一种迁移体标记物

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种迁移体(Migrasome)标记物。

背景技术

迁移体(Migrasome)是在细胞定向迁移过程中，细胞尾部产生收缩丝的末端或交叉部位产生直径为0.5-3μm的单层膜囊泡结构。细胞产生迁移体的过程称为迁移性胞吐。当细胞迁移离开后，迁移体会继续留在原地，直到破裂或被其他细胞吞噬，从而进行细胞间物质传递。目前，通过对迁移体的研究发现，其在胚胎发育、机体免疫反应、肿瘤转移等细胞迁移活跃的过程中发挥着重要的信号传递作用。

迁移体的产生依赖于细胞迁移。研究表明，当迁移增加时，迁移体的数量随之增加，反之迁移体的数量减少。在培养的细胞中，细胞迁移依赖细胞与细胞外基质的粘附作用。迁移体也粘附在细胞外基质上，因此粘附分子可能在迁移体产生中发挥作用。质谱分析表明，整合素α5β1在迁移体上富集。活细胞成像研究表明，整合素定位于迁移体发生的位置，并且比迁移体更早出现在收缩丝上。此外，三维成像显示，整合素位于迁移体的底部。这些时空分布表明，整合素是迁移体发生的重要分子。哺乳动物整合素有18个α和8个β亚基，不同的整合素与不同的细胞外基质蛋白质结合。整合素与其特定的细胞外基质配对决定了迁移体的形成。对于富含整合素α5β1的L929细胞，纤连蛋白(fibronectin)是促进迁移体产生的最佳细胞外基质。这种依赖整合素-细胞外基质配对网络调控的迁移体发生机制，为迁移体在体内作为信号传递媒介的特异性提供重要的理论基础。同时，迁移体上的整合素也对其进入特定的受体细胞提供特异性。

为了准确地研究迁移体的生成过程，黄雨薇等设计了一个体外迁移体重构系统，该系统使用纯化的TSPAN4-GFP，胆固醇和其他脂质生成了巨大的单层囊泡(GUV)。为了模拟细胞粘附和迁移，首先将带有生物素的单层囊泡连接到涂有链霉亲和素的流动室底部。然后，通过在腔室内施加定向液体流来提供机械力，使单层囊泡远离与流动室底部的粘附点。通过这种方式，成功重构了迁移体的形成，并且TSPAN4和胆固醇都聚集在重构的迁移体上。如果体系中无TSPAN4或胆固醇，则不能重构迁移体，TSPAN4或胆固醇是随机分布在人工所产生出的丝上。黄雨薇等人还采用了另一种体系，使用玻璃针将其附着在单层囊泡上以施加拉力而代替定向液体流动产生机械力。通过这种方式成功地从镶嵌了TSPAN4-GFP的单层囊泡中拉出类似收缩丝的管状结构。在拉管过程中，微区结构域TEM聚集形成宏结构域TEMA，并在膜管上自发膨胀形成类似于迁移体的结构，没有TSPAN4-GFP或胆固醇的单层囊泡则不能重构出类似迁移体的结构。以上两个体外重构体系证明，TSPAN4和胆固醇是形成迁移体的充分必要条件。同时，研究表明，收缩丝上初步形成的TEMAs使得膜的弯曲刚度超过收缩丝上其他部位，该位置会自发膨胀形成迁移体。该研究是迁移体发生机制的理论基础，同时也开创了以TSPAN4和TEMAs为核心的迁移体功能研究，为后续迁移体发生的调控研究提供了基础。

目前，TSPAN4作为迁移体标记物主要基于NRK细胞，而在泛癌细胞中，TSPAN4的表达较低，其无法作为迁移体标记物进行迁移体研究。因此，开发新的迁移体标记物对于迁移体发生的调控研究具有重要意义。

