一种结球甘蓝总硫苷的提取方法与应用

技术领域

本发明属于天然产物提取的技术领域，涉及一种结球甘蓝总硫苷的提取方法与应用。

背景技术

结球甘蓝(BrassicaoleraceaL.var.capitataL.)作为一种高产经济作物，具有耐寒、抗病、耐贮存、耐运输、产量高等特点。相较于许多农作物对环境的特殊要求，结球甘蓝的强大适应能力使其可以广泛分布生长。因此，结球甘蓝在中国各地均有栽培，是中国北部地区主要的蔬菜之一。研究报道，结球甘蓝富含抗坏血酸、B族维生素、叶酸及多酚等物质，特别是硫代葡萄糖苷(glucosinolates，GLs)含量丰富，其水解产物异硫氰酸盐(isothiocyanate，ITCs)是迄今为止蔬菜中发现的最具抗癌作用的生物活性物质。除此之外，多酚类物质具有清除自由基、抗氧化的能力，可抑菌消炎、抗病毒、减少心血管疾病及癌症的发病几率。因此，结球甘蓝是一种值得提倡大量食用的蔬菜，能够在一定程度上降低心血管疾病及癌症的发生风险。

GLs根据支链的不同可分为脂肪族、芳香族和吲哚族三大类，其可被黑芥子酶快速水解成ITCs、硫氰酸盐和腈盐等物质。研究显示，ITCs可有效地防止饮食中多环芳烃、杂环胺和亚硝胺等物质引起的DNA损伤，对肝癌、肺癌、乳腺癌和食道癌的形成有明显的阻断作用。ITCs还具有杀菌、抗虫、抗氧化、抑制血小板聚集等作用。近年，有研究显示结球甘蓝的甲醇提取物可在体外水平有效抑制氧化应激对H9C2细胞的损伤，该保护作用与ERK1/2、JNK和p38的蛋白表达水平密切相关。作为结球甘蓝中含量最丰富的高活性成分，GLs可能在心肌保护方面具有潜在的价值。

目前对于GLs的提取与应用主要针对芸薹属植物(青花菜、莱菔子、西蓝花等)，其一：不同植物所含GLs的种类不同、含量不同，因此在提取工艺上也存在明显的区别，无法直接在结球甘蓝中GLs的提取中采用针对其他植物的现有工艺，如青花菜提取工艺中获得产物中GLs的含量仅为414.98μmol/g，莱菔子工艺产物中GLs的含量仅约为53％；其二：不同来源及组成的GLs在应用中存在较多差异，如富含GLs的西蓝花提取物主要应用于胰岛素抵抗相关的疾病；其三：虽然新鲜结球甘蓝的亩产量约为2500～4000kg/亩，但在加工和运输过程中约40％的叶被丢弃或作为动物饲料使用，因此在不影响正常结球甘蓝供应市场的前提下可为规模化生产提供充足的原料来源；其四：结球甘蓝适应性强，在全国各地均有栽培，因此对选择种植和深入加工的地点约束性较小，具有良好的推广前景；其五：虽然已有部分GLs对心血管系统的保护作用研究，但尚缺GLs对心衰方面的研究报道，特别是缺少结球甘蓝中GLs对心衰的作用报道，以结球甘蓝中总GLs为目标进行开发，可更好地挖掘结球甘蓝的市场价值，产生经济效益。

因此，研究结球甘蓝中GLs含量，确定最佳提取工艺，同时测定其在体内外抗心衰作用，不但能够为结球甘蓝GLs的推广应用提供数据支持，同时也是深入挖掘结球甘蓝生物利用价值及经济开发潜力的理论依据。

发明内容

针对现有技术中提取GLs存在的提取率不高、分离材料价格昂贵、产物含量低等技术问题，本发明提出一种结球甘蓝总硫苷的提取方法与应用。通过百里酚法检测获得的结球甘蓝GLs，其含量高达1.43mmol/g，并且结球甘蓝GLs在抗心衰方面表现出了优越的性能，应用前景广阔。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种结球甘蓝中GLs的提取方法，步骤如下：

