一类订书肽化合物在制备治疗肝纤维化药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。涉及通式(I)所示的订书肽类化合物及其药学上可接受的盐以及含有这类化合物的药物组合物在制备治疗肝纤维化药物中的应用。

背景技术

肝纤维化(hepatic fibrosis)是多种慢性肝病的重要结构基础与核心病理改变，被认为是介导多种慢性肝病如血吸虫病、肝炎、胆道梗阻和酒精肝发病的关键结构基础，在持久的肝损伤下，肝纤维会进一步发展成肝硬化。肝硬化是肝纤维化发展的后期阶段，伴随着肝脉管系统和结构的紊乱，是肝衰竭和原发性肝癌的重要诱发因素，具有高发病率和高死亡率的特点，是引起高达45％的肝病患者死亡的主要原因。流行病学研究显示肝硬化患者五年生存率不足40％，生活质量较差。临床对于防止肝纤维化发生发展甚至逆转肝纤维化的治疗需求迫切。尽管近年来肝纤维化发病机制研究已经取得多项关键进展，但依然没有带来有效的治疗策略。因此，深入研究肝纤维化的分子发病机制，并以此发现新药靶、开发防治肝纤维化药物迫在眉睫，具有重要的经济和社会意义。

TRIB3(Tribbles Homologue 3)是Tribbles同源蛋白家族成员之一，最早在果蝇中被鉴定到，并发现该蛋白能抑制有丝分裂，调节发育过程中细胞的增殖、迁移及形态形成。在哺乳动物中，有三种Tribbles同源蛋白：TRIB1，TRIB2和TRIB3，它们都是假激酶蛋白家族成员。这三种蛋白都含有Ser/Thr蛋白激酶样结构域(Kinase like domain,KD)，但却缺乏ATP的结合位点和催化残基，因此没有激酶活性。尽管如此，Tribbles蛋白却具有接头蛋白样的功能，参与多种蛋白复合体的组装。在哺乳动物Tribbles家族成员中，TRIB3的研究最为深入，其相互作用蛋白包括转录因子、泛素连接酶、细胞膜上II型BMP受体以及MAPK、PI3K信号通路成员。通过与这些蛋白相互作用，TRIB3参与了糖脂代谢、脂肪细胞分化、凋亡、应激和胶原表达等的调控。近来，多种证据表明，TRIB3在多种纤维化组织中呈现高表达，并且在纤维化的发生发展过程中发挥重要的促进作用。其中异常表达的TRIB3引起的细胞自噬抑制是关键的致病机制。细胞自噬是生物进化过程中产生的一种细胞内蛋白和细胞器的循环利用过程，作为细胞应对不良环境的一种防御机制广泛存在于正常的生理过程中。细胞自噬功能异常往往会参与多种疾病如癌症、肝脏与肺部疾病等的病理过程。其中，自噬受到抑制会引起的错误折叠蛋白和受损细胞器的降解受阻并大量堆积，炎症和氧自由基亦得不到有效清除从而打破细胞稳态。本发明前期结果显示，TRIB3通过与自噬货车蛋白p62发生相互作用，抑制细胞的自噬活性，促进肝星形细胞(肝纤维化主要效应器细胞)的增殖、迁移和活化。提示靶向TRIB3与p62之间的相互作用是治疗组织纤维化的一个潜在靶点。因此，研究和开发阻断TRIB3与p62蛋白相互作用的物质，具有很好的治疗肝纤维化的成药前景。

蛋白-蛋白相互作用(PPIs)在许多生物过程中扮演着重要的角色，例如细胞的增殖、生长、分化及程序性死亡。人类疾病中许多潜在的治疗靶标主要是蛋白-蛋白相互作用。由于大部分PPIs是以蛋白质间多个二级结构多肽单元发生结合，不具有特定的结合口袋，结合面比较大而且是不连续的平面，小分子试剂很难与其特异性紧密结合。这种特点增大了以PPIs为靶点开发常规小分子药物的难度。在蛋白-蛋白相互作用的过程中，α螺旋和β折叠二级结构是参与PPIs的主要接触面单元。近年来，将这些参与结合的二级结构从大的蛋白质母结构中简化出来，从而实现用化学合成方式得到高活性、高选择性的合成多肽类药物。因此越来越多的研究开始关注含有α螺旋结构的多肽的合成与临床应用。

