一种机械灌注液及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于器官保存技术领域，具体涉及一种机械灌注液及其制备方法和应用。

背景技术

目前的大鼠肾脏离体常温机械灌注方案主要有三种：一是采用超纯水溶解所需化学物质配制

[1]Czogalla J,Schweda F,Loffing J.The Mouse Isolated Perfused KidneyTechnique.J Vis Exp.2016Nov 17；(117):54712.doi:10.3791/54712.PMID:27911373；PMCID:PMC5226255.

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[6]Huijink TM,Venema LH,Posma RA,de Vries NJ,Westerkamp AC,Ottens PJ,Touw DJ,Nijsten MW,Leuvenink HGD.Metformin Preconditioning andPostconditioning to Reduce Ischemia Reperfusion Injury in an Isolated Ex VivoRat and Porcine Kidney Normothermic Machine Perfusion Model.Clin TranslSci.2021Jan；14(1):222-230.doi:10.1111/cts.12846.Epub 2020Jul 31.PMID:32702185；PMCID:PMC7877823.

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发明内容

本发明的目的在于提供一种维持大鼠肾脏离体状态下的生理功能，达到离体器官保存的目的离体肾脏机械灌注液。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一方面，提供一种离体肾脏机械灌注液，所述机械灌注液包括基础培养基、牛血清白蛋白、抗生素、全血、肝素。

在本发明的一些实施方式中，所述牛血清白蛋白的浓度为30-60g/L。

在本发明的一些实施方式中，所述肝素浓度为10-100U/ml。

在本发明的一些优选实施方式中，所述肝素浓度为10-50U/ml。

在本发明的一些更优选实施方式中，所述肝素浓度为10-30U/ml。

在本发明的一些实施方式中，所述抗生素包括青霉素和/或链霉素。

在本发明的一些实施方式中，所述青霉素的浓度为30-70U/mL；所述链霉素的浓度为30-70μg/mL。

在本发明的一些优选实施方式中，所述青霉素的浓度为40-60U/mL；所述链霉素的浓度为40-60μg/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述全血和基础培养基和的体积比为1：2～10。

在本发明的一些优选实施方式中，所述全血和基础培养基和的体积比为1：3～7。

在本发明的一些实施方式中，所述基础培养基为DMEM/F12培养基和/或RPMI-1640培养基。本发明发现，相对于现有技术中用于离体肾脏的多为William’sMedium E培养基和Krebs-Ringer bicarbonate(KRB)缓冲液，但申请人发现将其用于离体肾脏灌注，会导致肾小管损伤更严重，小球内有不明物质堵塞；而使用DMEM/F12培养基、RPMI-1640培养基则肾功能未见明显差异，小管重吸收功能正常，尿量正常。

目前已发表文献报道的器官离体常温机械灌注多采用大鼠洗涤红细胞或人工携氧剂(例如hemoglobin-based oxygen carrier,HBOC)，洗涤红细胞处理复杂，人工携氧剂费用高昂，本发明中可直接采用同种大鼠或小鼠全血，可以达到肾脏离体保存的要求。

在本发明的一些实施方式中，所述机械灌注液还包括肌酐。肌酐可反应肾小球滤过功能，不添加无法计算肌酐清除率，但不影响灌注体系的稳定、不影响灌注肾功能，可以根据灌注设备选择合适的肌酐浓度。

在本发明的一些实施方式中，所述肌酐的含量为0.2～100mg/dl。

在本发明的一些优选实施方式中，所述肌酐的含量为0.2～50mg/dl。

在本发明的一些优选实施方式中，所述肌酐的含量为0.4～10mg/dl。

在本发明的一些优选实施方式中，所述肌酐的含量为0.5～5mg/dl。

在本发明的一些优选实施方式中，所述肌酐的含量为0.5～1.5mg/dl。

在本发明的一些实施方式中，所述离体肾脏来源于大鼠或小鼠。当离体肾脏来源于大鼠时，采用同种大鼠全血；当离体肾脏来源于小鼠时，采用同种小鼠全血。

本发明的第二方面，提供本发明第一方面所述的机械灌注液在制备用于保存离体肾脏的产品中的应用。

本发明的第三方面，提供本发明第一方面所述的机械灌注液的制备方法，将所述牛血清白蛋白、抗生素、全血、肝素溶于所述基础培养基，然后调节pH至7.2～7.5，BE值为0±3mmol/L。

