多种生物毒素检测芯片及其制作与检测方法

技术领域：

本发明涉及生物传感器与生物毒素检测技术领域，具体涉及一种多种生物毒素检测芯片及其制作与检测方法。

背景技术：

生物毒素是一类来源于动植物或者微生物的有毒物质，主要分为动物毒素、植物毒素、微生物毒素和海洋生物毒素。其中微生物毒素一般为微生物在生长过程中产生的次级代谢产物，如黄曲霉毒素M1(AFM1)、黄曲霉毒素B1(AFB1)、呕吐毒素(DON)和玉米赤霉烯酮毒素(ZEN)等。生物毒素可以通过特异性选择作用于细胞膜、离子通道、受体、核糖体蛋白等参与代谢过程，对其他生物体形成致死和毒害效应。

生物毒素与人们的健康和生命息息相关。在食品的生产、运输、消费及食用各个环节，均有可能产生生物毒素污染。人们食用受到生物毒素污染的食物后会出现中毒现象，更为严重的话，会危及生命。生物毒素作为影响食品安全的重要因素之一，对生物毒素进行高灵敏、特异性检测是保证人类生命健康和食品安全的重中之重。目前传统的生物毒素检测方法有免疫学方法、实时质谱分析法和气相液相色谱法等，而以上方法均存在检测过程耗时长、需要大型仪器以及专业操作人员等不足，难以在生产环节中对食品进行现场快速检测。

生物传感器因具有灵敏度高、检测快速等优点，非常适合对生物毒素进行实时监测及现场检测。目前，针对生物毒素检测的生物传感器大多采用适配体作为识别元件，对不同生物毒素进行特异性检测。如专利文献CN110632156A，开发了一种用于检测黄曲霉毒素B1的适配体传感器，在1×10

发明内容：

为克服上述问题，本发明采用微流控芯片与电化学检测技术相结合，提供一种基于掺硼金刚石薄膜的多种生物毒素联合检测微芯片，为食品安全监控领域提供一种方便快捷的检测手段。

本发明所要解决的技术问题是提供一种多种生物毒素检测芯片，可将多种生物毒素的检测功能集成于一体，如可将食品安全监控技术领域正常需要检测的四种生物毒素：黄曲霉毒素M1(AFM1)、黄曲霉毒素B1(AFB1)、呕吐毒素(DON)和玉米赤霉烯酮毒素(ZEN)的检测功能集成于一体，解决现有生物毒素检测装置结构复杂和步骤繁琐等问题，尤其为食品安全监控领域提供多种生物毒素检测准确、快速便捷的检测手段。本发明还提供此种多种生物毒素检测芯片制作方法，以及使用此种多种生物毒素检测芯片的检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明多种生物毒素检测芯片所采用的技术方案为：

一种多种生物毒素检测芯片，包括相互贴合的PDMS芯片层与微电极层，其特征在于，所述PDMS芯片层间隔开设进样孔与至少2个出样孔，所述PDMS芯片的贴合面，在进样孔与各出样孔之间分别开设凹坑，进样孔与各凹坑之间、各凹坑与其对应出样孔之间各自开设连接槽，并依次连接；所述PDMS芯片与微电极层贴合后，在微电极层上面，各连接槽形成流道，各凹坑形成检测腔；所述微电极层的贴合面上，在所述各检测腔贴合对应区域，分别设置有相应的薄层检测电极单元，各所述薄层检测电极单元包括工作电极与对电极；其中所述工作电极为由掺硼金刚石生成的BDD薄膜电极，所述各工作电极上分别修饰有与该工作电极所要检测的目标生物毒素对应的核酸适配体；所述对电极为由铂1000经溅射工艺形成的铂薄层电极。