多肽一旦从蛋白质母结构上分离就不能保持原有的二级结构，由于构象的不稳定，多肽与作用蛋白的结合能力非常弱，而普通的线性多肽不能透过细胞膜且易被蛋白酶水解。基于此人们不断尝试发展稳定α螺旋结构的方法，例如，利用二硫键或分子内酰胺键作为支架。然而，这些支架在生理环境下均不能稳定存在。2000年Verdine等开发了一种用碳碳键作为支架来稳定多肽α螺旋结构的方法，由该方法得到的多肽称为订书肽。订书肽方法将α螺旋中特定位置的氨基酸残基替换为侧链可以相连的非天然氨基酸如S-戊烯丙氨酸(S5)等，在合成肽链之后这两个氨基酸侧链之间偶联形成代谢稳定的桥连Staple结构。该结构可以稳定α螺旋的二级结构，使其具有极高的亲和力、抗酶解稳定性以及细胞穿膜性，成药性显著提高。

通过前期研究，我们筛选到一条靶向TRIB3与p62蛋白相互作用的α螺旋肽A2，但是该天然多肽片段在溶液中不能稳定形成活性所需的α螺旋构象，结合能力和生物稳定性均需要结构改造的方式加以提高。如果通过合理的订书肽化提高其α螺旋稳定性、与TRIB3结合能力和代谢稳定性，则极有希望开发以TRIB3为靶点的首创性药物候选物。我们采用经典的环烯订书肽方法对A2多肽进行结构改造，获得一系列以A2结构为基础的、α螺旋率显著提高且与TRIB3蛋白的结合能力明显增强的多肽化合物。基于我们的研究发现，相信该系列多肽化合物的开发必将为肝纤维化的临床治疗提供有效且崭新的药物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对目前缺乏能有效的肝纤维化防治药物现状，而提供一类能特异性结合TRIB3的多肽及其药学上可接受的盐以及含有这类化合物的药物组合物在制备治疗肝纤维化疾病药物中的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案的第一方面是提供了一系列可特异性结合TRIB3的多肽(订书肽)或其衍生物在制备预防或治疗肝纤维化的药物中的应用；所述的多肽如下定义：

1.本发明涉及可特异性结合TRIB3的订书肽

所述可特异性结合TRIB3的订书肽是如通式I、I-A、I-B、I-C、I-D、I-E、I-F，以及包括但不仅限于表1中所示SHA2-1、SHA2-2、SHA2-3、SHA2-4、SHA2-5、SHA2-6、SHA2-7、SHA2-8、SHA2-9、SHA2-10、SHA2-11、SHA2-12、SHA2-13、SHA2-14中的任一化合物。可适当引入氨基酸替换，缺失或添加，只要改变后的氨基酸序列仍然能够形成与TRIB3特异性结合的多肽且该多肽仍然保持改变前的活性即可。

1.1本发明涉及订书肽为通式(I)所示的多肽化合物及其药学上可接受的盐。

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其中，

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所述“具有烯基侧链的α-氨基酸”选自：(S)-2-(4’-戊烯)丙氨酸(S5)，(R)-2-(4’-戊烯)丙氨酸(R5)，(S)-2-(7’-辛烯)丙氨酸(S8)，(R)-2-(7’-辛烯)丙氨酸(R8)，(S)-2-(4’-戊烯)甘氨酸(Sg5)，(R)-2-(4’-戊烯)丙氨酸(Rg5)；

在肽链中至少具有一个氨基酸侧链的链接结构，由具有烯基侧链的α-氨基酸的烯基之间通过烯烃复分解反应形成，连接位置可独立的选自位于Xaa

1.2本发明涉及订书肽为通式(I-A)所示的多肽化合物及其药学上可接受的盐。

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其中，

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在肽链中的具有烯基侧链的α-氨基酸Uaa

所述“具有烯基侧链的α-氨基酸”选自：(S)-2-(4’-戊烯)丙氨酸(S5)，(R)-2-(4’-戊烯)丙氨酸(R5)，(S)-2-(7’-辛烯)丙氨酸(S8)，(R)-2-(7’-辛烯)丙氨酸(R8)，(S)-2-(4’-戊烯)甘氨酸(Sg5)，(R)-2-(4’-戊烯)丙氨酸(Rg5)；

