野大麦农杆菌介导的愈伤侵染方法

技术领域

本发明属于转基因技术领域，具体涉及野大麦农杆菌介导的愈伤侵染方法。

背景技术

野大麦(Hordeum brevisubulatium)是禾本科大麦属多年生草本植物，广泛分布于我国东北、华北、内蒙古、新疆等地，是重要的禾本科生态修复草与牧草。野大麦分蘖株丛密，再生能力强，生产性能较好；适应性强，具有耐寒、耐旱、耐盐碱等特性，在-40℃仍能安全越冬，对土壤要求不严格野大麦耐湿耐涝性较强，在低湿并有临时性积水的草甸黑土上生长良好，是盐化和碱化草甸草原的建群种。

近年来，利用CRISPR/Cas9技术对目标基因进行编辑已成为热点，野大麦具有较强的抗寒性和耐盐碱能力，是挖掘抗逆基因的优良种质资源，要想利用该技术，必须建立一套成熟的遗传转化体系。由于野大麦缺乏完整的遗传转化体系，功能基因组的研究暂时集中于基因克隆和载体构建，并且只能通过异源表达进行验证；同时，进行品种选育时无法利用基因编辑的方法获得转基因植株，在功能基因组研究和分子育种方面均受到较大的限制。

鉴于遗传转化体系的重要性，较多牧草的遗传转化体系已建立成功，包括柳枝稷、羊草、黑麦草、高羊茅等，然而，野大麦目前只有组培快繁体系的相关报道，遗传转化体系尚未报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种野大麦组培快繁及农杆菌介导的愈伤侵染方法。利用本发明所述方法能够获得野大麦快繁系数和分化率较高的再生苗，并能获得农杆菌介导的愈伤侵染体系。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

一种野大麦农杆菌介导的愈伤侵染方法，具体包括获得愈伤组织和农杆菌侵染

所述获得愈伤组织包括种子愈伤诱导和胚性愈伤系筛选；

所述种子愈伤诱导时的培养基为蔗糖30g·L

所述的胚性愈伤系筛选：获得的种子的愈伤组织后，将其放在MS+30g·L

所述的农杆菌侵染为活化PANIC6B农杆菌，取野大麦愈伤组织，放到OD＝0.3的侵染液中，侵染液配方为100μmol·L

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明首先通过提高野大麦再生培养基中的蔗糖浓度，建立了高效的再生体系，再生率为70％，快繁系数为35，可为其他禾本科牧草再生体系的建立提供借鉴及宝贵经验；其次，通过农杆菌侵染和调整共培养时间，侵染效率达34％；之后又确定了暗培养筛选压为15H；光分化筛选压为5H，这是目前野大麦未有的研究，可以为后期野大麦功能基因和分子育种研究奠定基础。

附图说明：

图1不同2,4-D浓度对应的出愈率和愈伤组织状态图；其中A为2,4-D浓度2mg·L

图2为野大麦种子胚性愈伤系的筛选图；A-E为不同愈伤系；F-J为A-E愈伤系对应的放大图。Bars＝5mm

图3野大麦胚性愈伤系的分化、生根图；其中，A为光照培养15天；B为光照培养25天；C为光照培养40天；D生根；E移栽

图4为12种添加不同浓度蔗糖和植物凝胶的分化培养基分化率统计结果图；其中，1为蔗糖30g·L

图5暗培养筛选压确定

图6光分化筛选压确定

图7农杆菌共培时间对侵染效率的影响

A-C为共培养3天、4天、5天的GUS染色情况；D-F为A、B和C中GUS染色阳性愈伤的对应放大图；G为侵染效率与共培养时间的关系图。不同小写字母表示不同处理间的差异显著(单因素方差分析，Duncan’s检验，P<0.05)。Bars＝100μm

具体实施方式

下面结合附图和实例对本发明做进一步详细说明。本发明英文缩写的中文释义如下：

2,4-D：2,4-二氯苯氧乙酸

KT：萘乙酸

AS：乙酰丁香酮

CH：水解酪蛋白

Agar：琼脂

Gus：β-葡萄糖苷酸酶

Hph：潮霉素

Timentin：特美汀

Kan：卡那霉素

Rif：利福平

MES：乙磺酸

实施例1、野大麦愈伤诱导的最适2,4-D浓度

在超净工作台中，将晾干的种子放在含有不同浓度2,4-D的愈伤诱导培养基上，2,4-D浓度设置3个梯度，分别为2mg·L

表1为不同2,4-D浓度对种子诱导率的影响

实施例2、胚性愈伤系筛选

出愈后将芽和种皮去除干净，只保留愈伤组织，将其放在MS+30g·L

实施例3、分化培养基筛选

分化培养基均为MS+2mg·L

实施例4、快繁系数统计

光照25天后，取已分化的愈伤组织，放入3个盛有分化培养基的培养皿中、每个培养皿放入5块，共15块(避开快繁系数最高和最低的愈伤组织)，将其置于显微镜下，用镊子剥开统计每块愈伤组织绿色分化芽数并取平均值，快繁系数为35，快繁系数较高有利于后期获得更多的阳性苗(图3中的B)。

实施例5、暗筛及光分化培养基筛选压确定

基础培养基为MS+2mg·L

光分化基础培养基为MS+2mg·L

实施例6、农杆菌侵染

活化农杆菌：将PANIC6B农杆菌从-80℃冰箱里取出，划线在相应抗性的农杆菌固体培养基(MS基础培养基，16g·L

实施例7、侵染愈伤组织并共培养：侵染愈伤组织为结构致密、带有颗粒感的胚性愈伤组织，将愈伤组织加到稀释好的菌液中，进行抽真空10分钟，超声5分钟，再抽真空10分钟，“抽-超-抽”结束后在超净台中倒掉多余菌液，用无菌滤纸吸干愈伤组织表面菌液并晾干，23℃培养箱暗培养，分别统计第3-7天的侵染效率。

实施例8、共培养条件确定：农杆菌侵染后部分愈伤组织GUS染色呈阳性，共培养3天侵染效率为22％左右，共培养4天侵染效率为27％左右，共培养5天后侵染效率为34％左右，共培养6天后侵染效率为36％-37％，共培养7天侵染效率与共培养6天持平，随着共培养时间的增加，侵染效率明显增加，但共培养第6天开始，侵染效率上升趋势减缓。将共培养4-7天的愈伤组织分别置于暗筛培养基上继代，结果发现共培养4天和5天的愈伤组织可正常进行继代，共培养6天和7天的愈伤组织农杆菌难以抑制，个别还长有霉菌，最终确定共培养最长时间为5天(图7)。

本发明首先通过提高野大麦再生培养基中的蔗糖浓度，建立了高效的再生体系，再生率为70％，快繁系数为35，可为其他禾本科牧草再生体系的建立提供借鉴及宝贵经验；其次，通过农杆菌侵染和调整共培养时间，侵染效率达34％；之后又确定了暗培养筛选压为15H；光分化筛选压为5H，这是目前野大麦未有的研究，可以为后期野大麦功能基因和分子育种研究奠定基础。