一种多酶连体纳米反应器的制备方法及其在同步合成上的应用

技术领域

本发明涉及多酶反应器领域，具体涉及一种多酶连体纳米反应器的制备方法及其在同步合成上的应用。

背景技术

生物制造具有低碳循环、绿色清洁等特征，在化工、医药、能源、食品和农业领域应用广泛，具有巨大的经济潜力和研究价值，产生了显著的经济和社会效益，推动了传统产业的转型升级。其以生物质为原料，通过微生物或酶催化转化技术，合成高价值化学品，具有广阔的发展前景，现成为国民经济新的增长点发明内容。

生物脱羧反应技术路线优势明显，与化学脱羧相比，其反应条件更温和、选择性更高，过程也绿色友好，如戊二胺、丁二胺和乙醇胺等大多数都是氨基酸及其衍生物通过生物脱羧获得。过程中存在CO

赖氨酸脱羧酶（Lysine decarboxylase，CadA）通过生物脱羧可以将L-赖氨酸直接转化为1，5-戊二胺，同时释放CO

发明内容

针对赖氨酸脱羧酶催化快速释放的CO

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种多酶连体纳米反应器的制备方法，针对不同酶的催化特性利用纳米材料定向构建具有不同催化功能的纳米隔室，然后利用聚合物材料构建依据不同催化功能的纳米隔室有序分布的多酶连体纳米反应器，多酶整体反应器纳米隔室的数量取决于不同类型的多酶催化特征，其数量大于等于2。

上述多酶连体纳米反应器的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，将赖氨酸脱羧酶和碳酸酐酶混合溶于去离子水中，搅拌均匀后，加入咪唑类化合物和金属离子A，搅拌5-10 min，再加入有机胺、孔修饰剂和亲水试剂，继续搅拌，洗涤干燥得纳米隔室A，所述赖氨酸脱羧酶和碳酸酐酶的质量比为1-100：10；

步骤2，将甲酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶和NADH按照质量比溶于去离子水中搅拌均匀，加入咪唑类化合物和金属离子B，搅拌5-10 min，加入阳离子聚合物和孔修饰剂，继续搅拌，洗涤干燥得纳米隔室B，甲酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶的质量比为1-100：10；

步骤3，以内径为0.1mm-100 mm的中孔通道为整体反应器的容器，聚合物材料作为整体反应器构建材料，将纳米隔室A和纳米隔室B按照长度比分布在整体反应器中，得到多酶整体反应器。

作为改进的是，所述纳米材料为MOFs材料或COFs材料。

作为改进的是，步骤1中，赖氨酸脱羧酶和碳酸酐酶的质量比为1-9：3，二甲基咪唑和金属离子A的摩尔比为4：1；金属离子A为钴离子、铜离子或锌离子，有机胺为聚乙烯亚胺，孔修饰剂为十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）或聚乙烯吡咯烷酮（PVP），亲水试剂为聚乙二醇，搅拌时间为30min。

进一步改进的是，步骤1中赖氨酸脱羧酶和碳酸酐酶的质量比为1：1。

作为改进的是，步骤2中甲酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶的质量比为1-9：3，所述二甲基咪唑和金属离子B的摩尔比为4：1；搅拌时间为1 h；金属离子B为钴离子、铜离子或锌离子；阳离子聚合物为聚丙烯酰胺或聚乙烯亚胺；孔修饰剂为十六烷基三甲基溴化铵或聚乙烯吡咯烷酮。