1.3本发明涉及订书肽为通式(I-B)所示的多肽化合物及其药学上可接受的盐。

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其中，

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在肽链中的具有烯基侧链的α-氨基酸Uaa

所述“具有烯基侧链的α-氨基酸”选自：(S)-2-(4’-戊烯)丙氨酸(S5)，(R)-2-(4’-戊烯)丙氨酸(R5)，(S)-2-(7’-辛烯)丙氨酸(S8)，(R)-2-(7’-辛烯)丙氨酸(R8)，(S)-2-(4’-戊烯)甘氨酸(Sg5)，(R)-2-(4’-戊烯)丙氨酸(Rg5)；

1.4本发明涉及订书肽为通式(I-C)所示的多肽化合物及其药学上可接受的盐。

R

其中，

R

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Uaa

Xaa

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在肽链中的具有烯基侧链的α-氨基酸Uaa

所述“具有烯基侧链的α-氨基酸”选自：(S)-2-(4’-戊烯)丙氨酸(S5)，(R)-2-(4’-戊烯)丙氨酸(R5)，(S)-2-(7’-辛烯)丙氨酸(S8)，(R)-2-(7’-辛烯)丙氨酸(R8)，(S)-2-(4’-戊烯)甘氨酸(Sg5)，(R)-2-(4’-戊烯)丙氨酸(Rg5)；

1.5本发明涉及订书肽为通式(I-D)所示的多肽化合物及其药学上可接受的盐。

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其中，

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在肽链中的具有烯基侧链的α-氨基酸Uaa

所述“具有烯基侧链的α-氨基酸”选自：(S)-2-(4’-戊烯)丙氨酸(S5)，(R)-2-(4’-戊烯)丙氨酸(R5)，(S)-2-(7’-辛烯)丙氨酸(S8)，(R)-2-(7’-辛烯)丙氨酸(R8)，(S)-2-(4’-戊烯)甘氨酸(Sg5)，(R)-2-(4’-戊烯)丙氨酸(Rg5)；

1.6本发明涉及订书肽为通式(I-E)所示的多肽化合物及其药学上可接受的盐。

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其中，

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在肽链中的具有烯基侧链的α-氨基酸Uaa

所述“具有烯基侧链的α-氨基酸”选自：(S)-2-(4’-戊烯)丙氨酸(S5)，(R)-2-(4’-戊烯)丙氨酸(R5)，(S)-2-(7’-辛烯)丙氨酸(S8)，(R)-2-(7’-辛烯)丙氨酸(R8)，(S)-2-(4’-戊烯)甘氨酸(Sg5)，(R)-2-(4’-戊烯)丙氨酸(Rg5)；

1.7本发明涉及订书肽为通式(I-F)所示的多肽化合物及其药学上可接受的盐。

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其中，

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Uaa

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在肽链中的具有烯基侧链的α-氨基酸Uaa

所述“具有烯基侧链的α-氨基酸”选自：(S)-2-(4’-戊烯)丙氨酸(S5)，(R)-2-(4’-戊烯)丙氨酸(R5)，(S)-2-(7’-辛烯)丙氨酸(S8)，(R)-2-(7’-辛烯)丙氨酸(R8)，(S)-2-(4’-戊烯)甘氨酸(Sg5)，(R)-2-(4’-戊烯)丙氨酸(Rg5)；

1.8本发明1.1-1.7涉及订书肽特点描述

本发明所述的“1-6个碳原子的直链或支链脂肪胺”，是指含有1、2、3、4、5、6个碳原子的直链或支链脂肪胺，优选含有1-4个碳原子的直链或支链脂肪胺、2-4个碳原子的直链或支链脂肪胺、1-5个碳原子的直链或支链脂肪胺、2-5碳原子的直链或支链脂肪胺，最优选1-3个碳原子的直链或支链脂肪胺。本发明中任意一项中所指的“具有烯基侧链的α-氨基酸”具体以化学结构表示为：

(S)-2-(4’-戊烯)丙氨酸(S5)：

(R)-2-(4’-戊烯)丙氨酸(R5)：

(S)-2-(7’-辛烯)丙氨酸(S8)：

(R)-2-(7’-辛烯)丙氨酸(R8)：

(S)-2-(4’-戊烯)甘氨酸(Sg5)：

(R)-2-(4’-戊烯)丙氨酸(Rg5)：

本发明所述的“含有2-16个C的饱和或不饱和直链酰基或支链酰基”指烷基部具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个碳的饱和或不饱和直链羧酸或支链羧酸所成的酰基并酰化第一个氨基酸的α-氨基，优选含有2-13个、13-16个碳的饱和或不饱和直链羧酸或支链酰基。

