一种多糖或寡糖药物的含量的测定方法

技术领域

本发明属于天然药物化学领域，具体地涉及多糖或寡糖药物，特别是中性多糖或寡糖和酸性多糖或寡糖的含量的测定方法。

背景技术

多糖或寡糖是天然来源的主要的生物活性化合物，可来自植物、真菌等。多糖的分子量大，结构复杂，因此，多糖或寡糖的含量的准确测定是一个挑战。

多糖和寡糖含量测定的常用方法为硫酸咔唑法，该方法首先以浓度及单糖标准品的显色做标准曲线，再在标准曲线上读出待测样品的含量。但是酸性糖的单糖甘露糖醛酸并没有标准品出售，若以葡萄糖醛酸为标准品，其与酸性糖的结构及显色效率存在差异，不能对酸性糖进行精确定量。

另一方面，固体制剂口服给药后，药物的吸收取决于药物从制剂中的溶出、释放、在生理条件下的溶解以及在胃肠道的渗透等因素。由于药物的溶出和溶解对吸收具有重要影响，因此，体外溶出度试验可以预测其体内溶出行为，建立普通口服固体制剂体外溶出试验方法对于以下方面具有重要作用：评价药品各批次之间质量的一致性、指导新药制剂的研发、在药品发生如处方、生产工艺、生产场所等变更后确认药品的质量和疗效的一致性。

含有酸性多糖或寡糖的药物制剂，采用药典及相关法规性文件收录的一般口服固体制剂的溶出度常规测定方法进行检测，制剂在溶剂中崩解后，采用硫酸咔唑法测定溶出介质中酸性糖的含量存在诸多问题：该方法首先以浓度及单糖标准品的显色做标准曲线，再在标准曲线上读出待测样品的含量，但是酸性糖的单糖甘露糖醛酸并没有标准品出售，若以葡萄糖醛酸为标准品，其与酸性糖的结构及显色效率存在差异，不能对酸性糖进行精确定量；且在制剂溶出曲线绘制时样品较多，比色法操作起来较为繁琐耗时；该方法自身对浓硫酸品质要求高。

因此需要开发简单快速的方法来测定多糖或寡糖药物的含量，以及其制剂的溶出度。

发明内容

本发明提供了一种通过液相色谱法(例如HPLC)来测定多糖或寡糖药物的含量或者多糖或寡糖药物制剂的溶出度的方法。

示差折光检测器(RID)是通过连续测定色谱柱流出液折射率的变化而对样品浓度进行检测的，是一种非选择性液相色谱仪检测器，基本上对所有被测对象均有响应，但灵敏度较低，不适合做痕量分析，也不适合作梯度洗脱，常用于糖类等无紫外吸收物质的分析。蒸发光散射检测器(ELSD)是一种通用型检测器，不依赖于样品的光学特性，适用于半挥发性和不挥发性样品，灵敏度高于示差检测器。电雾式检测器(CAD)是通用型检测器，是一种新型原理的、高灵敏度、重现性较好的检测器，它基于雾化检测器的原理，洗脱液经雾化后形成颗粒，经过漂移管干燥后与带电氮气碰撞，使得目标化合物带上正电荷，最后，通过静电计测量电荷的量，该测量值与目标化合物的质量成一定比例关系。

由于糖药物的紫外吸收差，一般不能直接采用紫外检测器进行含量检测，基于糖类的折光性及不挥发特性，可以采用RID、ELSD和CAD进行糖含量检测；而对于药物制剂的溶出液分析，由于其中含有大量的溶出介质，药物浓度低，低灵敏度的RID上目标峰信号低，且容易受到溶剂峰的影响，这时可以采用ELSD和CAD检测器。在色谱柱的选择方面，由于溶出液中大量溶出介质的存在，某些介质会导致杂峰的出现，严重地影响了谱图数据的准确性。本发明人发现，大多数类型的色谱柱难以将糖从溶剂或大量的溶出介质中有效地分离出来。但我们发现采用二醇基亲水色谱柱和耐水性反相色谱柱可以获得较好的分离效果，能对多糖或寡糖进行含量测定，且可以同时对糖药物制剂，特别是酸性糖药物制剂的多种pH体系溶出液进行定量分析。因此，本发明人最终建立了HPLC连用RID、ELSD和CAD分析多糖或寡糖药物含量以及其制剂在水、盐酸、醋酸-醋酸钠缓冲体系、磷酸盐缓冲体系溶出液中的溶出度的测定方法。