作为改进的是，步骤3中聚合物材料为表面活性剂-金属离子凝胶，或聚甲基丙烯酸-丙烯酰胺凝胶；中孔通道的材质为玻璃、金属或聚合材料，内径为1mm -10 mm。

作为改进的是，步骤1和步骤2中所述咪唑类化合物为二甲基咪唑、巯基咪唑、乙基咪唑或羧基咪唑。

上述多酶连体纳米反应器在连续同步合成戊二胺和甲酸上的应用。

具体的方法为：将赖氨酸溶液连续通入多酶连体纳米反应器中同步合成戊二胺和甲酸，所述的赖氨酸浓度为50-200g/L。

有益效果：

与现有技术相比，本发明一种多酶连体纳米反应器的制备方法及其在同步合成上的应用，具有如下优势：

一种多酶连体纳米反应器的制备方法，根据多种酶催化特征定向构筑不同催化功能的纳米隔室，实现不同催化功能的纳米隔室化，然后构建依据不同催化功能的纳米隔室有序分布的多酶连体纳米反应器，避免了多酶级联过程中不同反应之间的相互干扰，提高了反应效率；利用多酶整体反应器制备戊二胺和甲酸的方法，通过构建赖氨酸脱羧酶和碳酸酐酶共固定于亲水多孔结构的有机胺修饰的纳米隔室和甲酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶共固定于多孔结构的阳离子聚合物修饰的纳米隔室，同时将两种新功能的纳米隔室进行分区有序布置，制备成整体多酶反应器，促进CO

附图说明

图1为多酶连体纳米反应器的结构示意图。

图2为不同底物浓度对戊二胺和甲酸的影响。

图3为不同赖氨酸脱羧酶和碳酸酐酶质量比对戊二胺生成和CO

图4为不同甲酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶质量比对甲酸生成的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

一种多酶连体纳米反应器的制备方法，针对不同酶的催化特性利用纳米材料定向构建具有不同催化功能的纳米隔室，然后利用聚合物材料构建依据不同催化功能的纳米隔室有序分布的多酶连体纳米反应器，多酶整体反应器纳米隔室的数量取决于不同类型的多酶催化特征，其数量大于等于2。

上述多酶连体纳米反应器的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，将赖氨酸脱羧酶和碳酸酐酶混合溶于去离子水中，搅拌均匀后，加入咪唑类化合物和金属离子A，搅拌5-10 min，再加入有机胺、孔修饰剂和亲水试剂，继续搅拌，洗涤干燥得纳米隔室A，所述赖氨酸脱羧酶和碳酸酐酶的质量比为1-100：10；

步骤2，将甲酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶和NADH按照质量比溶于去离子水中搅拌均匀，加入咪唑类化合物和金属离子B，搅拌5-10 min，加入阳离子聚合物和孔修饰剂，继续搅拌，洗涤干燥得纳米隔室B，甲酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶的质量比为1-100：10；

步骤3，以内径为0.1 mm-100 mm的中孔通道为整体反应器的容器，聚合物材料作为整体反应器构建材料，将纳米隔室A和纳米隔室B按照长度比分布在整体反应器中，得到多酶整体反应器。

作为改进的是，所述纳米材料为MOFs材料或COFs材料。

作为改进的是，步骤1中，赖氨酸脱羧酶和碳酸酐酶的质量比为1-9：3，二甲基咪唑和金属离子A的摩尔比为4：1；金属离子A为钴离子、铜离子或锌离子，有机胺为聚乙烯亚胺，孔修饰剂为十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）或聚乙烯吡咯烷酮（PVP），亲水试剂为聚乙二醇，搅拌时间为30min。

进一步改进的是，步骤1中赖氨酸脱羧酶和碳酸酐酶的质量比为1：1。

作为改进的是，步骤2中甲酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶的质量比为1-9：3，所述二甲基咪唑和金属离子B的摩尔比为4：1；搅拌时间为1 h；金属离子B为钴离子、铜离子或锌离子；阳离子聚合物为聚丙烯酰胺或聚乙烯亚胺；孔修饰剂为十六烷基三甲基溴化铵或聚乙烯吡咯烷酮。

