液)，终浓度为0.02μg·mL

如图6所示，PyfE降解吡嘧磺隆的代谢途径，PyfE能断裂吡嘧磺隆苯环侧链的酯键，生成相应的酸，从而达到降解吡嘧磺隆的目的。

实施例7

取20目过筛后的自然风干菜地土壤450g(无吡嘧磺隆)至盆钵中，同时收集上述最适条件下酶反应后的反应液，浓缩，以不添加PyfE蛋白的反应液作为阴性对照，以不添加PyfE蛋白和吡嘧磺隆的反应液作为空白对照，加入盆钵，搅拌均匀，喷施水使其含水量达到饱和含水量的40％，将玉米幼苗移栽至不同处理的盆钵中，每个处理设置4个平行。置于人工气候培养箱(GXZ型智能光照培养箱，宁波江南仪器厂，GXZ-500D)中以30℃，12h光照和20℃，12h黑暗为一周期，培养10d。测定玉米茎叶长、根长、茎叶鲜重和根系鲜重。

表1 PyfE降解吡嘧磺隆代谢产物对玉米的毒性试验

注：不同字母代表在P<0.05水平差异显著(邓肯检验)

结果如表1所示，玉米的茎叶长、根长、茎叶鲜重与根鲜重会因为吡嘧磺隆而显著下降，抑制率分别为71.5％、87.9％、73.2％和82.3％，表明吡嘧磺隆对玉米的生长有明显的影响。当添加PyfE水解酶处理后的反应液，玉米生长的各项指标与对照没有显著差异，表明反应产物对玉米生长没有影响，从而表明该酶具有十分良好的应用前景，代谢产物对玉米没有毒性，可以通过制成酶制剂进行原位修复。

综上，本发明一方面在于吡嘧磺隆水解酶基因pyfE，为首个吡嘧磺隆降解基因，其本身的核苷酸序列可以用于构建抗吡嘧磺隆转基因作物，有效解除药害；另一方面提供了水解酶PyfE的纯化方法，投入污染土壤中，可有效降解吡嘧磺隆残留，保证作物的正常生长，后续可制成酶制剂用于原位修复。

至此，本领域技术人员应认识到，虽然本文已详尽示出和描述了本发明的多个示例性实施例，但是，在不脱离本发明精神和范围的情况下，仍可根据本发明公开的内容直接确定或推导出符合本发明原理的许多其他变型或修改。因此，本发明的范围应被理解和认定为覆盖了所有这些其他变型或修改。

序列表

<110> 南阳师范学院

<120> 一种吡嘧磺隆水解酶基因pyfE及其编码的蛋白与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1197

<212> DNA

<213> 一种吡嘧磺隆水解酶基因pyfE及其编码的蛋白与应用(pyfE)