(1)取破壁粉碎、烘干后的结球甘蓝叶粉末加入至乙醇溶液中，乙醇热回流提取、抽滤，滤液经减压浓缩得到结球甘蓝总提取物；

(2)用醋酸铅水溶液溶解步骤(1)所得的结球甘蓝总提取物，室温静置后抽滤，滤液经减压浓缩、冷冻干燥，得到结球甘蓝粗总硫苷；

(3)以无水乙醇固液萃取步骤(2)所得的结球甘蓝粗总硫苷，以柱色谱分离、纯化得结球甘蓝总硫苷。

进一步，所述步骤(1)中乙醇溶液的体积分数为0～100％。

优选地，所述步骤(1)中乙醇溶液的体积分数为50％。

进一步，所述步骤(1)中结球甘蓝叶粉末与乙醇溶液的质量体积比为1g:(5～20)mL。

优选地，所述步骤(1)中结球甘蓝叶粉末与乙醇溶液的质量体积比为1g:13mL。

进一步，所述步骤(1)中乙醇热回流提取时间为0.5～3h，乙醇热回流提取温度为85℃。

优选地，所述步骤(1)中乙醇热回流提取时间为2.5h。

进一步，所述步骤(2)中醋酸铅水溶液浓度为0.01～0.05mmol/L，结球甘蓝总提取物与醋酸铅水溶液的质量体积比为1g:20mL。

优选地，所述步骤(2)中醋酸铅水溶液浓度为0.04mmol/L。

进一步，所述步骤(2)中室温静置的时间为12h。

进一步，所述步骤(3)中结球甘蓝粗总硫苷与无水乙醇的质量体积比为1g:(5～13)mL；所述柱分离、纯化时选用的物质为硅胶，其中，硅胶分离纯化时的洗脱剂为体积比5:1和3.5:1的乙酸乙酯和甲醇的混合溶液。

优选地，所述步骤(3)中结球甘蓝粗总硫苷与无水乙醇的质量体积比为1g:12mL。

进一步，利用上述方法提取的结球甘蓝中GLs。

进一步，所述的结球甘蓝GLs在制备抗心衰药物中的应用。

进一步，所述的结球甘蓝GLs在制备通过调控心肌细胞糖酵解的异常激活改善心衰的药物中的应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明首次以结球甘蓝中GLs为目标进行了工艺研究，为结球甘蓝潜在价值的开发提供依据。研究结果表明：以硅胶柱色谱分离，相较于其他柱色谱的价格更加低廉，分离成本低。分离后GLs的含量为1.43±0.08mmol/g，分离后所得总GLs占分离前提取物中所有硫苷的17.00±1.41％。

2、本发明首次明确评价硫苷类成分在非疾病诊断或治疗为目的的抗心衰方面的应用，取得较为理想的效果，研究结果表明：结球甘蓝GLs对心衰模型中各血液因子如BNP的表达水平、NO的浓度、细胞肥大的程度、乳酸浓度、丙酮酸浓度具有显著的抑制作用，具有明显的细胞保护作用。本发明为GLs在抗心衰方面的应用提供研究基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明应用例体外培养基中BNP的含量检测结果。

图2为本发明应用例体外培养基中NO的含量检测结果。

图3为本发明应用例H9C2细胞肥大实验的检测结果。

图4为本发明应用例体外培养基中乳酸的含量检测结果。

图5为本发明应用例体外培养基中丙酮酸的含量检测结果。

图6为本发明应用例大鼠心肌组织HE检测结果。

图7为本发明应用例大鼠血清中BNP含量检测结果。

图8为本发明应用例大鼠血清中NO含量检测结果。

图9为本发明应用例大鼠血清中乳酸含量检测结果。

图10为本发明应用例大鼠血清中丙酮酸含量检测结果。

图11为本发明应用例大鼠心肌组织免疫组化染色检测结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例结球甘蓝GLs的提取方法，步骤如下：

