一种肝炎标志物快速检测的生物传感芯片的制备方法

技术领域

本发明属于肝炎生物检测芯片技术领域，涉及一种肝炎标志物快速检测的生物传感芯片的制备方法。

背景技术

肝炎是一种严重的肝脏疾病，由于过度饮酒、滥用药物和缺乏锻炼，肝炎的发生已逐渐频繁和年轻化。根据世界卫生组织在2020年世界肝炎日的报告，全世界有3.25亿人感染了乙型和丙型肝炎病毒，每年有90万人死于乙型和丙肝。肝炎是肝癌的主要病因，其是世界上死亡率最高的癌症之一，因此，对肝脏健康状况的诊断和筛查对于病情恶化前的早期治疗至关重要。谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）是两种存在于肝细胞中的酶，其在血液中的含量正常值为5-40U/L，而在肝脏中的含量是血液中的1000倍以上。当肝损伤发生时，血液中的ALT与AST含量迅速上升，因此两者被认为是肝炎的敏感标志物。

目前实验室中通常采用比色法、化学发光法、分光光度法、荧光法和色谱法等技术分析ALT和AST含量，然而检测过程周期过长，操作复杂，阻碍了这些技术的进一步临床应用；而医疗系统中采用的商业分析技术主要依赖于底物试剂盒和生化分析仪。尽管这两种常用的临床方法能够达到U（酶活单位）水平的检测，但是检测效率和操作便携性并不理想，无法实现肝炎标志物ALT和AST的快速分析，更无法在紧急情况下实时监测该两种标志物以评价病人的肝细胞损伤程度。

发明内容

本发明针对目前肝炎诊断过程中存在的耗时长、灵敏度低、步骤繁琐等问题，提出一种新型的肝炎标志物快速检测的生物传感芯片的制备方法及其应用。

为了达到上述目的，本发明是采用下述的技术方案实现的：

一种肝炎标志物快速检测的生物传感芯片的制备方法，其具体步骤如下：

（1）规整普鲁士蓝及类似物纳米立方颗粒的制备：将一定量的过渡金属盐以及表面活性剂充分溶解于去离子水中，制得普鲁士蓝反应溶液A；将过渡金属氰化钾溶解于去离子水中，获得澄清反应溶液B。将等体积的A与B直接混合并充分搅拌至均匀，置于恒定反应温度下进行普鲁士蓝及类似物（PBA）立方颗粒的生长。反应完成后将所得悬浮液离心并清洗以提取产物，而后在一定温度下干燥脱水，获得规整普鲁士蓝及其类似物纳米立方颗粒。

（2）多孔普鲁士蓝@金属氧化物复合材料的制备：称取一定质量步骤（1）中的PBA，均匀分散于1mL去离子水中，将所得分散液滴涂于导电载体基底表面。将室温下干燥24h后的导电基底转移到等离子体发生器中，负载材料的表面正对等离子体发生部件。等离子体发生器设置合适的工作电压产生等离子体轰击PBA表面，使局部的金属离子转化为金属氧化物并获得多孔结构，获得多孔普鲁士蓝@金属氧化物复合材料（PBA@MNO

（3）基于多孔普鲁士蓝@金属氧化物的印刷电极的制备：将步骤（2）中的PBA@MNO

（4）肝炎标志物传感电极的制备：配制一定浓度的谷氨酸氧化酶溶液以及酶交联溶液；将两者等体积混合后，取适量的混合物均匀涂覆于步骤（3）中所得印刷芯片的工作电极区域，干燥后得到用于肝炎标志物检测的生物传感器。

作为优选，步骤（1）中过渡金属盐为FeCl

作为优选，步骤（1）中A和B溶液混合后的反应时间为16-40h，反应温度为10-80℃；反应完成后悬浮液的离心速率为6000-9000 rpm，离心产物的干燥温度为40-80℃，干燥时间为12-24h。

作为优选，步骤（2）中称取的PBA质量为0.1-3g，所使用的导电载体为ITO导电玻璃、金片、铜片中的任意一种。

作为优选，步骤（2）中等离子体发生器的工作电压设置为24-60V，处理时间为1-9h，气氛为空气、氮气、氩气中的任意一种。

作为优选，步骤（3）中PBA@MNO

作为优选，步骤（4）中谷氨酸氧化酶溶液溶液的浓度为0.5-5U/mL；酶交联剂为EDC+NHS、壳聚糖、戊二醛中的任意一种，浓度为0.05-0.8 M；酶和交联剂混合物在单一芯片上的用量为1-100μL；干燥温度为2-20℃，干燥时间为6-30h。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