1.9本发明1.1-1.7涉及订书肽化合物及其药学可接受的盐，其包括下述表1中化合物：

表1.化合物列表

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本发明提供的技术方案的第二方面是提供了本发明涉及所述多肽(订书肽)化合物及其药学上可接受的盐可以作为活性成在制备预防或/和治疗肝脏组织纤维化相关疾病或病症的药物中的应用。所述的多肽(订书肽)化合物的定义同本发明技术方案第一方面所述。所述的肝脏组织纤维化相关疾病或病症包括肝硬化及其引起的肝功能衰竭。所述的“活性成分”是指具有预防或/和治疗肝纤维疾病或病症的化合物，即所述多肽或所述多肽的衍生物用于制备治疗肝纤维化的药物。在该药物中，所述多肽或所述多肽的衍生物可以单独作为活性成分，也可以和其他化合物一起作为活性成分。

本发明中所述的“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。例如，本发明所述疾病和/或病症即可以指一种身体状态，例如肝纤维化和肝硬化。其中，所述的肝纤维化能够引发多种病症，本发明所述的多肽或所述多肽的衍生物能够针对性地治疗该些病症，所述病症较佳地为肝纤维化引起的肝硬化，或者肝纤维化引起的肝脏衰竭。在本文中对身体状态和疾病状态不做区分。

如本文所述，术语“有效量”指可在受试者中实现治疗和/或预防本发明所述疾病或病症的剂量。

如本文所述，术语“药物组合物”，其还可以是指“组合物”，其可用于在受试者，特别是哺乳动物中实现治疗和/或预防本发明所述疾病或病症。

如本文所述，术语“受试者”可以指患者或其他接受本发明式I化合物或其药物组合物以治疗和/或预防本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、猴、犬、猪、马、鼠、兔等。

如本文所述，如未特别指明，“％”指重量/重量的百分比，特别是在描述固体物质的情况下。当然，在描述液体物质时，该“％”可以指重量/体积百分比(对于固体溶于液体的情况)，或者指体积/体积百分比(对于液体溶于液体的情况)。

如本说明书所述，术语“药学可接受的”例如在描述“药学可接受的盐”时，表示该盐其不但是受试者生理学上可接受，而且还可指在药学上有使用价值的合成物质，例如在进行衍生化反应时所形成的中间体的盐，尽管这种中间体的盐并不直接给予受试者，但该盐可在为获得本发明的终产物中起作用。

本发明再一方面还涉及以本发明化合物作为活性成分的药物组合物。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋性剂/和或辅料结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物的含量可为0.1-99％(重量)。

本发明化合物或含有其药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为优选非肠道，如静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、阴道、直肠或直接施用于组织表面等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括O/W型，W/O型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴鼻剂、搽剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也可制成缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将本发明化合物制成注射剂，可以广泛使用本领域公知的各种辅料，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调节剂、渗透压调节剂、防腐剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调节剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化纳等；渗透压调节剂可以是氯化纳、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等；防腐剂可以是苯甲醇、间甲酚或苯酚。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂或其它添加剂。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量根据给药方式有所不同，静脉注射给药剂量范围为0.001-1.5mg/Kg体重，优选为0.001-1mg/Kg体重，更优选为0.001-0.5mg/Kg体重，最优选为0.001-0.1mg/Kg体重；上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

本发明的化合物或组合物可单独使用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

有益技术效果

本发明中所有多肽或多肽衍生物均能够特异性地与TRIB3结合，从而阻断TRB3与P62蛋白的相互作用，并且大部分优先化合物都具体内抗肝纤维化活性，从而提供了一类结构新颖、活性强的可用于肝纤维化相关疾病或病症的治疗。

附图说明

图1为免疫组织化学方法检测正常人和肝硬化患者肝组织中TRIB3的表达结果。从左到右依次为正常肝组织、肝硬化肝组织TRIB3免疫组化染色后的代表性图片，以及统计结果。

图2为免疫组织化学方法检测正常人和肝硬化患者肝组织中p62的表达。从左到右依次为正常肝组织、肝硬化肝组织p62免疫组化染色后的代表性图片，以及统计结果。

图3为免疫共沉淀方法检测正常人和肝硬化患者肝组织中TRIB3与p62间相互作用结果图。其中输入代表初始组织裂解液，输出代表经过p62抗体沉淀过的裂解液。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明说明书中所述多肽或嵌合肽均由中国医学科学院药物研究所合成。其中以中文或英文缩写氨基酸时，采用本领域通用的氨基酸名称及英文缩写形式，如无明确说明单独的氨基酸名称及氨基酸英文缩写代表其为L型氨基酸，如苏氨酸或苏胺酰(Thr)表示其为L-型苏氨酸或L-型苏氨酰；相对应的D型氨基酸则在中文前添加“D-”或英文缩写前添加“(D)”，如D-苏氨酸或D-苏胺酰及“(D)Thr”表示其为D-型苏氨酸或D-型苏胺酰。