本发明的第四方面，提供一种离体肾脏的机械灌注方法，采用本发明第一方面所述的机械灌注液对离体肾脏进行灌注。可以用于离体肾脏的保存。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种离体肾脏机械灌注液及离体肾脏保存方法；在灌注液中，本发明创新性地采用DMEM/F12培养基和RPMI-1640培养基替代料现有技术中常用的William’sMedium E培养基，灌注效果更好，配制更加快捷方便，更加经济可行；使用本发明的灌注液可以维持大鼠肾脏离体状态下的生理功能，达到离体器官保存的目的；肾脏离体灌注期间灌注流量和压力稳定，肾动脉阻力低(灌注稳定后肾动脉阻力小于0.015mmHg/mL/min)；灌注中离体肾脏可以产生尿液，尿Na+重吸收分数不低于24％；尿液pH、尿K

附图说明

图1为实施例1中上机后大鼠肾脏外观。

图2为实施例1中的灌注肾动脉阻力统计。

图3为实施例1中的尿量统计。

图4为实施例1中的病理检测结果。

图5为实施例2中上机后大鼠肾脏外观。

图6为实施例2中的灌注肾动脉阻力统计。

图7为实施例2中的尿量统计。

图8为实施例2中的病理检测结果。

图9为对比例1中上机后大鼠肾脏外观。

图10为对比例1中的灌注肾动脉阻力统计。

图11为对比例1中的尿量统计。

图12为对比例1中的病理检测结果。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

青霉素-链霉素购买于Gibco公司，货号为15070063；其中青霉素浓度为5,000U/mL，链霉素浓度为5000μg/mL。灌注设备采用莱普晟医疗PU100小动物多器官灌注平台和卡川尔实验室蠕动泵，调节灌注流量至5-12ml/min、压力70-100mmHg、温度35-38摄氏度。

实施例1一种机械灌注液

1、灌注液成分包含：

(1)灌注晶体液：DMEM/F12培养基：50mL；牛血清白蛋白：2.5g(浓度：41.7g/L)；青霉素-链霉素：0.6ml(浓度青霉素：50U/mL，链霉素：50μg/mL)。

(2)大鼠全血：10ml；

(3)肝素：1250U(浓度20.8U/ml)；

(4)肌酐：1mg/dl。

上述灌注液可分为基础灌注液(包含除大鼠全血之外的其余成分)和大鼠全血，其中基础灌注液制备后可放置于4℃保存2月，大鼠全血则需要在灌注当日新鲜获取，两者混合后方可作为灌注液使用。其中基础灌注液的制备过程为：

1)在干净的50ml离心管内加入牛血清白蛋白2.5g，并加入培养基50ml，置于37摄氏度水浴锅中使之充分溶解；

2)将上述溶解完全的培养基转移至无菌操作台，用50ml注射器抽取全部溶液，并与0.22nm的针头滤过器相连接，将溶液滤过并转移至新的无菌的50ml离心管内；

3)在无菌台内，将0.6ml 100X的青霉素-链霉素和0.6ml 1mg/ml的肌酐加入培养基，配置完成，密封好后至4度冰箱保存备用。

2、实验过程

1)异氟烷诱导供血大鼠麻醉后，开腹分离大鼠腹主动脉，用24G Y型留置针从腹主动脉取血，取血注射器内预存有1250U肝素，总共获取10ml大鼠全血，置于4度冷藏备用；

