一种pH响应型防龋疫苗

技术领域

本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种pH响应型防龋疫苗。

背景技术

变异链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)是主要的致龋菌之一，其最主要的表面抗原为表面蛋白抗原(Streptococcus mutans surface protein，PAc)、葡糖基转移酶(glucosyltransferases，GTF)等。所以近年来针对变异链球菌的防龋疫苗从早期的疫苗类型，逐渐转变为DNA疫苗和抗原蛋白亚单位疫苗。

然而，目前所存在的防龋疫苗仍面临免疫原性弱、防龋效果有所不足的缺陷，因而本发明希望提出一种具有更显著防治龋齿效果的新型疫苗产品。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种pH响应型防龋疫苗。该pH响应型防龋疫苗具有响应酸性pH释放的特点，且具有显著的防龋效果，有着广阔的应用前景。

本发明提供了一种pH响应型防龋疫苗，包括ZIF-8和变异链球菌表面蛋白抗原(PAc)。

ZIF-8(沸石咪唑酯骨架)是一种金属有机框架材料(MOFs)，由Zn

优选地，所述变异链球菌表面蛋白抗原为重组抗原，所述重组抗原由SEQ ID NO:1所示的抗原片段1、SEQ ID NO:2所示的抗原片段2和连接肽组成。

更优选地，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。当连接肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:3时，此时所述变异链球菌表面蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

优选地，所述pH响应型防龋疫苗中ZIF-8和变异链球菌表面蛋白抗原的质量比为(5-40):1。

更优选地，所述pH响应型防龋疫苗中ZIF-8和变异链球菌表面蛋白抗原的质量比为(5-20):1。

进一步优选地，所述pH响应型防龋疫苗中ZIF-8和变异链球菌表面蛋白抗原的质量比为10:1。

优选地，所述ZIF-8的制备方法为：将六水合硝酸锌与2-甲基咪唑置于醇溶液中进行反应，收集沉淀，醇洗，干燥。

更优选地，所述醇溶液为甲醇溶液。

优选地，所述pH响应型防龋疫苗中还包括防腐剂、乳化剂、稳定剂或稀释剂中的至少一种。

优选地，所述pH响应型防龋疫苗包括皮下注射疫苗或滴鼻疫苗。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

本发明将ZIF-8和PAc蛋白结合作为防龋疫苗，表现出高负载量和响应酸性pH变化释放的特性，具有显著的防龋效果。

附图说明

图1为重组变异链球菌表面蛋白PAc的过程中各阶段的电泳情况。其中，A为pac基因的PCR扩增结果；B为菌液PCR验证试验，1-8号为不同的单克隆，3号为阴性克隆；C为pac测序验证；D为Marker，1：全蛋白，2：杂蛋白，3：10mM咪唑，4：25mM咪唑，5：50mM咪唑，6：100mM咪唑，7：500mM咪唑的电泳结果；E为Marker，1：HisA-PAc融合蛋白，2-3：通过肠激酶切HisA标签蛋白过柱纯化后的PAc蛋白电泳结果。

图2为ZIF-8和ZIF-8@PAc相关表征结果。其中，A、B分别为通过SEM测定ZIF-8纳米材料和ZIF-8@PAc的粒径大小；C-D为通过TEM测定ZIF-8的内部情况；E-F为通过TEM测定ZIF-8@PAc的内部情况；H为PAc蛋白与ZIF-8纳米材料在不同质量比时的吸附程度；I为ZIF-8@PAc在不同pH下的释放能力。

图3为大鼠抗体滴度、菌含量变化和器官指数结果。其中，A为IgG抗体滴度；B为IgA抗体滴度；C为菌含量变化统计图；D-H分别为心肝脾肺肾器官指数统计图。

图4为PBS、PBS+PAc、ZIF-8@PAc对于大鼠的防龋结果。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

实施例1：ZIF-8纳米材料的合成

1、将六水合硝酸锌/Zn(NO

2、将溶有六水合硝酸锌的甲醇溶液在搅拌条件下(1000rpm)滴加至2-甲基咪唑的甲醇溶液中，室温下搅拌反应1h，反应过程中可观察到白色沉淀物的生成。

3、反应结束后，将混合液平均分成四管进行离心(8000rpm，10min)收集白色沉淀，分别用50mL甲醇洗3次，60℃烘箱过夜干燥，得ZIF-8白色固体。

实施例2：变异链球菌表面蛋白抗原(PAc)的制备

本实施例提供一种变异链球菌表面蛋白抗原(PAc)，由SEQ ID NO:1所示的抗原片段1、SEQ ID NO:2所示的抗原片段2、如SEQ ID NO:3所示的连接肽组成，最终所得变异链球菌表面蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