以下为本发明多种生物毒素检测芯片进一步的方案：

所述PDMS芯片层开设1个位于PDMS芯片层中心位置的进样孔与围绕进样孔分居两侧的2个凹坑及对应的2个出样孔，分别形成2个检测腔；所述微电极层的贴合面上，在所述各检测腔贴合对应区域，分别设置有相应的2个薄层检测电极单元，所述目标生物毒素为黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素B1、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮毒素四种生物毒素中的其中2种，所述各工作电极上分别修饰有以上四种生物毒素中的其中2种对应的核酸适配体。

所述PDMS芯片层开设1个位于PDMS芯片层中心位置的进样孔与围绕进样孔分居3个凹坑及对应的3个出样孔，分别形成3个检测腔；所述微电极层的贴合面上，在所述各检测腔贴合对应区域，分别设置有相应的3个薄层检测电极单元，所述目标生物毒素为黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素B1、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮毒素四种生物毒素中的其中3种，所述各工作电极上分别修饰有以上四种生物毒素中的其中3种对应的核酸适配体。

所述PDMS芯片层开设1个位于PDMS芯片层中心位置的进样孔与围绕进样孔分居四周的4个凹坑及4个出样孔，分别形成4个检测腔；所述微电极层的贴合面上，在所述各检测腔贴合对应区域，分别设置有相应的4个薄层检测电极单元，所述目标生物毒素为黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素B1、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮毒素四种生物毒素，所述各工作电极上分别修饰有以上四种生物毒素对应的核酸适配体。

所述每个所述凹坑设置多个分流连接槽汇合后连接所述进样孔。

在所述微电极层(2)贴合面上，所述工作电极(7)末端连接其接线焊接块(11)，所述工作电极(7)包括方形主块(9)与向外延伸至其接线焊接块(11)的长直条(10)；所述对电极(8)末端也连接其接线焊接块(11)，所述对电极(8)呈围绕工作电极(7)方形主块(9)外的形态，并向外延伸至其接线焊接块(11)；所述工作电极(7)与对电极(8)末端的接线焊接块(11)均布置在所述微电极层(2)贴合面上的近边侧处。

为了解决上述技术问题，本发明多种生物毒素检测芯片的制作方法所采用的技术方案为：

以上所述的多种生物毒素检测芯片的制备方法，包括可不分先后各自进行的PDMS芯片层与微电极层的制备，以及制备好的PDMS芯片层与微电极层二者的键合；PDMS芯片层的制备包括：先是作为其成型模具的硅基片模具的制备，后是PDMS芯片层的制备；其特征在于：在制备好的PDMS芯片层与微电极层二者键合前，所述微电极层还需要为其工作电极进行核酸适配体修饰，构建特异性检测单元。

以下为本发明多种生物毒素检测芯片的检测方法进一步的方案：

所述微电极层工作电极进行核酸适配体修饰过程如下：滴加10μL金沉积液于工作电极表面，室温孵育4h，之后工作电极表面会沉积一层纳米金颗粒，所述金沉积液构成：0.5％w/v氯金酸HAuCl