2)异氟烷诱导供肾大鼠麻醉后，开腹分离左肾周组织，用26G留置针进行供肾输尿管插管；用24G Y型留置针从腹主动脉注入HCA保存液(4度预冷，含肝素1.25万U/500ml)，同时结扎肾上腹主动脉，开放肾静脉，待左肾灌注彻底、完全变白后，切除左肾至装有预冷HCA(4度预冷，不含肝素)的培养皿中，用24G直柄留置针外套管进行肾动脉插管，固定完成后，经肾动脉插管灌注HCA(4度预冷，不含肝素)10ml；

3)准备常温机械灌注管路及设备，预热水浴箱，混合基础灌注液(50ml)与大鼠全血(10ml)，测量灌注液基线：pH 7.127，BE-7，予添加5％ NaHCO

4)灌注过程中每半小时添加无菌水1ml，每小时根据尿量补充等体积培养基溶液。

3、检测指标：

3.1、宏观

细胞状态-动物状态：检测离体肾脏外观：是否出现肿胀、栓塞、淤血、肾表面出血等异常情况；

尿：外观、尿量。

3.2、微观：

3.2.1、损伤因子：KIM-1、NGAL等(采用ELISA损伤因子试剂盒)。

3.2.2、灌注液/尿液血气、生化：pH、PCO

采用Abbott手持式便携血气仪和配套芯片监测灌注液、尿液的血气和生化。

根据检测结果计算Na+、葡萄糖的重吸收情况，肌酐和K+的排泄情况，具体计算公式如下：

Na

葡萄糖重吸收分数：【(灌注液葡萄糖)-(尿液葡萄糖)】/(灌注液葡萄糖)*100％；

K

肌酐清除率：(尿液肌酐*尿量)/灌注液肌酐。

3.2.3、取灌注结束后组织浸入4％多聚甲醛固定液中，经包埋、切片、HE染色、PAS染色后观察组织病理结构。

4、结果显示：

4.1、灌注肾外观：肾组织未见明显肿胀、出血、梗死(图1)。

4.2、灌注肾动脉阻力结果见图2，可以看到灌注期间肾动脉阻力稳定，波动在0.01mmH/mL/min，说明肾灌注良好。

4.3、灌注液血气见表1，灌注期间灌注液血气波动小，说明内环境稳定。

表1灌注液pH及血气在灌注过程中的变化

4.4、尿量及肾功能见图3和表2，尿液低钠高钾，Na

表2尿液生化离子在灌注过程中的变化，肾功能相关指标

4.5、病理见图4，可见肾小管上皮细胞空泡化损伤视野少于20％，说明离体灌注对肾组织损伤较小。

实施例2

1、灌注液成分包含：

(1)灌注晶体液：RPMI-1640培养基：50mL；牛血清白蛋白：2.5g(浓度：41.7g/L)；青霉素-链霉素：0.6ml(浓度青霉素：50U/mL，链霉素：50μg/mL)。

(2)大鼠全血：10ml；

(3)肝素：1250U(浓度20.8U/ml)；

(4)肌酐：1mg/dl。

上述灌注液可分为基础灌注液(包含除大鼠全血之外的其余成分)和大鼠全血，其中基础灌注液制备后可放置于4℃保存2月，大鼠全血则需要在灌注当日新鲜获取，两者混合后方可作为灌注液使用。其中基础灌注液的制备过程为：

1)在干净的50ml离心管内加入牛血清白蛋白2.5g，并加入培养基50ml，置于37摄氏度水浴锅中使之充分溶解；

2)将上述溶解完全的培养基转移至无菌操作台，用50ml注射器抽取全部溶液，并与0.22nm的针头滤过器相连接，将溶液滤过并转移至新的无菌的50ml离心管内；

3)在无菌台内，将0.6ml 100X的青霉素-链霉素和0.6ml 1mg/ml的肌酐加入培养基，配置完成，密封好后至4度冰箱保存备用。

2、实验过程

1)异氟烷诱导供血大鼠麻醉后，开腹分离大鼠腹主动脉，用24G Y型留置针从腹主动脉取血，取血注射器内预存有1250U肝素，总共获取10ml大鼠全血，置于4度冷藏备用；