本发明在以三字符英文缩写氨基酸时，采用本领域通用的氨基酸名称及英文缩写形式，当其右侧为“-OH”时表示氨基酸为游离羧酸形式，当其左侧为“H-”时表示氨基酸为游离氨基形式，如“H-Thr-OH”表示其为氨基和羧基皆为游离形式的L-型苏氨酸。

本发明在以三字符英文缩写由多个氨基酸形成的肽链时，采用本领域通用的氨基酸名称及英文缩写形式，当其右侧为“-OH”时表示多肽为游离羧酸形式，当其左侧为“H-”时表示多肽为游离氨基形式，如“H-Gly-Trp-OH”表示其为氨基和羧基皆为游离形式的甘氨酰-色氨酸二肽。

无水溶剂为市售分析纯试剂经Pure Solv.溶剂纯化系统除水制备，其它试剂均为市售分析纯。

实验中所使用的化合物若无特别说明，均购买自Sigma公司。

实施例中所述的PBS，指浓度为0.1M，pH值为7.2的磷酸盐缓冲液。

实施例中所述的室温为本领域常规的室温，较佳地为15～30℃。

实验结果用均值±标准误表示，经参数或者非参数方差检验，经比较p<0.05被认为有显著性差异，p<0.01被认为有极其显著性差异。

实施例1免疫组织化学检测人肝脏组织TRIB3和p62表达

正常人和肝硬化患者的肝脏组织芯片购自US Biomax(BC03117)，芯片含正常肝组织5例，肝硬化组织22例。免疫组织化学染色检测肝脏组织TRIB3和p62蛋白表达变化，SP试剂盒(SP9001或SP9003)和显色剂DAB(ZLI-9032)由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。采用SABC(strept avidin-biotin complex)免疫组化染色方法进行检测，主要步骤包括：常规脱蜡、水化；3％过氧化氢去除内源性过氧化物酶；胰酶组织抗原修复；正常血清封闭；加一抗(TRIB3：Origene，用PBS以1:100稀释；p62：Sigma，用PBS以1:100稀释)4℃过夜；加入生物素化标记的抗兔属性二抗(中杉金桥，用PBS以1:100稀释)，ABC复合物(亲合素-生物素-过氧化物酶复合物)，DAB(二氨基联苯胺)覆盖组织并显色30秒，PBS洗脱；透明，封片。阳性染色为胞浆或胞核棕色颗粒，阴性对照以PBS或正常山羊血清代替一抗。

随后将免疫组化染色后的组织芯片置于正置显微镜下观察，并应用高清晰彩色病理图文分析系统Spot Advanced 3.0获得高清晰的TRIB3或p62蛋白表达的免疫组化图片(200倍放大)。使用Image-Pro Plus 5.1测量每个视野阳性染色的光密度值。每个标本随机选取10个视野，取均值代表一个肝脏组织样本内阳性蛋白的表达强度。通过非参数方差分析比较各组TRIB3和p62的表达差异。结果显示肝硬化组织中TRIB3和p62蛋白的表达均显著的高于其在正常人肝组织中的表达，分别为正常肝组织中TRIB3和p62的9.07倍和7.52倍。将每个肝硬化组织中TRIB3和p62蛋白的表达进行相关性分析，发现在肝硬化组织中TRIB3与p62存在正相关性，相关系数为0.765。实验结果以均值±标准差表示，并采用t-test检验肝硬化人肝组织组与正常人肝组织组间的差异。实验结果见表2、表3、附图1和附图2。