VKTAEEAVQKETEIKEDYTKQAEDIKKTTDQYKSDVAAHEAEVAKIKAKNQATKEQYEKDMAAHKAEVERINAANAASKTAYEAKLAQYQADLAAVQKTNAANQAAYQKALAAYQAELKRVQEANAAAKAAYDTAVAANNAKNTEIAAANEEIRKRNATAKAEYETKLAQYQAELKRVQEANAANEADYQAKLTAYQTELARVQKANADAKAAYEAAVAANNAKNAALTAENTAIKQRNENAKATYEAALKQYEADLAAVKKANAANEADYQAKLTAYQTELARVQKANADAKAAYEAAVAANNAANAALTAENTAIKKRNADAKADYEAKLAKYQADLAKY(SEQ ID NO:1)；

VNVPKVTKEKPTPPVKPTAPTKPTYETEKPLKPAPVAPNYEKEPTPPTRTPDQAEPNKPTPPTYETEKPLEPAPVEPSYEAEPTPPTRTPDQAEPNKPTPPTYETEKPLEPAPVEPSYEAEPTPPTPTPDQPEPNKPVEPTYEVIPTPPTDPVYQDLPTPPSVPTVHF(SEQ ID NO:2)；

STSTGSTSTG(SEQ ID NO:3)；

VKTAEEAVQKETEIKEDYTKQAEDIKKTTDQYKSDVAAHEAEVAKIKAKNQATKEQYEKDMAAHKAEVERINAANAASKTAYEAKLAQYQADLAAVQKTNAANQAAYQKALAAYQAELKRVQEANAAAKAAYDTAVAANNAKNTEIAAANEEIRKRNATAKAEYETKLAQYQAELKRVQEANAANEADYQAKLTAYQTELARVQKANADAKAAYEAAVAANNAKNAALTAENTAIKQRNENAKATYEAALKQYEADLAAVKKANAANEADYQAKLTAYQTELARVQKANADAKAAYEAAVAANNAANAALTAENTAIKKRNADAKADYEAKLAKYQADLAKYSTSTGSTSTGVNVPKVTKEKPTPPVKPTAPTKPTYETEKPLKPAPVAPNYEKEPTPPTRTPDQAEPNKPTPPTYETEKPLEPAPVEPSYEAEPTPPTRTPDQAEPNKPTPPTYETEKPLEPAPVEPSYEAEPTPPTPTPDQPEPNKPVEPTYEVIPTPPTDPVYQDLPTPPSVPTVHF(SEQID NO:4)。

该变异链球菌表面蛋白抗原(PAc)的制备方法为：

(1)根据GenBanK数据库得到变异链球菌SM UA159菌株pac基因中A区+P区基因序列，并在A区和P区之间设计序列为TCCACCTCCACCGGATCCACCTCCACCGGA的核苷酸，并送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成(1563bp)。再将其与pGEX-4T-1连接，得到pGEX-4T-pac重组载体。

(2)以pGEX-4T-pac重组载体为模板，设计相应的pac上下游引物(如SEQ ID NO:5-6所示)扩增目的基因，PCR反应体系为：Prime STARHS(Premix)：25μL、上、下游引物各2μL、模板2μL、ddH

上游引物：5’-CGATGGGGATCCGAGCTCGTTAAAACACCTGAAGAAGC-3’(SEQ ID NO:5)；

下游引物：5’-TCGAATTCCCATATGTTAGAAATGAACAGTTGGATCAG-3’(SEQ ID NO:6)。

(3)对PCR扩增得到的目的基因进行胶回收，接着利用限制性内切酶SacⅠ和KpnⅠ对空载质粒pBAD/HisA进行双酶切(37℃，30min)。PCR产物和双酶切产物分别利用胶回收试剂盒进行回收，测定浓度，将纯化后的PCR扩增目的片段和线性载体pBAD/HisA根据无缝克隆试剂盒进行连接，其目的片段与载体的摩尔比在2:1-3:1之间(50℃反应20min)。连接产物(即重组质粒pBAD/HisA-pac)转化大肠杆菌Top10感受态细胞，涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃过夜培养。在LB平板上随机挑取8个单菌落置于LB液体培养基中(含100μg/mL氨苄青霉素)培养一定时间，分别取菌液进行PCR鉴定，阳性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果与之前合成的pac进行BLAST。