取干燥结球甘蓝叶，破壁粉碎后过100目筛，结球甘蓝叶粉末以65℃烘干24h。精密称取5g干燥粉末，按照重量体积比1g:20mL的比例加入100mL的各浓度乙醇溶液。热回流提取3h。抽滤去除滤渣，滤液以60℃减压浓缩得粘稠总提取物。总提取物以冷冻干燥机-80℃干燥48h。精密称量各总提取物的重量，并以百里酚检测法检测提取物中GLs的含量。检测结果如表1所示：在0～50％乙醇浓度范围内，总提取物的得率由46.6±3.2％上升至55.4±2.2％，随着乙醇浓度升高，总提取物的得率开始不断降低，在100％提取时得率下降至41.9±3.1％。同时，对各不同提取物的GLs含量检测结果显示，在20％～80％乙醇的提取条件下，提取物中的GLs含量均在0.15mmol/g以上。

表1不同浓度乙醇对结球甘蓝提取率及提取物总硫苷含量的影响

实施例2

本实施例结球甘蓝GLs的提取方法，步骤如下：

精密称取5g结球甘蓝叶干燥粉末，以50％乙醇热回流提取3h。重量体积比为1g：5mL～1g:20mL。抽滤去除滤渣，滤液以60℃减压浓缩得粘稠总提取物。总提取物以冷冻干燥机-80℃干燥48h。精密称量各总提取物的重量。检测结果如表2所示：在1:5～1:13的物料比范围内，随着提取溶液体积的增加，总提取物的得率不断增加。但是，在检测范围内超过该比例后即使继续增加提取溶液的体积，提取物的得率也保持在一个稳定的范围内不变。

表2不同物料比对结球甘蓝总提取物得率的影响

实施例3

本实施例结球甘蓝GLs的提取方法，步骤如下：

精密称取5g结球甘蓝叶干燥粉末，以50％乙醇按照重量体积比1g:13mL的比例热回流提取，提取时间分别为0.5～3h。抽滤去除滤渣，滤液以60℃减压浓缩得粘稠总提取物。总提取物以冷冻干燥机-80℃干燥48h。精密称量各总提取物的重量。检测结果如表3所示：提取时间在0.5～2.5h范围内，随着提取时间的增加，提取物的得率由48.9±2.9％上升至55.7±1.3％。其后即使增加提取时间，在检测范围内得率也没有明显变化。

表3不同提取时间对结球甘蓝总提取物得率的影响

实施例4

本实施例结球甘蓝GLs的提取方法，步骤如下：

精密称取5g结球甘蓝叶干燥粉末，以50％乙醇按照重量体积比1g:13mL的比例热回流2.5h。抽滤去除滤渣，滤液以60℃减压浓缩得粘稠总提取物。总提取物以冷冻干燥机-80℃干燥48h。精密称取干燥总提取物1g，按照重量体积比1g:20mL的比例以不同浓度的醋酸铅溶液溶解干燥提取物。室温条件下静置12h，沉降清除提取物中的蛋白质及部分多酚类成分。抽滤，滤液减压浓缩，以冷冻干燥机-80℃干燥48h，滤渣以60℃干燥24h。通过计算获得醋酸铅沉降后的总提取物剩余率。检测结果如表4所示：通过不同浓度的醋酸铅溶液沉降总提取物中非硫苷类杂质，当醋酸铅的浓度在0.04mmol/L时，总提取物中约17.2％的杂质被清除，总提取物的剩余率为82.8±2.7％，该情况下可认为沉降完全，即使增加醋酸铅的浓度，沉降杂质的量也不再增加。

表4不同浓度醋酸铅溶液比对结球甘蓝提取物中杂质清除的影响

实施例5

本实施例结球甘蓝GLs的提取方法，步骤如下：

按照上述操作方法获得经0.04mol/L醋酸铅沉降干燥后的粗提取物，该粗提取物中含有77.1％的样品及24.6％的醋酸铅无机盐。精密称取1g样品，以无水乙醇进行固液萃取，去除无机盐。萃取液以60℃减压浓缩，并经冷冻干燥机-80℃干燥48h后得粗GLs。粗GLs得率及GLs的含量如表5所示：当萃取液无水乙醇的比例不断增大时，可知粗GLs的得率不断升高，相应的其中GLs的含量也在不断变化，当物料比为1:12时，无水乙醇萃取的得率为10.4±0.3％，此时萃取物中GLs的含量达到最高值0.56±0.02mmol/g。虽然随着无水乙醇的体积增加，无水乙醇萃取物的得率仍然在不断升高，但其所含GLs的含量开始降低。