为了实现对多糖或寡糖药物及其制剂的质量控制，本发明的一个方面提供了一种多糖或寡糖药物含量的测定方法，包含以下步骤：

(1)配制多糖或寡糖药物溶液作为供试品溶液；

(2)使用HPLC-ELSD法、HPLC-RID法或HPLC-CAD法测定供试品溶液中多糖或寡糖的含量；

其中，HPLC的色谱柱选自二醇基亲水色谱柱或耐水性反相色谱柱。

本发明的另一方面提供了一种多糖或寡糖药物制剂溶出度的测定方法，其特征在于，所述测定方法包含以下步骤：

(1)配制多糖或寡糖药物制剂溶出液作为供试品溶液；

(2)使用HPLC-ELSD法或HPLC-CAD法测定供试品溶液中多糖或寡糖药物制剂的溶出度；

其中，HPLC的色谱柱选自二醇基亲水色谱柱或耐水性反相色谱柱。

与常规的比色法相比，本发明提供的HPLC-ELSD法、HPLC-RID法或HPLC-CAD法专属性好、重复性佳、准确度良好，且简便快速，仅十分钟就能完成一针样品的分析。

附图说明

图1为Agilent Zorbax SB-Aq色谱柱(3.5μm，4.6×150mm)检测甘露寡糖二酸在水溶液中的HPLC-ELSD色谱图。

图2为Agilent Zorbax SB-Aq色谱柱检测甘露寡糖二酸胶囊pH1.2盐酸介质溶出液的HPLC-ELSD色谱图。

图3为Agilent Zorbax SB-Aq色谱柱检测甘露寡糖二酸胶囊pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲体系溶出液的HPLC-ELSD色谱图。

图4为Agilent Zorbax SB-Aq色谱柱检测甘露寡糖二酸胶囊pH6.8磷酸盐缓冲体系溶出液的HPLC-ELSD色谱图。

图5为Welch Ultimate LP-Aq色谱柱检测甘露寡糖二酸胶囊pH1.2盐酸介质溶出液的HPLC-ELSD色谱图。

图6为Acchrom X5H色谱柱检测甘露寡糖二酸胶囊pH1.2盐酸介质溶出液的HPLC-ELSD色谱图。

图7为阴离子交换色谱柱(Welch Ultimate XB-SAX)检测pH1.2盐酸介质的HPLC-UV色谱图。

图8为阴离子交换色谱柱(Welch Ultimate XB-SAX)检测甘露寡糖二酸胶囊pH1.2盐酸介质溶出液的HPLC-UV色谱图。

图9为糖分析色谱柱(GlycanPac AXH-1)检测pH6.8磷酸盐缓冲液的HPLC-ELSD色谱图。

图10为糖分析色谱柱(GlycanPac AXH-1)检测甘露寡糖二酸胶囊pH6.8磷酸盐缓冲体系溶出液的HPLC-ELSD色谱图。

图11为酰胺基质亲水色谱柱(Acchrom XAmide)检测pH6.8磷酸盐缓冲液的HPLC-ELSD色谱图。

图12为酰胺基质亲水色谱柱(Acchrom XAmide)检测甘露寡糖二酸胶囊pH6.8磷酸盐缓冲体系溶出液的HPLC-ELSD色谱图。

图13为Agilent Zorbax SB-Aq色谱柱(4.6×250mm，5μm)检测中性糖在水溶液中的HPLC-RID色谱图。

图14为Agilent Zorbax SB-Aq色谱柱检测甘露寡糖二酸含量的HPLC-CAD色谱图。

定义

耐水性反相色谱柱，相较于常规C18反相色谱柱，耐水性反相色谱柱的键合相经过修饰改性从而增强氢键作用。常见的耐水性反相色谱柱型号包括但不限于Acchrom X5H、Agilent Zorbax SB-Aq、Waters Atlantis T3 Column。