2)异氟烷诱导供肾大鼠麻醉后，开腹分离左肾周组织，用26G留置针进行供肾输尿管插管；用24G Y型留置针从腹主动脉注入HCA保存液(4度预冷，含肝素1.25万U/500ml)，同时结扎肾上腹主动脉，开放肾静脉，待左肾灌注彻底、完全变白后，切除左肾至装有预冷HCA(4度预冷，不含肝素)的培养皿中，用24G直柄留置针外套管进行肾动脉插管，固定完成后，经肾动脉插管灌注HCA(4度预冷，不含肝素)10ml；

3)准备常温机械灌注管路及设备，预热水浴箱，混合基础灌注液(50ml)与大鼠全血(10ml)，测量灌注液基线：pH 7.159，BE-9，予添加5％ NaHCO

4)灌注过程中每半小时添加无菌水1ml，每小时根据尿量补充等体积培养基溶液。

3、检测指标：

3.1、宏观：

细胞状态-动物状态：离体肾脏外观：检测离体肾脏外观：是否出现肿胀、栓塞、淤血、肾表面出血等异常情况；

尿：外观、尿量。

3.2、微观：

32.1、损伤因子：KIM-1、NGAL等(采用ELISA损伤因子试剂盒)。

3.2.2、灌注液/尿液血气、生化：pH、PCO

采用Abbott手持式便携血气仪和配套芯片监测灌注液、尿液的血气和生化。

根据检测结果计算Na+、葡萄糖的重吸收情况，肌酐和K+的排泄情况，具体计算公式如下：

Na+重吸收分数：【(灌注液Na+)-(尿液Na+)】/(灌注液Na+)*100％；

葡萄糖重吸收分数：【(灌注液葡萄糖)-(尿液葡萄糖)】/(灌注液葡萄糖)*100％；

K+重吸收分数：【(尿液K+)-(灌注液K+)】/(灌注液K+)*100％；

肌酐清除率：(尿液肌酐*尿量)/灌注液肌酐；

3.2.3、取灌注结束后组织浸入4％多聚甲醛固定液中，经包埋、切片、HE染色、PAS染色后观察组织病理结构。

4、结果

4.1、灌注肾外观：肾组织未见明显肿胀、出血、梗死(图5)。

4.2、灌注肾动脉阻力见图6，灌注期间肾动脉阻力稳定，波动在0.01mmH/mL/min，说明肾灌注良好。

4.3、灌注液血气见表3，灌注期间灌注液血气波动小，内环境稳定。

表3灌注液pH及血气在灌注过程中的变化

4.4、尿量及肾功能，尿量见图7，尿液生化离子在灌注过程中的变化，肾功能相关指标见表4，灌注期间肾功能良好，尿液低钠高钾，Na

表4尿液生化离子在灌注过程中的变化，肾功能相关指标

4.5、病理见图8，可见肾小管上皮细胞空泡化损伤视野少于10％，说明离体灌注对肾组织损伤较小。

对比例1

1、灌注液成分包含：

(1)灌注晶体液：William’s E培养基：50mL；牛血清白蛋白：2.5g(浓度：41.7g/L)；青霉素-链霉素：0.6ml(浓度青霉素：50U/mL，链霉素：50μg/mL)。

(2)大鼠全血：10ml；

(3)肝素：1250U(浓度20.8U/ml)；

(4)肌酐：1mg/dl。

上述灌注液可分为基础灌注液(包含除大鼠全血之外的其余成分)和大鼠全血，其中基础灌注液制备后可放置于4℃保存2月，大鼠全血则需要在灌注当日新鲜获取，两者混合后方可作为灌注液使用。其中基础灌注液的制备过程为：