发明内容

针对上述不足，本发明提供了一种新的迁移体(Migrasome)标记物。

为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供了CD151作为迁移体标记物的应用。

另一方面，本发明提供了一种迁移体标记物，所述的迁移体标记物为CD151。

又一方面，本发明提供了一种检测CD151的试剂在制备迁移体检测试剂盒中的应用。

具体地，所述的检测CD151的试剂包括但不限于检测CD151的特异性抗体、探针、引物和/或荧光试剂。

又一方面，本发明提供了一种迁移体检测试剂盒，所述的试剂盒包含检测CD151的试剂。

具体地，所述检测CD151的试剂包括但不限于检测CD151的特异性抗体、探针、引物和/或荧光试剂。

又一方面，本发明提供了一种迁移体的检测方法，所述的检测方法为通过检测CD151获得迁移体的表达量和/或定位。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明首次发现CD151可作为一种肝癌细胞系中新的迁移体标记物，同时影响迁移体的生成。CD151作为肝癌细胞系中迁移体标记物的研究，对于迁移体发生的调控研究具有重要意义，对于胚胎发育、机体免疫反应、肿瘤转移等细胞迁移活跃的过程研究也具有重要意义。

附图说明

图1为数据库分析结果图。

图2为CD151与Migrasome共聚焦结果图。

图3为CD151 SiRNA与TSPAN4 SiRNA敲降结果图及HCCLM3，MHCC-97H，MHCC-97L，Hep 3B，Hep G2，Huh7细胞共聚焦结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例1.CD151可特异性标记Migrasome

由图1可知，通过TCGA，GEO等数据库分析发现，在泛癌细胞中TSPAN4的表达较低，而CD151的表达量相对较高。

因此，进一步通过以下实验方法研究CD151与迁移体的关系。

实验方法1：

1)取约2.5×10^5个NRK-GFP细胞接种于直径约35mm的共聚焦小皿中(小皿预先用10μg/ml的Fibronectin 37℃孵育0.5-1h)，培养约15-20h后进行Migrasome染料染色。

2)通过免疫荧光实验技术，将细胞中CD151表达出来，然后通过共聚焦显微镜拍摄得到CD151标记的结构。

3)用Migrasome染料进行染色，通过共聚焦显微镜拍摄Migrasome的结构。然后merge后观察与CD151免疫荧光染色的Migrasome是否是同一种结构。

实验方法2：Si RNA转染

在24孔板中接种HCCLM3，MHCC-97H，MHCC-97L，Hep 3B，Hep G2，Huh7这六株细胞，等细胞汇合度达到50％作用开始转染Si RNA。

Si RNA转染步骤如下(24孔板，Si RNA转染浓度为50nM)：

1)从凯基生物构建Si RNA(CD151 SiRNA与TSPAN4 SiRNA，三保一)。

表1.Si RNA序列

2)用无酶水将Si RNA稀释为20μM。

3)取1.25μl的Si RNA加入50μl的Opti-Medium稀释，轻吹3-5次，静置5min取3μl的Lipo2000加入50μl的Opti-Medium稀释，轻吹3-5次，静置5min以上两者混合轻吹3-5次，静置20min。

4)取400μl不含血清不含双抗的培养基加入24孔板，然后加入上述混合液100μl，晃匀。

5)37℃，5％CO

6)培养24-72小时后进行后续验证和相关实验。

通过QPCR和Western Blot选出效果最佳的Si RNA。用效果最佳的Si RNA转染上述6种细胞后，取约2.5×10^5个细胞接种于直径约35mm的共聚焦小皿中(小皿预先用10μg/ml的Fibronectin 37℃孵育0.5-1h)，培养约15-20h后进行Migrasome染色共聚焦显微镜拍摄观察。

检测结果如图3所示，由图3可知，CD151 SiRNA与TSPAN4 SiRNA进行敲除后，通过qPCR的验证(NC组：不做任何处理的组别；Mock组：不转入目的Si RNA的组别；Si RNA组：转入目的Si RNA的组别)。CD151中Si2敲低效果最佳，同时进行了蛋白层面表达的验证，证明小干扰RNA的有效性(由于TSPAN4表达量不高，经过多次实验，无法从L292细胞中测出准确的TSPAN4的表达，所以最终只通过WB蛋白层面验证了TSPAN4 Si RNA的有效性)。在L929细胞中可以发现，CD151敲低后Migrasome减少，并且与TSPAN4相比CD151的效果更佳，同样在6株肝癌细胞株中进行相同实验，Migrasome的表达均减少。表明CD151在肝癌细胞中对迁移体起到的作用与TSPAN4相当，CD151可以作为肝癌细胞中Migrasome的标记蛋白。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。