二醇基亲水色谱柱，是固定相为键合有二醇基，例如1,2-二羟基丙基丙醚官能团的含水正相色谱柱，用于多肽、蛋白以及极性药物分子等的分离纯化。常见的二醇基亲水性色谱柱型号包括但不限于Welch Ultimate LP-Aq。

具体实施方式

本发明的一个方面提供了一种多糖或寡糖药物含量的测定方法，包含以下步骤：

(1)配制多糖或寡糖药物溶液作为供试品溶液；

(2)使用HPLC-ELSD法、HPLC-RID法或HPLC-CAD法测定所述供试品溶液中多糖或寡糖的含量；

其中，HPLC的色谱柱选自二醇基亲水色谱柱或耐水性反相色谱柱。

在本发明的一个优选实施方案中，所述的多糖或寡糖药物为酸性多糖或寡糖药物或中性多糖或寡糖药物。

在本发明的一个优选实施方案中，所述的多糖或寡糖药物包括原料药和药物制剂。

在本发明的一个优选实施方案中，所述的酸性多糖或寡糖中含有羧基、硫酸酯基或磷酸酯基中的一种或多种。

在本发明的另一优选实施方案中，所述酸性多糖或寡糖包括但不限于：甘露寡糖二酸、聚甘露糖醛酸、聚古罗糖醛酸、藻酸双酯钠、聚甘露糖醛酸硫酸酯、聚古罗糖醛酸硫酸酯、肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、透明质酸、PI88、岩藻糖硫酸酯、卡拉胶、右旋糖酐硫酸酯等；所述肝素优选低分子量肝素。

在本发明的另一优选实施方案中，所述酸性多糖或寡糖选自：甘露寡糖二酸或肝素；所述肝素优选低分子量肝素。

在本发明的另一优选实施方案中，所述中性多糖或寡糖选自：灵芝多糖、香菇多糖、人参多糖。

在本发明的另一优选实施方案中，所述色谱柱选自：Acchrom X5H、AgilentZorbax SB-Aq、Waters Atlantis T3 Column或Welch Ultimate LP-Aq中的任意一种。

在本发明的另一优选实施方案中，所述色谱柱规格为5μm，4.6×250mm。

在本发明的另一优选实施方案中，所述挥发性盐的浓度为5-100mmol/L，优选10mmol/L。

在本发明的另一优选实施方案中，HPLC的流动相为有机相和挥发性盐溶液，其中有机相为乙腈，挥发性盐选自甲酸铵或乙酸铵；有机相与挥发性盐的体积比为0.25-1.5:1；流速为0.2-1.0mL/min。

在本发明的另一优选实施方案中，ELSD检测条件为：漂移管温度40-110℃，载气流速每分钟1.0-3.0L。

在本发明的另一优选实施方案中，RID检测条件为：温度为35℃，进样量10μL，采集时间10min。

在本发明的另一优选实施方案中，步骤(2)所述使用HPLC-ELSD法、HPLC-RID法或HPLC-CAD法测定所述供试品溶液中多糖或寡糖的含量的具体步骤包括：

(2-1)取适量多糖或寡糖对照品，用溶出介质配制一系列不同浓度的标准溶液，作为绘制多糖或寡糖色谱峰面积-浓度标准曲线的对照品溶液；

(2-2)取对照品溶液注入高效液相色谱，获得多糖或寡糖色谱峰峰面积，以对照品溶液的浓度的对数作为横坐标X，以色谱峰的峰面积的对数作为纵坐标Y，绘制多糖或寡糖色谱峰面积-浓度标准曲线；

(2-3)取供试品溶液注入高效液相色谱，获得多糖或寡糖色谱峰峰面积，根据标准曲线计算供试品溶液中的多糖或寡糖含量；

其中，所述高效液相色谱的色谱柱选自二醇基亲水色谱柱或耐水性反相色谱柱，并且以蒸发光散射检测器(ELSD)、示差折光检测器(RID)电雾式检测器(CAD)进行定量检测。