表2.免疫组化方法检测正常人肝组织和肝硬化患者肝组织中TRIB3蛋白表达差异

表3.免疫组化方法检测正常人肝组织和肝硬化患者肝组织中p62蛋白表达差异

实施例2免疫共沉淀法验证TRIB3蛋白与p62蛋白在人肝脏组织中的相互作用

免疫共沉淀试剂如下：

1)裂解液A液：0.6057g Tris碱，1.7532g NaCl，0.1017g MgCl

2)裂解液B液：200μL 2Mβ-磷酸甘油，4mL 2.5M NaF(氟化钠)，2mL 100mM NaVO

3)Protein A/G Plus-Agarose购自美国Santa Cruz公司。

具体操作步骤如下：

1)冰冻的正常人肝组织和肝硬化组织购自西安艾丽娜生物科技有限公司。

2)以免疫共沉淀裂解液裂解肝组织，收获总蛋白，将蛋白调整至15μg/μl，取200μg蛋白留作“输入蛋白裂解液”，以作为对照。

3)剩余蛋白(除“输入蛋白裂解液”之外的总蛋白，大约2mg)加入2μg p62抗体(购自Sigma公司)或者与p62抗体种属相同的正常IgG抗体(购自Santa Cruz公司)，同时加入10μL Protein A/G Plus-Agarose充分重悬，4℃缓慢旋转摇动过夜。4℃、3000rpm离心5min，小心吸除上清，宁可留下少量上清也不能吸到Agarose。加入0.5mL免疫共沉淀裂解液，混匀，冰浴静置1min，4℃、3000rpm离心30sec，小心吸除上清。重复洗涤5次，最后一次离心前静置5min。小心吸除上清，加入20-30μL 2×SDS凝胶加样缓冲液，混匀，95℃变性3min，迅速转移至冰浴冷却。12000rpm室温离心2min，上清即为沉淀的蛋白样品，取部分或全部进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

肝组织免疫共沉淀结果如图3所示，在肝硬化组织内TRIB3蛋白与p62蛋白表达均明显高于正常肝组织，而使用p62抗体沉淀后，肝硬化组织TRIB3随着p62的增多也相应增多，提示TRIB3和p62在肝脏组织中存在相互作用。

实施例3胆管结扎诱导的肝纤维化小鼠模型制备、实验分组及给药方案

雄性BALB/c(8～10周龄，20～22g)小鼠，隔夜禁食，戊巴比妥钠(45mg/kg，i.p.)麻醉。背部固定，沿腹中线剖开上腹部，暴露肝脏，小心分离肝叶找到胆管，使用0号手术线在相同胆总管位置两端结扎后剪断，后缝合肌肉与表皮。假手术组仅行上腹部剖开与缝合，造模后连续给予3天200U青霉素预防感染。每日记录体重及动物的死亡情况。

动物随机分为17组：假手术组，模型组，原型多肽A2(序列H

实施例4硫代乙酰胺诱导的肝纤维化小鼠模型制备、实验分组及给药方案

雄性BALB/c(8～10周龄，20～22g)小鼠，腹腔注射硫代乙酰胺(TAA)生理盐水溶液，剂量为200mg/kg，每周3次，持续注射12周。每日记录动物体重。

动物随机分为17组：假手术组，模型组，原型多肽A2(序列H

实施例5肝纤维化小鼠肝组织纤维化评价

胆管结扎和硫代乙酰胺会引起肝组织显著的纤维化和胶原沉积，从肝组织形态上看，模型小鼠肝组织表面出现黄色小粟粒样结节，SHA2-1、SHA2-2、SHA2-3、SHA2-4、SHA2-5、SHA2-6、SHA2-7、SHA2-8、SHA2-9、SHA2-10、SHA2-11、SHA2-12和SHA2-13多肽治疗均可以使模型小鼠肝脏表面更加光滑，明显降低了肝纤维程度，A2和SHA2-14治疗组小鼠肝组织表面形态改善不明显。

胶原绝对面积百分率是评价组织纤维化程度的可靠指标，利用Masson染色检测肝脏组织胶原沉积可以较好地反映肝纤维化的程度。实施例3和4结束后，收集肝脏最大叶经4％多聚甲醛固定，石蜡包埋并切片常规脱蜡水化，经Masson染色，确定肝脏胶原沉积情况判断纤维化程度，并应用高清晰彩色病理图文分析系统Spot Advanced 3.0获得高清晰的染色图片(200倍放大)。使用Image-Pro Plus 5.1测量每个视野特殊染色后胶原着色面积。每组分析6-8个标本，每个标本随机选取10个视野，取均值代表一个动物胶原在肝脏组织内的含量和表达强度。