所述硅基片模具的制备采用单面抛光的四寸单晶硅片作为模具基片，具体包括以下步骤：

步骤1.清洗，利用H

步骤2.涂胶，对基片进行涂胶，负胶SU8-2075，500r*30s，3000r*60s，厚50μm。

步骤3.前烘，热板温度95℃，时间45min。

步骤4.光刻，曝光时间为28s。

步骤5.后烘，烘箱温度95℃，时间7min。

步骤6.显影，显影时间5min，2100r*60s甩干。

步骤7.硬烘，150℃，15min。

最后就得到50μm高度微结构的硅基片模具。

所述PDMS芯片层的制备过程如下：

步骤1.将制备好的硅基片模具放入氟硅烷蒸汽箱中孵育4h，方便后续PDMS芯片的剥离；

步骤2.称量PDMS预聚物和固化剂，二者重量比10：1，将二者混匀，置于真空度为13psi的真空干燥器中静置30min，除去大部分气泡。

步骤3.将硅基片模具放置在水平台上，浇注PDMS混合物，静置30min，使微结构中充满PDMS。

步骤4.放入80℃烘箱中加热1h，待PDMS完全固化后，小心的将PDMS从硅片上剥离下来。

步骤5.采用针筒加特定孔径的针头，按照PDMS芯片上的进样口和出样口位置进行打孔。

步骤6.再按照切割线切割芯片，得到单个PDMS芯片，上下表面贴白膜保存。

所述微电极层的制备过程如下：

步骤1.选择单面抛光的整体四寸硅片作为基片，采用热氧化法制备2μm厚度的二氧化硅(SiO2)层作为绝缘隔离层。

步骤2.选择使用热丝化学沉积技术生长3-5μm金刚石膜。

步骤3.采用金属溅射技术制备厚度为450nm的Al掩膜层，再旋涂2.4μm厚LC100A4光刻胶，对Al层进行图形化。

步骤4.湿法腐蚀去除Al层，再使用氧等离子体干法刻蚀BDD区域得到BDD工作电极结构。

步骤5.采用金属溅射工艺，制备0.4μm厚的Pt1000层作为对电极结构；再利用丙酮去除光刻胶，制备完成Pt电极区域。

步骤6.按切割线划片切割得到单个的电极芯片；利用锡膏将连接导线焊接在每个电极单元的焊点处，切割前后均可。

所述制备好的PDMS芯片层与微电极层二者的键合过程如下：

将PDMS芯片上表面白膜撕掉，与所述微电极层一起放入等离子体清洗机清洗60s，再利用对准键和仪，按照对准标记将两部分键和在一起，即完成了整个芯片的制备。

为了解决上述技术问题，本发明多种生物毒素检测芯片的检测方法所采用的技术方案为：

一种多种生物毒素检测方法，使用以上所述的多种生物毒素检测芯片，先对经如上所述的多种生物毒素检测芯片按如下所述进行模拟测试过程，将所述多种生物毒素检测芯片进行测试标定，通过加入一系列包含有黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素B1、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮毒素四种生物毒素的至少一种并已知其浓度值的不同浓度的标准试样溶液，测得一系列不同数值的各工作电极单元的初始阻抗值Rct0与反应后阻抗值Rct，进行一系列的浓度梯度实验，得到一系列各生物毒素浓度值与对应工作电极单元的相对阻抗值y值数据，代入某种生物毒素浓度与相对阻抗值y值之间的线性关系式：y＝A+Blgx，式中，相对阻抗值y＝(Rct-Rct0)/Rct0，A与B为常数，x表示某种生物毒素浓度，lgx表示以10为底x的对数；经一系列计算得到各种生物毒素浓度与其相对阻抗值y值之间的线性关系式中的常数A与B的数值。

具体测试过程如下：(1)先从进样口加入10mM Fe(CN)

本发明是基于掺硼金刚石电极的多种生物毒素检测芯片，将生物毒素检测电极阵列与微流控芯片高效集成，实现了生物毒素的多指标联合和高灵敏度快速检测。

相比于现有技术，本发明具有如下优点及有益效果：

1.本发明开发了一种基于掺硼金刚石薄膜的微芯片，集成了多个检测腔及电极体系，实现了在一个芯片内同时检测四种生物毒素的功能，大大提高了生物毒素的检测效率。2.本发明利用半导体工艺制备微芯片，将工作电极和对电极集成于一体，可以实现批量制造，并采用化学沉积的方法在BDD电极表面沉积纳米金颗粒来提高适配体的固定量，可大大提高生物毒素的检测灵敏度。3.本发明多种生物毒素检测芯片适用范围广，可以在工作电极表面修饰其他种类识别元件，以用于其他类型的生物毒素检测。4.本发明检测准确、快速便捷，为食品安全监控领域提供多种生物毒素检测准确、快速便捷的检测手段。

附图说明

图1为本发明多种生物毒素检测芯片组装状态立体示意图。

图2为本发明多种生物毒素检测芯片PDMS芯片层与微电极层分离状态立体示意图。

图3为微电极层立体示意图。

图4为PDMS芯片层贴合面立体示意图。

附图标记：1.PDMS芯片层，2.微电极层，3.进样孔，4.出样孔，5.凹坑，6.连接槽,7.工作电极,8.对电极,9.方形主块,10.长直条,11.接线焊接块。