在本发明的另一优选实施方案中，步骤(2)所述使用HPLC-ELSD法、HPLC-RID法或HPLC-CAD法测定供试品溶液中多糖或寡糖的含量的具体步骤包括：

(2-1)取适量多糖或寡糖对照品，用溶出介质配制确定浓度的标准溶液，作为对照品溶液；

(2-2)取对照品溶液注入高效液相色谱，获得多糖或寡糖色谱峰峰面积；

(2-3)取供试品溶液注入高效液相色谱，获得多糖或寡糖色谱峰峰面积，根据对照品溶液的浓度和色谱峰峰面积采用外标一点法计算所述供试品溶液中多糖或寡糖的含量；

其中，所述高效液相色谱的色谱柱选自二醇基亲水色谱柱或耐水性反相色谱柱，并且以蒸发光散射检测器(ELSD)、示差折光检测器(RID)电雾式检测器(CAD)进行定量检测。

本发明的另一个方面提供了一种多糖或寡糖药物制剂溶出度的测定方法。

在本发明的优选实施方案中，所述多糖或寡糖药物制剂溶出度的测定方法包含以下步骤：

(1)配制多糖或寡糖药物制剂溶出液作为供试品溶液；

(2)使用HPLC-ELSD法或HPLC-CAD法测定所述供试品溶液中的多糖或寡糖的含量，进而求得溶出度；

其中，HPLC的色谱柱选自二醇基亲水色谱柱或耐水性反相色谱柱。

在本发明的一个优选实施方案中，所述的多糖或寡糖药物为酸性多糖或寡糖药物或中性多糖或寡糖药物。

在本发明的一个优选实施方案中，所述的酸性多糖或寡糖中含有羧基、硫酸酯基或磷酸酯基中的一种或多种。

在本发明的另一优选实施方案中，所述酸性多糖或寡糖包括但不限于：甘露寡糖二酸、聚甘露糖醛酸、聚古罗糖醛酸、藻酸双酯钠、聚甘露糖醛酸硫酸酯、聚古罗糖醛酸硫酸酯、肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、透明质酸、PI88、岩藻糖硫酸酯、卡拉胶、右旋糖酐硫酸酯等；所述肝素优选低分子量肝素。

在本发明的另一优选实施方案中，所述酸性多糖或寡糖选自：甘露寡糖二酸或肝素；所述肝素优选低分子量肝素。

在本发明的另一优选实施方案中，所述中性多糖或寡糖选自：灵芝多糖、香菇多糖、人参多糖。

在本发明的另一优选实施方案中，所述色谱柱选自：Acchrom X5H、AgilentZorbax SB-Aq、Waters Atlantis T3 Column或Welch Ultimate LP-Aq中的任意一种。

在本发明的另一优选实施方案中，所述色谱柱规格为5μm，4.6×250mm。

在本发明的另一优选实施方案中，所述挥发性盐的浓度为5-100mmol/L，优选10mmol/L。

在本发明的另一优选实施方案中，HPLC的流动相为有机相和挥发性盐溶液，其中有机相为乙腈，挥发性盐选自甲酸铵或乙酸铵；有机相与挥发性盐的体积比为0.25-1.5:1；流速为0.2-1.0mL/min。

在本发明的另一优选实施方案中，ELSD检测条件为：漂移管温度40-110℃，载气流速每分钟1.0-3.0L。

在本发明的另一优选实施方案中，RID检测条件为：温度为35℃，进样量10μL，采集时间10min。

在本发明的一个优选实施方案中，步骤(2)所述使用HPLC-ELSD法或HPLC-CAD法测定供试品溶液中多糖或寡糖药物制剂的溶出度的具体步骤包括：

(2-1)取适量多糖或寡糖对照品，用溶出介质配制一系列不同浓度的标准溶液，作为绘制多糖或寡糖色谱峰面积-浓度标准曲线的对照品溶液；

(2-2)取对照品溶液注入高效液相色谱，获得多糖或寡糖色谱峰峰面积，以对照品溶液的浓度的对数作为横坐标X，以色谱峰的峰面积的对数作为纵坐标Y，绘制多糖或寡糖色谱峰面积-浓度标准曲线；