(4)将BLAST正确无误的含重组质粒pBAD/HisA-pac的菌液接种于10mL LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中，200r/min，37℃过夜培养。次日，按照2％-5％接种量扩大培养，37℃，200r/min摇床培养至OD

图1所示为重组变异链球菌表面蛋白PAc的过程中各阶段的电泳情况。其中，A为pac基因的PCR扩增结果；B为菌液PCR验证试验，1-8号为不同的单克隆，3号为阴性克隆；C为pac测序验证；D为Marker，1：全蛋白，2：杂蛋白，3：10mM咪唑，4：25mM咪唑，5：50mM咪唑，6：100mM咪唑，7：500mM咪唑的电泳结果；E为Marker，1：HisA-PAc融合蛋白，2-3：通过肠激酶切HisA标签蛋白过柱纯化后的PAc蛋白电泳结果。

实施例3：pH响应型防龋疫苗

本实施例提供一种pH响应型防龋疫苗，包括ZIF-8和变异链球菌表面蛋白抗原，其制备方法为：在PBS缓冲液中加入实施例1中ZIF-8纳米材料和实施例2中的变异链球菌表面蛋白抗原(PAc)，经静电吸附实现结合，得到ZIF-8@PAc。

通过SEM测定ZIF-8纳米材料和ZIF-8@PAc的粒径大小，测试结果分别如图2中A、B所示；再通过TEM测定ZIF-8和ZIF-8@PAc的内部情况，ZIF-8纳米材料的检测结果如图2中C-D所示，ZIF-8@PAc的检测结果如图2中E-F所示；通过激光纳米粒径仪测得ZIF-8、PAc和ZIF-8@PAc的电位，结果如图2中G所示。

为了得出PAc蛋白与ZIF-8纳米材料的最佳吸附条件，通过控制PAc蛋白的浓度，改变ZIF-8纳米材料的浓度进行结合。ZIF-8纳米材料和PAc两者的质量比分别为0:1，0.5:1，1:1，2:1，5:1，10:1，20:1，40:1(n＝3)。两者通过静电吸附的原理进行结合，在25℃，震荡结合60min，8000rpm离心2min，测定上清残余蛋白浓度，从而得出PAc蛋白与ZIF-8纳米材料的吸附比例。由图2中H可知，当ZIF-8与PAc的质量比约为(5-40):1时，两者具有良好的吸附和结合效果。

用最佳吸附条件(即ZIF-8与PAc的质量比为10:1)制备好ZIF-8@PAc，将ZIF-8@PAc置于PBS缓冲液中进行PAc蛋白释放，设置3个不同pH条件，分别为pH 7.2、pH 6.0和pH5.0，并在1h、2h、3h、6h、9h、12h、24h等时间段进行取样，离心，取上清液测定残余蛋白浓度，计算释放率(n＝3)。根据图2中I可知，ZIF-8@PAc在酸性环境下释放能力更强，具有pH响应性，更有利于疫苗在酸性细胞环境下发挥作用。

实施例4：大鼠龋齿实验

采用18d龄雌性SD大鼠为实验动物，刚开始饲喂不含抗生素的Keyes 2000diet龋齿饲料，在第20d在龋齿饲料中加入氯霉素、氨苄青霉素和羧苄青霉素(均为1g/kg)，在饮用水中加青霉素200μg/mL、链霉素1500μg/mL，连喂3d。第23d开始免疫，分别设置3组(PBS、PBS+PAc、ZIF-8@PAc)(n＝5)，其中PBS组是每只大鼠免疫100μL PBS，而PBS+PAc和ZIF-8@PAc两个组分别对每只大鼠免疫50μg PAc，总体积用PBS稀释到100μL。采用皮下多点免疫，共免疫3次，每次间隔14天。24-26d在牙齿上涂变异链球菌(UA159)(1×10

采用ZIF-8@PAc进行免疫的大鼠在实验期间并未发生死亡现象，根据图中3D-H器官指数表明ZIF-8@PAc具有良好的安全性。而根据图3中A-C抗体滴度和菌含量变化以及图4的大鼠龋齿结果可知，ZIF-8@PAc龋齿预防效果显著强于单独使用PAc抗原。

上面结合附图对本申请实施例作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。