在胆管结扎诱导的肝纤维化小鼠中，假手术组肝组织胶原组织相对较少，模型组和A2治疗组小鼠肝组织胶原明显增加，形成严重胶原沉积，SHA2-1、SHA2-2、SHA2-3、SHA2-4、SHA2-5、SHA2-6、SHA2-7、SHA2-8、SHA2-9、SHA2-10、SHA2-11、SHA2-12和SHA2-13多肽治疗可以显著降低胆管结扎诱导的肝组织胶原沉积，SHA2-14治疗组小鼠肝组织胶原沉积有部分改善，但与模型组比较不具有显著性差异。结果如表4所示。实验结果以均值±标准差表示，并采用t-test检验模型组与对照组间的差异、各多肽治疗组与模型组间的差异(#表示模型组与正常组比较，*表示多肽组与模型组比较)。

在硫代乙酰胺诱导的肝纤维化小鼠中，正常组小鼠肝组织胶原较少，模型组和A2治疗组小鼠肝脏胶原面积增至正常值的10.1倍和9.4倍，SHA2-1、SHA2-2、SHA2-3、SHA2-4、SHA2-5、SHA2-6、SHA2-7、SHA2-8、SHA2-9、SHA2-10、SHA2-11、SHA2-12和SHA2-13多肽治疗可以显著降低硫代乙酰胺诱导的肝组织胶原沉积，SHA2-14治疗组小鼠肝组织胶原沉积有部分改善，但与模型组比较不具有显著性差异。结果如表5所示。实验结果以均值±标准差表示，并采用t-test检验模型组与对照组间的差异、多肽治疗组与模型组间的差异。其中###为与假手术组相比p<0.001，*为与模型组相比p<0.05，**为与模型组相比p<0.01，***为与模型组相比p<0.001。

表4.多肽对胆管结扎诱导的肝纤维化小鼠肝组织胶原沉积的影响

表5.多肽对硫代乙酰胺诱导的肝纤维化小鼠肝组织胶原沉积的影响

α-SMA是肝脏中肌成纤维细胞的标志，它的含量反应肌成纤维细胞的多少，也是反应纤维化的重要指标之一。使用与实施例1相同的免疫组化染色的方法，一抗换成α-SMA(购自Cell-Signaling Technology，用PBS以1:100稀释)，将来源于正常小鼠、硫代乙酰胺诱导的肝纤维化小鼠和多肽治疗小鼠的肝组织切片并染色，使用正置显微镜采集高清晰免疫组化图片，Image-Pro Plus 5.1测量阳性染色的光密度值后，我们发现在硫代乙酰胺诱导的肝纤维化小鼠肝脏组织出现大量α-SMA，而SHA2-1、SHA2-2、SHA2-3、SHA2-4、SHA2-5、SHA2-6、SHA2-7、SHA2-8、SHA2-9、SHA2-10、SHA2-11、SHA2-12和SHA2-13多肽均可以显著降低α-SMA的表达水平，SHA2-14治疗会部分降低小鼠肝组织α-SMA表达，但与模型组比较不具有显著性差异。结果如表6所示。实验结果以均值±标准差表示，并采用t-test检验模型组与对照组间的差异、多肽治疗组与模型组间的差异。其中##为与假手术组相比p<0.01，*为与模型组相比p<0.05，**为与模型组相比p<0.01。

以上发现表明TRIB3与p62蛋白的相互作用在肝纤维化的发生过程中发挥重要作用，使用多肽打断其相互作用具有抗肝纤维化的治疗作用。

表6.多肽对硫代乙酰胺诱导的肝纤维化小鼠肝组织α-SMA表达的影响

实施例6肝纤维化小鼠肝功能评价

断定肝脏损伤的核心指标是血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)，它们是目前临床上判断肝细胞功能的最常用依据，其活力与肝病程度呈正相关。实施例3和4结束时，通过眼球取血，取小鼠新鲜血液约1ml，离心后取血清100ul。按照ALT和AST生化检测试剂盒说明书(购自南京建成生物技术公司)步骤，进行ALT和AST活力检测。

从肝功能上看，不论是胆管结扎诱导的肝纤维化模型小鼠还是硫代乙酰胺诱导的肝纤维化模型小鼠，其肝功能出现明显的下降，ALT和AST活力显著高于假手术组或正常组，给与SHA2-1、SHA2-2、SHA2-3、SHA2-4、SHA2-5、SHA2-6、SHA2-7、SHA2-8、SHA2-9、SHA2-10、SHA2-11、SHA2-12和SHA2-13多肽治疗均可以改善肝脏功能，显著降低ALT和AST的水平，A2和SHA2-14治疗对小鼠肝组织α-SMA的降低作用与模型组比较不具有显著性差异。结果如表7、表8、表9和表10所示。实验结果以均值±标准差表示，并采用t-test检验模型组与对照组间的差异、多肽治疗组与模型组间的差异。其中###为与假手术组相比p<0.001，*为与模型组相比p<0.05，**为与模型组相比p<0.01，***为与模型组相比p<0.001。