(2-3)取供试品溶液注入高效液相色谱，获得多糖或寡糖色谱峰峰面积，根据标准曲线计算供试品溶液中的多糖或寡糖含量，进而求得溶出度；

其中，所述高效液相色谱的色谱柱选自二醇基亲水色谱柱或耐水性反相色谱柱，并且以蒸发光散射检测器(ELSD)或电雾式检测器(CAD)进行定量检测。

在本发明的另一优选实施方案中，所述多糖或寡糖药物制剂为酸性多糖或寡糖药物制剂。

在本发明的另一优选实施方案中，所述酸性多糖或寡糖药物制剂溶出度的测定方法，包括以下步骤：

(1)参照溶出度与释放度测定法，配制酸性多糖或寡糖药物制剂溶出液作为供试品溶液；

(2)取适量酸性多糖或寡糖对照品，用溶出介质配制一系列不同浓度的标准溶液，作为绘制标准曲线的对照品溶液；

(3)取对照品溶液注入高效液相色谱(HPLC)，获得酸性多糖或寡糖的色谱峰峰面积，以对照品溶液的浓度的对数作为横坐标X，以色谱峰的峰面积的对数作为纵坐标Y，绘制酸性多糖或寡糖色谱峰面积-浓度标准曲线；

(4)取供试品溶液注入高效液相色谱，获得酸性多糖或寡糖色谱峰峰面积，根据标准曲线计算含量，进而求得溶出度；

其中，所述高效液相色谱的色谱柱选自二醇基亲水色谱柱或耐水性反相色谱柱，并且以蒸发光散射检测器(ELSD)或电雾式检测器(CAD)进行定量检测。

在本发明的另一优选实施方案中，步骤(2)所述使用HPLC-ELSD法或HPLC-CAD法测定供试品溶液中多糖或寡糖药物制剂的溶出度的具体步骤包括：

(2-1)取适量多糖或寡糖对照品，用溶出介质配制确定浓度的标准溶液，作为对照品溶液；

(2-2)取对照品溶液注入高效液相色谱，获得多糖或寡糖色谱峰峰面积；

(2-3)取供试品溶液注入高效液相色谱，获得多糖或寡糖色谱峰峰面积，根据对照品溶液的浓度和色谱峰峰面积采用外标一点法计算所述供试品溶液中多糖或寡糖的含量，进而求得溶出度；

其中，所述高效液相色谱的色谱柱选自二醇基亲水色谱柱或耐水性反相色谱柱，并且以蒸发光散射检测器(ELSD)或电雾式检测器(CAD)进行定量检测。

在本发明的另一个优选实施方案中，所述酸性多糖或寡糖药物为甘露寡糖二酸。

在本发明的另一个优选实施方案中，所述酸性多糖或寡糖药物制剂为甘露寡糖二酸胶囊。

在本发明的另一个优选实施方案中，所述甘露寡糖二酸胶囊溶出度的测定方法，包括以下步骤：

(1)参照溶出度与释放度测定法，配制甘露寡糖二酸胶囊溶出液作为供试品溶液；

(2)取适量甘露寡糖二酸对照品，用溶出介质配制成一系列不同浓度的标准溶液，作为绘制标准曲线的对照品溶液；

(3)取对照品溶液注入高效液相色谱，获得甘露寡糖二酸的色谱峰峰面积，以对照品溶液的浓度的对数作为横坐标X，以色谱峰的峰面积的对数作为纵坐标Y，绘制甘露寡糖二酸标准曲线；

(4)取供试品溶液注入高效液相色谱，获得甘露寡糖二酸的色谱峰峰面积，根据标准曲线计算含量，进而求得溶出度；

其中，所述高效液相色谱的色谱柱选自二醇基亲水色谱柱或耐水性反相色谱柱，并且以蒸发光散射检测器(ELSD)或电雾式检测器(CAD)进行定量检测。

在本发明的另一个优选实施方案中，所述甘露寡糖二酸胶囊溶出度的测定方法，具体步骤如下：

(1)取甘露寡糖二酸胶囊，参照溶出度与释放度测定法(通则0931第一法)，分别以900mL pH1.2盐酸溶液、pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液、pH6.8的磷酸盐缓冲溶液作为溶出介质，转速为每分钟50转，依法操作，经30分钟时，取适量溶出液，过滤后作为供试品溶液；