1)在干净的50ml离心管内加入牛血清白蛋白2.5g，并加入培养基50ml，置于37摄氏度水浴锅中使之充分溶解；

2)将上述溶解完全的培养基转移至无菌操作台，用50ml注射器抽取全部溶液，并与0.22nm的针头滤过器相连接，将溶液滤过并转移至新的无菌的50ml离心管内；

3)在无菌台内，将0.6ml 100X的青霉素-链霉素和0.6ml 1mg/ml的肌酐加入培养基，配置完成，密封好后至4度冰箱保存备用。

2、实验过程

1)异氟烷诱导供血大鼠麻醉后，开腹分离大鼠腹主动脉，用24G Y型留置针从腹主动脉取血，取血注射器内预存有1250U肝素，总共获取10ml大鼠全血，置于4度冷藏备用；

2)异氟烷诱导供肾大鼠麻醉后，开腹分离左肾周组织，用26G留置针进行供肾输尿管插管；用24G Y型留置针从腹主动脉注入HCA保存液(4度预冷，含肝素1.25万U/500ml)，同时结扎肾上腹主动脉，开放肾静脉，待左肾灌注彻底、完全变白后，切除左肾至装有预冷HCA(4度预冷，不含肝素)的培养皿中，用24G直柄留置针外套管进行肾动脉插管，固定完成后，经肾动脉插管灌注HCA(4度预冷，不含肝素)10ml；

3)准备常温机械灌注管路及设备，预热水浴箱，混合基础灌注液(50ml)与大鼠全血(10ml)，测量灌注液基线：pH 7.142，BE-12，予添加5％ NaHCO

4)灌注过程中每半小时添加无菌水1ml，每小时根据尿量补充等体积培养基溶液。

3、检测指标：

1、宏观：

3.1、细胞状态-动物状态：离体肾脏外观：检测是否出现肿胀、栓塞、淤血、肾表面出血等异常情况；

尿：外观、尿量。

3.2、微观：

3.2.1、损伤因子：KIM-1、NGAL等(采用ELISA损伤因子试剂盒)。

3.2.2、灌注液/尿液血气、生化：pH、PCO

采用Abbott手持式便携血气仪和配套芯片监测灌注液、尿液的血气和生化。

根据检测结果计算Na

Na+重吸收分数：【(灌注液Na

葡萄糖重吸收分数：【(灌注液葡萄糖)-(尿液葡萄糖)】/(灌注液葡萄糖)*100％；

K+重吸收分数：【(尿液K

肌酐清除率：(尿液肌酐*尿量)/灌注液肌酐。

3.2.3、取灌注结束后组织浸入4％多聚甲醛固定液中，经包埋、切片、HE染色、PAS染色后观察组织病理结构。

4、结果

4.1、灌注肾外观：肾组织未见明显肿胀、出血、梗死(图9)。

4.2、灌注肾动脉阻力见图10，说明灌注期间肾动脉阻力较稳定，前3小时波动在0.01mmH/mL/min，第4小时阻力较前有所增高，总体肾动脉阻力低于0.02mmH/mL/min，肾灌注良好。

4.3、灌注液血气见表5，说明灌注期间灌注液血气波动小，内环境稳定。

表5灌注液pH及血气在灌注过程中的变化

4.4、尿量及肾功能，尿量见图11，肾功能见表6，尿液高Na+，Na+重吸收分数为负值，说明灌注期间肾小管功能较差。可见William’s E为主要成分的灌注液Na+重吸收功能差，肾功能不佳。

表6尿液生化离子在灌注过程中的变化，肾功能相关指标

4.5、病理结果中可见多数肾小球(80％)腔内可见PAS红染/HE呈灰蓝色物质堵塞(图12)，此外，小管上皮细胞空泡化、扁平化、肾小管扩张明显，说明使用该灌注液对肾组织损伤较重。

上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。