1. 本发明基于电化学生物传感技术，基于高性能核壳结构多孔普鲁士蓝及类似物@金属氧化物材料制备获得了高稳定性的生物传感芯片，表现出优异的电化学生物传感性能。

2. 基于高性能的传感芯片能够在1分钟内快速实现肝炎标志物-谷丙转氨酶与谷草转氨酶的精准快速检测，极大提升了肝炎疾病的诊断精准度和效率。

3. 该生物传感芯片在成分复杂的真实血清样本中仍能够对谷丙转氨酶和谷草转氨酶具有优异的选择性，抗干扰能力强，也能够实现谷丙转氨酶和谷草转氨酶的同时检测。

附图说明

图1为NiFe普鲁士蓝和多孔NiFe@NiFe

图2为基于多孔NiFe@ NiFe

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。

实施例1

一种肝炎标志物快速检测的生物传感芯片的制备方法，包括如下步骤。

（1）规整普鲁士蓝及类似物纳米立方颗粒的制备：配制普鲁士蓝反应溶液A，其中含有1mM NiCl

（2）多孔普鲁士蓝@金属氧化物复合材料的制备：称取0.1g步骤（1）中的NiCo-PBA，均匀分散于1mL去离子水中，将所得分散液滴涂于铜基底表面，在室温下干燥24h后将导电基底转移到等离子体发生器中，负载材料的表面正对等离子体发生部件。等离子体发生器设置60V的工作电压产生等离子体载氮气气氛下轰击NiCo-PBA表面，处理时间为1h，使局部的金属离子转化为金属氧化物并获得多孔结构，获得多孔普鲁士蓝@金属氧化物复合材料（NiCo-PBA@NiCo

（3）基于多孔普鲁士蓝@金属氧化物的印刷电极的制备：将步骤（2）中的NiCo-PBA@NiCo

（4）肝炎标志物传感电极的制备：配制5U/mL的谷氨酸氧化酶溶液以及0.8M EDC+NHS混合溶液；将两者等体积混合后，取1μL的混合物均匀涂覆于步骤（3）中所得印刷电极芯片的工作电极区域，在2℃干燥30h后得到用于肝炎标志物检测的生物传感器。

采用上海辰华CHI660E电化学工作站的差分脉冲技术进行芯片对谷丙转氨酶和谷草转氨酶的性能测试，电压变化范围为-0.2-0.6V，增幅为0.005V，将印刷芯片的三电极触点分别与电化学工作站上相应的电极线连接。在常规的测试条件下，所得传感印刷芯片对谷丙转氨酶和谷草转氨酶的检测灵敏度分别为：谷丙转氨酶-156.22 nA·L·cm

在此基础上，将印刷芯片用于真实血样中谷丙转氨酶与谷草转氨酶含量的检测。首先从获得的全血样本中提取血清，将一定量的血清加入检测体系中，获取了添加血清前后检测信号的差异，并通过检测标准曲线获得谷丙转氨酶和谷草转氨酶在真实血样中的浓度。检测结果见表1，利用该检测芯片能够准确报告全血中谷丙转氨酶与谷草转氨酶的含量，其检测结果与商品化的生化分析仪相一致，且检测误差较小，表明该芯片能够在复杂的血清环境中实现两种肝炎标志物的精准检测，表现出优异的抗干扰能力和广阔的实际应用前景。

实施例2

本实施例及后续实施例中未特殊说明之处，与实施例1条件一致。本实施例提供一种肝炎标志物快速检测的生物传感芯片的制备方法，包括如下步骤。

（1）规整普鲁士蓝及类似物纳米立方颗粒的制备：配制普鲁士蓝反应溶液A，其中含有100mM FeCl

（2）多孔普鲁士蓝@金属氧化物复合材料的制备：称取3g步骤（1）中的FeFe-PB，均匀分散于1mL去离子水中，将所得分散液滴涂于导电玻璃基底表面。将干燥后的导电基底转移到等离子体发生器中，负载材料的表面正对等离子体发生部件。等离子体发生器设置24V的工作电压产生等离子体在空气中轰击FeFe-PB表面，处理时间为9h，使局部的金属离子转化为金属氧化物并获得多孔结构，获得多孔普鲁士蓝@金属氧化物复合材料（FeFe-PB@Fe

（3）基于多孔普鲁士蓝@金属氧化物的印刷电极的制备：将步骤（2）中的FeFe-PB@Fe

（4）肝炎标志物传感电极的制备：配制0.5U/mL的谷氨酸氧化酶溶液以及0.05M戊二醛溶液；将两者等体积混合后，取100μL的混合物均匀涂覆于步骤（3）中所得印刷芯片的工作电极区域，在20℃下干燥6h后得到用于肝炎标志物检测的生物传感器。