(2)另取适量甘露寡糖二酸对照品，在甘露寡糖二酸胶囊完全溶出的50％-150％浓度范围内至少选取5个浓度点，用相同溶出介质配制5个不同浓度的标准溶液，作为绘制甘露寡糖二酸色谱峰面积-浓度标准曲线的对照品溶液；

(3)取对照品溶液注入高效液相色谱，以对照品溶液的浓度的对数作为横坐标X，以色谱峰的峰面积的对数作为纵坐标Y，绘制甘露寡糖二酸色谱峰面积-浓度标准曲线；

(4)取供试品溶液注入高效液相色谱，获得甘露寡糖二酸的色谱峰面积，根据标准曲线计算含量，进而求得溶出度。

所述步骤(3)、(4)的色谱条件为：色谱柱为Agilent Zorbax SB-Aq(5μm,4.6×250mm)；流动相为乙腈-10mmol/L甲酸铵(体积比为25:75)；流速0.4mL/min；柱温30℃；蒸发光散射检测器进行检测(参考条件：漂移管温度40-90℃，载气流速每分钟1.6L)，150mg规格供试品进样20μL、450mg规格供试品进样10μL，采集时间12min。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

取甘露特钠(甘露寡糖二酸)对照品适量，用超纯水配制成10mg/mL的溶液，作为对照品储备液。吸取适量对照品储备液，用超纯水分别稀释制成每1mL中含本品0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.1mg、1.2mg、1.3mg的系列溶液，经0.22μm滤膜滤过，取续滤液作为对照品溶液(1)～(7)。取甘露特钠供试品适量，精密称定，用超纯水溶解并稀释制成每1mL中约含1mg的溶液，经0.22μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。分别精密量取对照品系列溶液、供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。系统适用性：对照品溶液(4)进样6次，计算后5次进样结果，糖峰面积相对标准偏差为1.4％；以对照品糖峰面积的对数和对照品溶液浓度的对数作标准曲线y＝1.6525x-1.1776，R

实施例2

取150mg规格的甘露寡糖二酸胶囊，按照溶出度与释放度测定法(通则0931第一法)，以pH1.2的盐酸溶液900mL为溶出介质，转速为每分钟50转，依上述方法操作，经30分钟时，取溶出液适量，过滤后作为供试品溶液。另取甘露寡糖二酸对照品适量，用pH1.2的盐酸介质配制成每1mL含有1.67mg的溶液，作为对照品10倍浓缩液。分别吸取浓缩液0.5mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.5mL至10mL容量瓶中，用溶出介质定容，作为对照品溶液(1)、(2)、(3)、(4)、(5)。按照高效液相色谱法(通则0512)测定，采用Agilent Zorbax SB-Aq色谱柱(5μm,4.6x 250mm)，以乙腈-10mM甲酸铵(体积比为25:75)为流动相，流速为每分钟0.4mL，柱温为30℃，用Agilent 1260ELSD进行检测(雾化温度40℃，蒸发温度40℃，载气为氮气，载气流速每分钟1.6L)，进样量20μL，采集时间12min。以对照品浓度的对数为横坐标X，峰面积的对数为纵坐标Y，得线性回归方程Y＝1.9049X-4.0844，R

实施例3

取150mg规格的甘露寡糖二酸胶囊，按照溶出度与释放度测定法(通则0931第一法)，以pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液900mL为溶出介质，转速为每分钟50转，依法操作，经30分钟时，取溶出液适量，过滤后作为供试品溶液。另取甘露寡糖二酸对照品适量，用pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液介质配制成每1mL含有1.67mg的溶液，作为对照品10倍浓缩液。分别吸取浓缩液0.5mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.5mL至10mL容量瓶中，用溶出介质定容，作为对照品溶液(1)、(2)、(3)、(4)、(5)。按照高效液相色谱法(通则0512)测定，采用AgilentZorbax SB-Aq色谱柱(5μm,4.6x 250mm)，以乙腈-10mM甲酸铵(体积比为25:75)为流动相，流速为每分钟0.4mL，柱温为30℃，用Agilent 1260ELSD进行检测(雾化温度40℃，蒸发温度40℃，载气为氮气，载气流速每分钟1.6L)，进样量20μL，采集时间12min。以对照品浓度的对数为横坐标X，峰面积的对数为纵坐标Y，得线性回归方程Y＝1.8694X-3.3548，R