作为改进的是，步骤3中聚合物材料为表面活性剂-金属离子凝胶，或聚甲基丙烯酸-丙烯酰胺凝胶；中孔通道的材质为玻璃、金属或聚合材料，内径为1mm -10 mm。

作为改进的是，步骤1和步骤2中所述咪唑类化合物为二甲基咪唑、巯基咪唑、乙基咪唑或羧基咪唑。

上述多酶连体纳米反应器在连续同步合成戊二胺和甲酸上的应用。

具体的方法为：将赖氨酸溶液连续通入多酶连体纳米反应器中同步合成戊二胺和甲酸，所述的赖氨酸浓度为50-200 g/L。

实施例1 多酶连体纳米反应器催化生成戊二胺和甲酸。

1.1 纳米隔室A的构建

合成体系为10ml，分别取10mg的赖氨酸脱羧酶（得于表达大肠杆菌来源L-赖氨酸脱羧酶的BL21（DE3）/pCDF-duet-CadA菌株，已在专利CN201810195975.2中发表公开）和碳酸酐酶（购买于上海源叶生物科技有限公司，货号：s10157-50mg）溶于去离子水中，以300rpm搅拌1-2min，使反应溶液混合均匀，加入终浓度为160mM的二甲基咪唑和40mM的钴离子，提高搅拌速度到500rpm搅拌10min，加入终浓度为15mg/ml的聚乙烯亚胺，35mg/ml的聚乙烯吡咯烷酮和10mg/ml的聚乙二醇，搅拌30min，离心，取部分上清测定蛋白浓度，对沉淀用去离子水洗涤2-3次，使用真空冷冻干燥机进行干燥得到纳米隔室A。

1.2 纳米隔室B的构建

合成体系为10ml，分别取10mg的甲酸脱氢酶（购买于上海源叶生物科技有限公司，货号：s25081-50u）和谷氨酸脱氢酶（购买于上海源叶生物科技有限公司，货号：s10067-100ku）溶于去离子水中，以300rpm搅拌1-2min，使反应溶液混合均匀，加入终浓度为160mM的二甲基咪唑和40mM的锌离子，提高搅拌速度到500rpm搅拌10min，加入终浓度为20mg/ml的聚丙烯酰胺，35mg/ml的聚乙烯吡咯烷酮，搅拌30min，离心，取部分上清测定蛋白浓度，对沉淀用去离子水洗涤2-3次，使用真空冷冻干燥机进行干燥得到纳米隔室B。

1.3 多酶整体反应器的构建

取终浓度为50mM的表面活性剂（脱氧胆酸钠）和25mM的锌离子加入到20ml的去离子水中，以500rpm搅拌1h合成整体聚合物材料，取出聚合物材料，先在聚合物材料上层加入20mg的纳米隔室A，然后在聚合物材料下层加入40mg的纳米隔室B，得到多酶级联纳米反应器，如图1。

1.4 多酶整体反应器催化生成戊二胺和甲酸

反应体系为10ml，将80mg的多酶级联纳米反应器放入去离子水中，加入终浓度为0.1mM的PLP和终浓度为10mM的NADH，放入37℃的水浴锅中预热2-3min，加入终浓度为50g/l的L-赖氨酸盐酸盐溶液，放入37℃的摇床中反应5min，然后煮沸5min停止反应。

实施例2 分析方法进行比较

利用SBA-40E 双通道生物传感仪选择赖氨酸检测模式检测L-赖氨酸的消耗量，1,5-戊二胺浓度测定采用安捷伦1290液相色谱系统和安捷伦TC-C18 色谱柱（4.6×250mm)。柱温40±1℃，流速1.0mL·min

实施例3

将L-赖氨酸盐酸盐的浓度从50g/l、100 g/l调整至200g/l，其余同实施例1。通过液相色谱仪检测戊二胺生成量和甲酸生成量，通过生成碳酸钙的质量检测CO

实施例4

将赖氨酸脱羧酶和碳酸酐酶质量比分别设为1：3、1：2、1:1、2：1、3：1，其余同实施例1。通过液相色谱仪检测戊二胺生成量，通过生成碳酸钙的质量检测CO

实施例5

将甲酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶质量比分别设为1：3、1：2、1:1、2：1、3：1，其余同实施例1。通过液相色谱仪检测甲酸生成量，结果如图4所示，甲酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶质量比为1：1时甲酸的生成量为87%，两者质量比的变化对甲酸生成量的影响不大。

综上所述，本发明一种多酶连体纳米反应器的制备方法及其在连续同步合成上的应用，通过构建赖氨酸脱羧酶和碳酸酐酶共固定于亲水多孔结构的有机胺修饰的纳米隔室和甲酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶共固定于多孔结构的阳离子聚合物修饰的纳米隔室，同时将两种新功能的纳米隔室进行分区有序布置，制备成整体多酶反应器，促进CO