采用上海辰华CHI660E电化学工作站的差分脉冲技术进行芯片对谷丙转氨酶和谷草转氨酶的性能测试，电压变化范围为-0.2-0.6V，增幅为0.005V，将印刷芯片的三电极触点分别与电化学工作站上相应的电极线连接。在常规的测试条件下，所得传感印刷芯片对谷丙转氨酶和谷草转氨酶的检测灵敏度分别为：谷丙转氨酶-146.25nA·L·cm

在此基础上，将印刷芯片用于真实血样中谷丙转氨酶与谷草转氨酶含量的检测。首先从获得的全血样本中提取血清，将一定量的血清加入检测体系中，获取了添加血清前后检测信号的差异，并通过检测标准曲线获得谷丙转氨酶和谷草转氨酶在真实血样中的浓度。检测结果见表1，利用该检测芯片能够准确报告全血中谷丙转氨酶与谷草转氨酶的含量，其检测结果与商品化的生化分析仪相一致，且检测误差较小，表明该芯片能够在复杂的血清环境中实现两种肝炎标志物的精准检测，表现出优异的抗干扰能力和广阔的实际应用前景。

实施例3

一种肝炎标志物快速检测的生物传感芯片的制备方法，包括如下：

（1）规整普鲁士蓝及类似物纳米立方颗粒的制备：配制普鲁士蓝反应溶液A，其中含有30mM CoCl

（2）多孔普鲁士蓝@金属氧化物复合材料的制备：称取1g步骤（1）中的CoFe-PBA，均匀分散于1mL去离子水中，将所得分散液滴涂于金片基底表面。将干燥后的导电基底转移到等离子体发生器中，负载材料的表面正对等离子体发生部件。等离子体发生器设置48V的工作电压产生等离子体在氮气气氛下轰击CoFe-PBA表面，处理时间为6h，使局部的金属离子转化为金属氧化物并获得多孔结构，获得多孔普鲁士蓝@金属氧化物复合材料（CoFe-PBA@CoFe

（3）基于多孔普鲁士蓝@金属氧化物的印刷电极的制备：将步骤（2）中的CoFe-PBA@CoFe

（4）肝炎标志物传感电极的制备：配制2U/mL的谷氨酸氧化酶溶液以及0.2M 壳聚糖混合溶液；将两者等体积混合后，取30μL的混合物均匀涂覆于步骤（3）中所得印刷芯片的工作电极区域，干燥后得到用于肝炎标志物检测的生物传感器。

采用上海辰华CHI660E电化学工作站的差分脉冲技术进行芯片对谷丙转氨酶和谷草转氨酶的性能测试，电压变化范围为-0.2-0.6V，增幅为0.005V，将印刷芯片的三电极触点分别与电化学工作站上相应的电极线连接。在常规的测试条件下，所得传感印刷芯片对谷丙转氨酶和谷草转氨酶的检测灵敏度分别为：谷丙转氨酶-160.49nA·L·cm

在此基础上，将印刷芯片用于真实血样中谷丙转氨酶与谷草转氨酶含量的检测。首先从获得的全血样本中提取血清，将一定量的血清加入检测体系中，获取了添加血清前后检测信号的差异，并通过检测标准曲线获得谷丙转氨酶和谷草转氨酶在真实血样中的浓度。检测结果见表1，利用该检测芯片能够准确报告全血中谷丙转氨酶与谷草转氨酶的含量，其检测结果与商品化的生化分析仪相一致，且检测误差较小，表明该芯片能够在复杂的血清环境中实现两种肝炎标志物的精准检测，表现出优异的抗干扰能力和广阔的实际应用前景。

实施例4

本实施例和实施例3的不同之处在于，把A溶液中的CoCl

实施例5

本实施例和实施例3的不同之处在于，在多孔材料表面滴加的混合酶溶液量由30μL降低至5μL，其余条件保持不变。所得传感芯片对谷丙转氨酶和谷草转氨酶的检测灵敏度分别为：谷丙转氨酶-119.21nA·L·cm

实施例6

本实施例和实施例3的不同之处在于，获得CoFe-PBA纳米立方颗粒后不进行等离子体处理，直接按照实施例3中的相同的方式进行传感芯片的制备。所得传感印刷芯片对谷丙转氨酶和谷草转氨酶的检测灵敏度分别为：谷丙转氨酶-19.21nA·L·cm