实施例4

取150mg规格的甘露寡糖二酸胶囊，按照溶出度与释放度测定法(通则0931第一法)，以pH6.8的磷酸盐缓冲溶液900mL为溶出介质，转速为每分钟50转，依法操作，经30分钟时，取溶出液适量，过滤后作为供试品溶液。另取甘露寡糖二酸对照品适量，用pH6.8的磷酸盐缓冲溶液介质配制成每1mL含有1.67mg的溶液，作为对照品10倍浓缩液。分别吸取浓缩液0.5mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.5mL至10mL容量瓶中，用溶出介质定容，作为对照品溶液(1)、(2)、(3)、(4)、(5)。按照高效液相色谱法(通则0512)测定，采用Agilent Zorbax SB-Aq色谱柱(5μm,4.6x 250mm)，以乙腈-10mM甲酸铵(体积比为25:75)为流动相，流速为每分钟0.4mL，柱温为30℃，用Agilent 1260ELSD进行检测(雾化温度40℃，蒸发温度40℃，载气为氮气，载气流速每分钟1.6L)，进样量20μL，采集时间12min。以对照品浓度的对数为横坐标X，峰面积的对数为纵坐标Y，得线性回归方程Y＝1.8037X-2.9713，R

实施例5

按照实施例2的方法进行，色谱柱采用Welch Ultimate LP-Aq(5μm,4.6x 250mm)进行替换，以乙腈-10mM甲酸铵(体积比为25:75)为流动相，流速为每分钟0.4mL，柱温为30℃，用Agilent 1260ELSD进行检测(雾化温度40℃，蒸发温度40℃，载气为氮气，载气流速每分钟1.6L)，进样量20μL，采集时间12min。取不同批次的甘露寡糖二酸胶囊3批分别进行测定，得到30min时的溶出量均在标示量的80％以上，符合规定。HPLC-ELSD色谱图如图5所示。

实施例6

按照实施例2的方法进行，色谱柱采用Acchrom X5H(5μm,4.6x250mm)进行替换，以乙腈-10mM甲酸铵(体积比为60:40)为流动相，流速为每分钟0.6mL，柱温为35℃，用Agilent1260ELSD进行检测(雾化温度40℃，蒸发温度40℃，载气为氮气，载气流速每分钟1.6L)，进样量20μL，采集时间12min。取不同批次的甘露寡糖二酸胶囊3批分别进行测定，得到30min时的溶出量均在标示量的80％以上，符合规定。HPLC-ELSD色谱图如图6所示。

实施例7比较例

按照实施例2的方法进行，色谱柱采用Welch Ultimate XB-SAX(5μm,4.6x 250mm)进行替换，流动相为:A-2.3mM NaH

柱温为40℃，紫外检测波长210nm，进样量20μL，采集时间40min。pH1.2的盐酸介质和甘露寡糖二酸溶出液的HPLC-UV色谱图分别如图7和图8所示。对比pH1.2的盐酸介质，甘露寡糖二酸在该色谱条件下出峰较多且峰型差，不利于定量。

实施例8比较例

按照实施例4的方法进行，色谱柱采用GlycanPac AXH-1(5μm,4.6x250mm)进行替换，以流动相为:C-ACN；D-10mM HCOONH

柱温为30℃，用Agilent 1260ELSD进行检测(雾化温度40℃，蒸发温度40℃，载气为氮气，载气流速每分钟1.6SLM)，进样量20μL，采集时间30min。pH6.8介质和甘露寡糖二酸溶出液的HPLC-ELSD色谱图分别如图9和图10所示，甘露寡糖二酸完全掩盖在介质峰中。