表5不同固液比对结球甘蓝中粗总硫苷得率和含量的影响

实施例6

本实施例为结球甘蓝GLs的提取方法，步骤如下：

将实施例5制备的结球甘蓝粗GLs 1g用不同的柱色谱填料(DEAE Sephadex A-25、Sephadex LH-20、Dowex 50、活性炭和硅胶)进行分离，分别以相应的洗脱剂洗脱。其中DEAESephadexA-25以pH 9～2的水溶液梯度洗脱，Sephadex LH-20以50％甲醇水溶液等度洗脱，Dowex 50以pH 2～7的水溶液梯度洗脱；活性炭以0～95％乙醇水溶液梯度洗脱，硅胶分别以乙酸乙酯：甲醇＝5:1～3.5:1梯度洗脱。结果显示：(1)DEAE SephadexA-25在以pH 9～2水溶液洗脱时，在pH＝9到pH＝3的范围内无洗脱效果，在pH＝2时粗GLs被完全洗脱下来，因此DEAE SephadexA-25对结球甘蓝中GLs无明显的分离纯化作用；(2)Sephadex LH-20在以50％甲醇-水溶液等度洗脱时，粗GLs无明显的分离效果，因此Sephadex LH-20对结球甘蓝中GLs无明显分离纯化作用；(3)Dowex 50在以pH 2～7的水溶液洗脱时，pH＝2即将所有粗GLs洗脱下来，因此Dowex 50对结球甘蓝GLs无明显的分离纯化作用；(4)活性炭在以0～95％乙醇水溶液洗脱时，0％乙醇水溶液洗脱部位得到回收产物311±38mg，GLs含量仅为0.04±0.03mmol/g，10～95％乙醇水溶液洗脱部位无洗脱效果，粗GLs中GLs因被活性炭吸附而损失；(5)在硅胶柱色谱中，收集乙酸乙酯:甲醇＝3.5:1部位的洗脱液，干燥后以甲醇清洗，即可得到透明晶体，即为纯化后的结球甘蓝总硫苷(Brassica oleraceaglucosinolates，BOG)。收集的BOG重量为172±14mg，GLs含量为1.43±0.08mmol/g，分离后所得GLs占分离前提取物中所有GLs的17.00±1.41％。

综上所述，本发明对结球甘蓝总硫苷的提取方法进行了研究，研究结果表明：

(1)提取条件优化：以不同浓度的乙醇进行提取，以50％乙醇提取时提取物的得率最高，提取物达到55.5±2.2％，同时该条件下总硫苷的提取较为完全，为0.16±0.02mmol/g。

(2)物料比：将1g粉末溶于13mL酒精中提取效果最好，得率55.6±1.2％。

(3)乙醇热回流提取时间为2.5h最佳，总提取物的得率为55.6±1.3％。

(4)以0.04mmol/L醋酸铅溶液按照1g:20mL的比例沉降，结球甘蓝总硫苷粗提取物的得率为82.8±2.7％。

(5)醋酸铅沉降后滤液减压浓缩，冷冻干燥后粉末以无水乙醇萃取粉末重量:无水乙醇体积(g/mL)＝1:12时，粗GLs的得率为10.4±0.3％，其中总硫苷的含量为0.56±0.02mmol/g。