实施例7

本实施例和实施例2的不同之处在于， B溶液中亚铁氰化钾的浓度由100 mM提升至200mM，其余条件保持不变。在此合成条件下无法形成规整立方结构的PB纳米颗粒，产物由大量团聚的大尺寸PB颗粒组成。基于该传感芯片对谷丙转氨酶和谷草转氨酶没有明显的信号响应。

从上述实施例中所得传感芯片的检测性能对比可以发现，传感材料的结构对于谷丙转氨酶和谷草转氨酶的检测性能起到至关重要的作用。在谷丙转氨酶与谷草转氨酶的检测过程分别需要加入辅助分子丙氨酸与天冬氨酸，在两种酶的催化作用下产生谷氨酸，在谷氨酸传感电极的识别作用下间接获取谷丙转氨酶与谷草转氨酶的含量信息。受制于两种转氨酶的催化效率和含量，通常由其催化作用得到的谷氨酸含量极低，因此常规的检测手段很难准确检测谷丙转氨酶与谷草转氨酶的含量，无法快速准确的进行肝炎诊断。

为了提升生物传感器对谷丙转氨酶与谷草转氨酶的检测能力，提高酶的负载量是一种有效的手段，然而受制于纳米材料的比表面积和酶分子的团聚效应，通常难以平衡酶的载量与催化活性之间的制约关系。为了解决这些问题，本发明选择普鲁士蓝及类似物（PB/PBA）作为研究对象，通过等离子体处理在普鲁士蓝表层原位获得多孔结构的金属氧化物，同时也在晶体内部保留了普鲁士蓝内核，极大提升了复合材料的比表面积和催化性能，为谷氨酸氧化酶的负载提供了大量的活性位点和空间；同时内部的PB/PBA作为一种天然的过氧化物酶，其能够高效催化酶反应产生的过氧化氢，起到检测信号传递和放大的作用。将所得核壳结构的多孔普鲁士蓝@金属氧化物复合材料用于传感芯片制备和检测时，大量的谷氨酸氧化酶被固定于多孔的金属氧化物外壳内，有利于低浓度谷丙转氨酶和谷草转氨酶的催化底物捕获；同时酶催化产生的过氧化氢会在多孔结构的通道内快速传递到内层PBA表面，产生并放大电化学响应信号。在这种核壳结构中，利用核层PB/PBA与壳层金属氧化物的协同效应，同步实现了生物酶的高载量以及均匀分布，强化了电化学生物传感器对谷丙转氨酶与谷草转氨酶的检测表现，极大增强了肝炎诊断效率。

由实施例1-4可以说明，使用等离子体处理不同种类的PB/PBA均能够获得核壳结构的多孔普鲁士蓝@金属氧化物复合材料，证明了该方法具有较好的普适性。

实施例5中降低酶的负载量并未造成明显的信号衰减，表明酶在复合材料中能够维持较好的催化性能，仅少量酶就能够对谷丙转氨酶和谷草转氨酶有明显的信号响应；尽管酶层的电导率低，而高酶负载量也并未影响检测信号，反而有一定性能提升，表明酶在材料表面分散性好，并未在材料上团聚而削弱检测信号传输能力。

实施例6中PBA未经过等离子体处理，相比于多孔普鲁士蓝@金属氧化物复合材料而言，其传感芯片对谷丙转氨酶和谷草转氨酶的检测性能有明显降低；实施例7中不规整且大尺寸的团聚PB/PBA前驱体也无法获得性能优异的传感芯片，这两个实施例充分说明了PB/PBA表面多孔层的构建能够极大提升检测性能，同时规整且合适尺寸的传感材料也能够促进传感信号的传递以及生物识别反应。在优化后的制备条件下获得的传感芯片对谷丙转氨酶与谷草转氨酶具有优异的检测灵敏度：谷丙转氨酶可达160.49nA·L·cm

表1为实施例1-5制得的传感印刷芯片进行血清中ALT与AST的检测结果，其中ALT表示谷丙转氨酶，AST表示谷草转氨酶，参考数据来自迈瑞全自动生化分析仪。

表1 真实血样中肝炎标志物测试结果（谷丙转氨酶、谷草转氨酶）

从表1结果来看，实施例1-5制得的肝炎标志物检测芯片能够实现真实血清中ALT与AST的准确检测，具有极低的检测限和宽的线性范围，表现出优异的抗干扰能力。此外，所制备的传感芯片能够在4℃的PBS缓冲溶液中保存30天，其响应信号仍能够达到初始信号的95%，表现出优异的长期稳定性。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。