实施例9

按照实施例4的方法进行，色谱柱采用XAmide(5μm,4.6x 250mm)进行替换，以流动相为:A-H

柱温为30℃，用Agilent 1260ELSD进行检测(雾化温度40℃，蒸发温度40℃，载气为氮气，载气流速每分钟1.6SLM)，进样量20μL，采集时间20min。pH6.8的磷酸盐缓冲溶液介质和甘露寡糖二酸溶出液的HPLC-ELSD色谱图分别如图11和图12所示，甘露寡糖二酸完全掩盖在介质峰中。

实施例10

取甘露寡糖二酸适量，用水溶解并配制成1mg/mL的溶液，过滤后作为供试品溶液，同法操作平行制备6份，作为重复性溶液。另取甘露寡糖二酸对照品适量，用水配制成每1mL含有10mg的溶液，作为对照品10倍浓缩液。分别吸取浓缩液0.7mL、0.8mL、0.9mL、1.0mL、1.1mL、1.2mL、1.3mL至10mL容量瓶中，用水定容至刻度，作为对照品溶液(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)。吸取供试品溶液与对照品溶液(4)按照体积比1:1混合，平行制备6份，做为准确度溶液。分别采用本方法和比色法进行测定。

本方法采用Agilent Zorbax SB-Aq色谱柱(5μm,4.6x 250mm)，以乙腈-10mM甲酸铵(体积比为25:75)为流动相，流速为每分钟0.4mL，柱温为30℃，用Agilent 1260ELSD进行检测(雾化温度40℃，蒸发温度40℃，载气为氮气，载气流速每分钟1.6L)，进样量20μL，采集时间12min。以对照品浓度的对数为横坐标X，峰面积的对数为纵坐标Y，得线性回归方程Y＝1.7307X-1.2851，R

比色法采用苯酚-硫酸法，吸取对照品溶液、供试品溶液各100μL，分别置10mL具塞试管中。加入6％苯酚溶液500μL，加入浓硫酸3mL，盖上塞，涡旋混匀，置沸水浴10min，取出放至室温，涡旋混匀，吸取200μL至96孔板中，于490nm处测吸光度，记录吸光度，以标准曲线计算供试品溶液的糖含量。两种方法的线性相关系数、重复性、准确度、操作难易程度比较见表1。

表1

实施例11

取灵芝多糖或寡糖适量，用水溶解并配制成10mg/mL的溶液，过滤后作为供试品溶液。另取对照品适量，用水配制成每1mL含有10mg的溶液。采用Agilent Zorbax SB-Aq色谱柱(5μm,4.6x 250mm)，以乙腈-0.2mM乙酸铵(体积比为40:60)为流动相，流速为每分钟0.5mL，柱温为30℃，用RID进行检测(温度为35℃)，进样量10μL，采集时间10min。以外标一点法进行含量计算：含量(实湿，％)＝样品峰面积/对照品峰面积×对照品定值×100，测得灵芝多糖或寡糖含量为95.2％，如图13所示。

实施例12

取甘露寡糖二酸适量，用水溶解并配制成0.5mg/mL的溶液，过滤后作为供试品溶液，平行制备2份。另取甘露寡糖二酸对照品适量，用水配制成每1mL含有5mg的溶液，作为对照品10倍浓缩液。分别吸取浓缩液0.5mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL至10mL容量瓶中，用水定容至刻度，作为对照品溶液(1)、(2)、(3)、(4)、(5)。

本方法采用Agilent Zorbax SB-Aq色谱柱(5μm,4.6x 250mm)，以乙腈-1mM甲酸铵(体积比为40:60)为流动相，流速为每分钟0.4mL，柱温为30℃，用CAD进行检测(蒸发温度50℃)，进样量10μL，采集时间12min。CAD检测器的响应为非线性响应，一般为二次函数关系即Y＝a*X2+b*X+c，其中A为检测得到的峰面积，C为实测样品浓度，得线性回归方程Y＝-6.4175X2+34.31X+3.3754，R2＝0.9996，再根据回归方程计算甘露寡糖二酸含量为95.9％(RSD＝0.5％)。见图14。