(6)分别使用DEAE SephadexA-25、Sephadex LH-20、Dowex 50、活性炭和硅胶对结球甘蓝总硫苷进行进一步的分离纯化。研究发现：在以硅胶进行纯化时，以乙酸乙酯:甲醇＝5:1去除部分杂质后，再以乙酸乙酯:甲醇＝3.5:1洗脱，收集洗脱液干燥后以甲醇清洗，即可得到透明晶体，即纯化后的BOG。经检验，纯化后BOG中GLs的含量为1.43±0.08mmol/g，纯化后所得BOG中GLs占分离前提取物中所有GLs的17.00±1.41％。

应用例

结球甘蓝总硫苷在抗心衰方面的应用，步骤如下：

1.体外实验

1.1方法：将培养好的大鼠心肌细胞H9C2(2-1)消化计数后按10000/孔的数量接种植96孔板中，以含10％FBS和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基在37℃孵育箱中培养。待细胞长至70-80％密度后，更换成含2％FBS的培养基，用培养基将BOG稀释至所需浓度加入到孔中进行预处理。预处理3h后，添加诱导剂异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO；50μM)(溶剂为纯水)共培养48h建立体外心衰模型。设立空白对照组(Control)，每组实验平行三次。药物组分别为美托洛尔(metoprolol,ME；100μM)和BOG(25,50和100μg/mL)(其溶剂均为纯水)

1.2结果

1.2.1BNP浓度检测

BNP为B型钠尿肽，是心衰的标志性物质，其表达水平的高低可直观反应心衰模型的建立是否成功，因此检测培养基中BNP的含量可用来表征心肌细胞的损伤程度，在共培养48h后，取各组细胞的培养基按BNP ELISA检测试剂盒的操作步骤进行检测，酶标仪于450nm下检测吸收值，用GraphPad Prism 5软件进行数据处理，计算显著性差异(Unpaired t-test)。

如图1所示，模型组的BNP表达水平相较于对照组显著增加，而BOG处理组的BNP表达水平相较于模型组显著降低，且呈现浓度依赖性。BOG(100μg/mL)处理组的BNP降低水平最多，即对细胞的保护作用最显著。误差标识的是平均数标准误差(SEM)，##：显著性性差异相对于对照组，*、**：显著性差异相对于模型组。

1.2.2NO浓度检测

NO是维持心血管系统正常生理功能的关键血液因子。当心肌细胞受到损伤时，NO表达水平升高，导致培养基中NO浓度增加，因此检测培养基中NO的含量可用来表征心肌细胞的损伤程度。在共培养48h后，取各组细胞的培养基按BNP ELISA检测试剂盒的操作步骤进行检测，酶标仪于550nm下检测吸收值，用GraphPad Prism 5软件进行数据处理，计算显著性差异(Unpairedt-test)。

如图2所示，模型组的NO表达水平相较于对照组显著增加，而BOG处理组的NO表达水平相较于模型组显著降低，且呈现浓度依赖性。BOG(100μg/mL)处理组的NO降低水平最多，即对细胞的保护作用最显著。误差标识的是平均数标准误差(SEM)，##:显著性性差异相对于对照组，**：显著性差异相对于模型组。

1.2.3细胞肥大实验

细胞肥大是心衰常见的标志性问题，其可反应心衰发生的程度。以actin-trackergreen染色剂处理细胞，染色结果可表征细胞增大的程度。在造模后按试剂盒操作方法对细胞进行染色，染色完成后在显微镜下观察与拍摄，并用Image J软件对染色部分进行定量，用GraphPad Prism 5软件进行数据处理，计算显著性差异(Unpairedt-test)。

如图3所示，模型组细胞染色面积相较于对照组显著增加，而BOG处理组细胞染色面积相较于模型组减少，且呈现浓度依赖性，BOG(100μg/mL)处理组的面积降低水平最多，即对细胞的保护作用最显著。误差标识的是平均数标准误差(SEM)，##:显著性性差异相对于对照组，**：显著性差异相对于模型组。

1.2.4乳酸浓度检测

乳酸是糖酵的重要代谢产物，其浓度高低可反应心肌细胞的糖酵解水平。当心衰发生时，心肌细胞糖酵解增加，乳酸表达水平升高，导致培养基中乳酸浓度增加，因此检测培养基中乳酸的含量可用来表征心肌细胞中糖酵解异常增加的程度。在共培养48h后，取各组细胞的培养基按乳酸检测试剂盒的操作步骤进行检测，酶标仪于440nm下检测吸收值，用GraphPad Prism 5软件进行数据处理，计算显著性差异(Unpairedt-test)。