表7.多肽对胆管结扎诱导的肝纤维化小鼠ALT活力的影响

表8.多肽对胆管结扎诱导的肝纤维化小鼠AST活力的影响

表9.多肽对硫代乙酰胺诱导的肝纤维化小鼠ALT活力的影响

表10.多肽对硫代乙酰胺诱导的肝纤维化小鼠AST活力的影响

实施例7病理组织学分析

实施例4结束后，收集部分肝脏经4％多聚甲醛固定，石蜡包埋并进行横切，常规二甲苯脱蜡、梯度水化；滴加苏木素，染色10分钟以上，一相水冲洗干净；过一下1％盐酸酒精(10-20秒)，迅速流水返蓝15分钟，一相水冲洗干净；滴加1％伊红溶液染色2分钟，一相水冲净；无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；显微镜下观察拍照。评价方法：细胞核被苏木素染成蓝色。细胞浆、红细胞、结缔组织、嗜伊红颗粒等被伊红Y染成不同程度的红色或粉红色，用于观察基本组织细胞病理结构改变以及炎症细胞浸润情况。

发现硫代乙酰胺致小鼠肝脏组织的化学损伤，通过对损伤部位及周围炎性细胞的招募和侵润，引起了持续的慢性炎症。表现为：肝组织窦隙扩张，枯否氏细胞活化，肝组织窦隙弥漫性淋巴细胞浸润，多数汇管区周围炎症明显，多数汇管区小胆管扩张、增生，汇管区周围成纤维细胞增生明显，沿肝小叶间隙呈条索状分布，多见跨小叶纤维条索形成，汇管区周围肝细胞浊肿变性，局部可见肝细胞凝固性坏死，坏死灶周围可见炎症细胞浸润，坏死肝组织累及面积较大，坏死灶分布较为广泛。而给与SHA2-1、SHA2-2、SHA2-3、SHA2-4、SHA2-5、SHA2-6、SHA2-7、SHA2-8、SHA2-9、SHA2-10、SHA2-11、SHA2-12和SHA2-13多肽治疗均可以显著改善上述病理学变化，肝组织炎症评分与模型组比较均有显著性差异。A2和SHA2-14治疗对肝组织炎症改善作用与模型组比较不具有显著性差异。结果如表11所示。实验结果以均值±标准差表示，并采用t-test检验模型组与对照组间的差异、多肽治疗组与模型组间的差异。其中###为与假手术组相比p<0.001，*为与模型组相比p<0.05，**为与模型组相比p<0.01，***为与模型组相比p<0.001。

表11.多肽对硫代乙酰胺诱导的肝纤维化小鼠肝组织炎症的影响

实施例8免疫组织化学检测肝脏组织TGF-β1表达

TGF-β1是典型的Treg型细胞因子，它可以将肝脏星形细胞活化，并且产生细胞外基质促进肝脏纤维化。实施例4结束后，使用与实施例1相同的免疫组化染色的方法，一抗换成TGF-β1(购自Cell-Signaling Technology，用PBS以1:100稀释)，将来源于正常小鼠、硫代乙酰胺诱导的肝纤维化小鼠和多肽治疗小鼠的肝组织切片并染色，使用正置显微镜采集高清晰免疫组化图片，Image-Pro Plus 5.1测量阳性染色的光密度值后，我们发现在硫代乙酰胺诱导的肝纤维化小鼠肝脏组织出现大量TGF-β1，而SHA2-1、SHA2-2、SHA2-3、SHA2-4、SHA2-5、SHA2-6、SHA2-7、SHA2-8、SHA2-9、SHA2-10、SHA2-11、SHA2-12和SHA2-13多肽均可以显著降低TGF-β1的表达水平，A2和SHA2-14治疗对小鼠肝组织TGF-β1的降低作用与模型组比较不具有显著性差异。结果如表12所示。实验结果以均值±标准差表示，并采用t-test检验模型组与对照组间的差异、多肽治疗组与模型组间的差异。其中###为与假手术组相比p<0.001，**为与模型组相比p<0.01，***为与模型组相比p<0.001。

表12.多肽对硫代乙酰胺诱导的肝纤维化小鼠肝组织TGF-β1表达的影响

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