具体实施方式

以下结合附图进一步详细说明本发明的具体实施方式。

本发明多种生物毒素检测芯片，如图1、图2所示，包括相互贴合的PDMS芯片层1与微电极层2，PDMS芯片层1间隔开设进样孔3与至少2个出样孔4。如图2、图4所示，PDMS芯片的贴合面，在进样孔3与各出样孔4之间分别开设凹坑5，进样孔3与各凹坑5之间、各凹坑5与其对应出样孔4之间各自开设连接槽6，并依次连接。PDMS芯片与微电极层2贴合后，如图2所示，在微电极层2上面，各连接槽6形成流道，各凹坑5形成检测腔。如图2、图3所示，微电极层2的贴合面上，在各检测腔贴合对应区域，分别设置有相应的薄层检测电极单元，各薄层检测电极单元包括工作电极7与对电极8。其中工作电极7为由掺硼金刚石生成的BDD薄膜电极，各工作电极7上分别修饰有与该工作电极7所要检测的目标生物毒素对应的核酸适配体；对电极8为由铂1000经溅射工艺形成的铂薄层电极。

如图2、图4所示，每个凹坑5设置多个分流连接槽6汇合后连接进样孔3。进样孔3、出样孔4、凹坑5在PDMS芯片层1的布置以下3种布置方式值得推荐。

布置方式一：PDMS芯片层1开设1个位于PDMS芯片层1中心位置的进样孔3与围绕进样孔3分居两侧的2个凹坑5及对应的2个出样孔4，分别形成2个检测腔；微电极层2的贴合面上，在各检测腔贴合对应区域，分别设置有相应的2个薄层检测电极单元，目标生物毒素为黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素B1、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮毒素四种生物毒素中的其中2种，各工作电极7上分别修饰有以上四种生物毒素中的其中2种对应的核酸适配体。

布置方式二：PDMS芯片层1开设1个位于PDMS芯片层1中心位置的进样孔3与围绕进样孔3分居3个凹坑5及对应的3个出样孔4，分别形成3个检测腔；微电极层2的贴合面上，在各检测腔贴合对应区域，分别设置有相应的3个薄层检测电极单元，目标生物毒素为黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素B1、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮毒素四种生物毒素中的其中3种，各工作电极7上分别修饰有以上四种生物毒素中的其中3种对应的核酸适配体。

布置方式三：PDMS芯片层1开设1个位于PDMS芯片层1中心位置的进样孔3与围绕进样孔3分居四周的4个凹坑5及4个出样孔4，分别形成4个检测腔；微电极层2的贴合面上，在各检测腔贴合对应区域，分别设置有相应的4个薄层检测电极单元，目标生物毒素为黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素B1、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮毒素四种生物毒素，各工作电极7上分别修饰有以上四种生物毒素对应的核酸适配体。

如图2、图3所示，在微电极层2贴合面上，工作电极7末端连接其接线焊接块11，工作电极7包括方形主块9与向外延伸至其接线焊接块11的长直条10。对电极8末端也连接其接线焊接块11，对电极8呈围绕工作电极7方形主块9外的形态，并向外延伸至其接线焊接块11；工作电极7与对电极8末端的接线焊接块11均布置在所述微电极层2贴合面上的近边侧处。

本发明多种生物毒素检测芯片的制备方法，包括可不分先后各自进行的PDMS芯片层1与微电极层2的制备，以及制备好的PDMS芯片层1与微电极层2二者的键合；PDMS芯片层1的制备包括：先是作为其成型模具的硅基片模具的制备，后是PDMS芯片层1的制备；其特征在于：在制备好的PDMS芯片层1与微电极层2二者键合前，微电极层2还需要为其工作电极7进行核酸适配体修饰，构建特异性检测单元。