如图4所示，模型组的乳酸表达水平相较于对照组显著增加，而BOG处理组的乳酸表达水平相较于模型组显著降低，且呈现浓度依赖性。BOG(100μg/mL)处理组的乳酸降低水平最多，即对细胞的保护作用最显著。误差标识的是平均数标准误差(SEM)，##:显著性性差异相对于对照组，**：显著性差异相对于模型组。

1.2.5丙酮酸浓度检测

丙酮酸是糖酵的重要代谢产物，其浓度高低可反应心肌细胞的糖酵解水平。当心衰发生时，心肌细胞糖酵解增加，丙酮酸表达水平升高，导致培养基中丙酮酸浓度增加，因此检测培养基中丙酮酸的含量可用来表征心肌细胞中糖酵解异常增加的程度。在共培养48h后，取各组细胞的培养基按丙酮酸检测试剂盒的操作步骤进行检测，酶标仪于505nm下检测吸收值，用GraphPad Prism 5软件进行数据处理，计算显著性差异(Unpaired t-test)。

如图5所示，模型组的丙酮酸表达水平相较于对照组显著增加，而BOG处理组的丙酮酸表达水平相较于模型组显著降低，且呈现浓度依赖性。BOG(100μg/mL)处理组的丙酮酸降低水平最多，即对细胞的保护作用最显著。误差标识的是平均数标准误差(SEM)，##:显著性性差异相对于对照组，**：显著性差异相对于模型组。

2.体内实验

2.1模型构建方法

SPF级雄性Wistar大鼠40只(200-250g)，购买自济南明悦实验动物繁育有限公司。适应喂养一周后，随机分成四组，每组十只。空白组以生理盐水灌胃14天，并于第13天和14天腹腔注射生理盐水；模型组以生理盐水灌胃14天，并于第13天和14天腹腔注射ISO的生理盐水溶液(85mg/kg·day)；ME组(60mg/kg·day)和BOG组(75mg/kg·day和150mg/kg·day)连续灌胃14天，并于第13天和14天腹腔注射ISO的生理盐水溶液(85mg/kg·day)。断食12小时后，于第15天眼眶取血，12000g、4℃离心后取上层血清于-80℃保存，用于血液因子的检测。脱颈处死大鼠，解剖除去心脏，置于4℃预冷的PBS溶液中冰上去除心脏中的残血，于心脏中间出横切，靠近心尖部位以4％多聚甲醛溶液固定，用于切片检测。

2.2结果

2.2.1HE染色

图6为心脏切片的HE染色典型性图片，用来评估组织的形态。可以看出模型组心肌细胞明显损伤，并伴有部分阳性细胞浸润，而BOG给药组可减轻心肌细胞损伤的程度，细胞排列规则且致密，对心肌组织起到了保护作用。

2.2.2BNP、NO、乳酸和丙酮酸检测

图7-10为大鼠血清中BNP、NO、乳酸和丙酮酸的检测结果。模型组的血清中表达水平相较于对照组显著增加，而BOG处理组的表达水平相较于模型组显著降低，且呈现浓度依赖性。BOG(150mg/kg·day)处理组的降低水平最多，即对细胞的保护作用最显著。误差标识的是平均数标准误差(SEM)，#:显著性性差异相对于对照组，*，**：显著性差异相对于模型组。

2.2.3免疫组化

图11为大鼠心肌组织中与糖酵解相关蛋白的表达结果。模型组心肌组织中与糖酵解相关蛋白HIF-1ɑ、GLUT1和PFKFB3的表达水平显著升高，而BOG处理组的表达水平相较于模型组显著降低，且呈现浓度依赖性。BOG(150mg/kg·day)处理组的降低水平最多，即对细胞的保护作用最显著。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。