<400> 1

atggaaaccg ataaaaaaac cggaacgtcc cgcagatcat ttgtgaaggc tgctggaacc 60

ggcgcaatag gaatagcgac gctgccgctt tcgactgcaa ctgctttcgc ggaaactgac 120

aacgtggagc ttgcccaatc gaagcggaag gttgtccttg ctgaacaagg cagtttctac 180

atcgggggca gaacagtaac cgggcctgga aaattcgatc cgtcaaagcc ggtaattcgt 240

gcctccaacg aaggtgccac gttttatatc aatcaaatgt acgtaaactt tcaagctcct 300

gtgcgccctc gtgggctgcc tctagtcttt tggcatgggg gcggactaac cggccatatc 360

tgggaatcta ccccagacgg ccgccccgga tttcagaccc tctttgttca agatcggcat 420

acggtctaca cgattgatca gccagggcgc ggaaggggca atattcctac ctttaatggc 480

ccttttgggc agttggaaga agagtcgatt gttaacactg ttaccgcaaa cgttagtaaa 540

gaacgcgcgt gggttagaga tcgactaggg cccgctcccg gccagttttt tgagaacagc 600

caattcccac gtggttatga agacaactac ttcaaggaga tggggttcag tccgtcgatc 660

tcatcagatg agatagtcga cgctgttgtt aaactagtaa ctcacatagg tccttgtgtt 720

ctggtgaccc attcggcttc cggagtactg ggcatgcgag tcgcgacagc ggccaagaac 780

gtgaggggga tcgttgctta tgagcctgcg acaagtatct ttcccaaagg aaaagtgcct 840

gagataccgc ctctcgccga taaaaagtcg caaattttcc cgccgttcga gatccaggag 900

tcttacttta agaagctcgc gaagataccc attcagtttg tcttcggaga taatatcccc 960

aagaacccta aatccgccta ttggttcttg gactggtgga gagtcactcg ctacgctcac 1020

agcttgtcac tcgaggctat caataagctc ggtggtcaag cgtctctttt ggatttgccg 1080

actgcgggac ttcgcggcaa cacgcatttt ccattcaccg accggaataa cgtgcaggtc 1140

gcttctctgt tatctgattt cctcggaaag cacggcttag atcagaacga aagctga 1197

<210> 2

<211> 398

<212> PRT

<213> 一种吡嘧磺隆水解酶基因pyfE及其编码的蛋白与应用(pyfE)

<400> 2

Met Glu Thr Asp Lys Lys Thr Gly Thr Ser Arg Arg Ser Phe Val Lys

1 5 10 15

Ala Ala Gly Thr Gly Ala Ile Gly Ile Ala Thr Leu Pro Leu Ser Thr

20 25 30

Ala Thr Ala Phe Ala Glu Thr Asp Asn Val Glu Leu Ala Gln Ser Lys

35 40 45

Arg Lys Val Val Leu Ala Glu Gln Gly Ser Phe Tyr Ile Gly Gly Arg

50 55 60

Thr Val Thr Gly Pro Gly Lys Phe Asp Pro Ser Lys Pro Val Ile Arg

65 70 75 80

Ala Ser Asn Glu Gly Ala Thr Phe Tyr Ile Asn Gln Met Tyr Val Asn

85 90 95

Phe Gln Ala Pro Val Arg Pro Arg Gly Leu Pro Leu Val Phe Trp His

100 105 110

Gly Gly Gly Leu Thr Gly His Ile Trp Glu Ser Thr Pro Asp Gly Arg

115 120 125

Pro Gly Phe Gln Thr Leu Phe Val Gln Asp Arg His Thr Val Tyr Thr

130 135 140

Ile Asp Gln Pro Gly Arg Gly Arg Gly Asn Ile Pro Thr Phe Asn Gly

145 150 155 160

Pro Phe Gly Gln Leu Glu Glu Glu Ser Ile Val Asn Thr Val Thr Ala

165 170 175

Asn Val Ser Lys Glu Arg Ala Trp Val Arg Asp Arg Leu Gly Pro Ala

180 185 190

Pro Gly Gln Phe Phe Glu Asn Ser Gln Phe Pro Arg Gly Tyr Glu Asp

195 200 205

Asn Tyr Phe Lys Glu Met Gly Phe Ser Pro Ser Ile Ser Ser Asp Glu

210 215 220

Ile Val Asp Ala Val Val Lys Leu Val Thr His Ile Gly Pro Cys Val

225 230 235 240

Leu Val Thr His Ser Ala Ser Gly Val Leu Gly Met Arg Val Ala Thr

245 250 255

His Ala Lys Asn Val Arg Gly Ile Val Ala Tyr Glu Pro Ala Thr Ser

260 265 270

Ile Phe Pro Lys Gly Lys Val Pro Glu Ile Pro Pro Leu Ala Asp Lys

275 280 285

Lys Ser Gln Ile Phe Pro Pro Phe Glu Ile Gln Glu Ser Tyr Phe Lys

290 295 300

Lys Leu Ala Lys Ile Pro Ile Gln Phe Val Phe Gly Asp Asn Ile Pro

305 310 315 320

Lys Asn Pro Lys Ser Ala Tyr Trp Phe Leu Asp Trp Trp Arg Val Thr

325 330 335

Arg Tyr Ala His Ser Leu Ser Leu Glu Ala Ile Asn Lys Leu Gly Gly

340 345 350

Gln Ala Ser Leu Leu Asp Leu Pro Thr Ala Gly Leu Arg Gly Asn Thr

355 360 365

His Phe Pro Phe Thr Asp Arg Asn Asn Val Gln Val Ala Ser Leu Leu

370 375 380

Ser Asp Phe Leu Gly Lys His Gly Leu Asp Gln Asn Glu Ser

385 390 395