微电极层2工作电极7进行核酸适配体修饰过程如下：滴加10μL金沉积液于工作电极7表面，室温孵育4h，之后工作电极7表面会沉积一层纳米金颗粒，金沉积液构成：0.5％w/v氯金酸HAuCl

硅基片模具的制备采用单面抛光的四寸单晶硅片作为模具基片，具体包括以下步骤：

步骤1.清洗，利用H

步骤2.涂胶，对基片进行涂胶，负胶SU8-2075，500r*30s，3000r*60s，厚50μm。

步骤3.前烘，热板温度95℃，时间45min。

步骤4.光刻，曝光时间为28s。

步骤5.后烘，烘箱温度95℃，时间7min。

步骤6.显影，显影时间5min，2100r*60s甩干。

步骤7.硬烘，150℃，15min。

最后就得到50μm高度微结构的硅基片模具。

PDMS芯片层1的制备过程如下：

步骤1.将制备好的硅基片模具放入氟硅烷蒸汽箱中孵育4h，方便后续PDMS芯片的剥离。

步骤2.称量PDMS预聚物和固化剂，二者重量比10：1，将二者混匀，置于真空度为13psi的真空干燥器中静置30min，除去大部分气泡。

步骤3.将硅基片模具放置在水平台上，浇注PDMS混合物，静置30min，使微结构中充满PDMS。

步骤4.放入80℃烘箱中加热1h，待PDMS完全固化后，小心的将PDMS从硅片上剥离下来。

步骤5.采用针筒加特定孔径的针头，按照PDMS芯片上的进样口和出样口位置进行打孔。

步骤6.再按照切割线切割芯片，得到单个PDMS芯片，上下表面贴白膜保存。

微电极层2的制备过程如下：

步骤1.选择单面抛光的整体四寸硅片作为基片，采用热氧化法制备2μm厚度的二氧化硅(SiO2)层作为绝缘隔离层。

步骤2.选择使用热丝化学沉积技术生长3-5μm金刚石膜。

步骤3.采用金属溅射技术制备厚度为450nm的Al掩膜层，再旋涂2.4μm厚LC100A4光刻胶，对Al层进行图形化。

步骤4.湿法腐蚀去除Al层，再使用氧等离子体干法刻蚀BDD区域得到BDD工作电极7结构。

步骤5.采用金属溅射工艺，制备0.4μm厚的Pt1000层作为对电极8结构；再利用丙酮去除光刻胶，制备完成Pt电极区域。

步骤6.按切割线划片切割得到单个的电极芯片；利用锡膏将连接导线焊接在每个电极单元的焊点处，切割前后均可。

制备好的PDMS芯片层1与微电极层2二者的键合过程如下：

将PDMS芯片上表面白膜撕掉，与微电极层2一起放入等离子体清洗机清洗60s，再利用对准键和仪，按照对准标记将两部分键和在一起，即完成了整个芯片的制备。

本发明多种生物毒素检测方法，使用上述多种生物毒素检测芯片，先对经制备所得的多种生物毒素检测芯片模拟如下具体测试过程，将多种生物毒素检测芯片进行测试标定，通过加入一系列包含有黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素B1、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮毒素四种生物毒素的至少一种并已知其浓度值的不同浓度的标准试样溶液，测得一系列不同数值的各工作电极7单元的初始阻抗值Rct0与反应后阻抗值Rct，进行一系列的浓度梯度实验，得到一系列各生物毒素浓度值与对应工作电极7单元的相对阻抗值y值数据，代入某种生物毒素浓度与相对阻抗值y值之间的线性关系式：y＝A+Blgx，式中，相对阻抗值y＝(Rct-Rct0)/Rct0，A与B为常数，x表示某种生物毒素浓度，lgx表示以10为底x的对数；经一系列计算得到各种生物毒素浓度与其相对阻抗值y值之间的线性关系式中的常数A与B的数值。

具体测试过程如下：(1)先从进样口加入10mM Fe(CN)