高效表达糖化酶的马克斯克鲁维酵母重组工程菌株及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种高效表达糖化酶的马克斯克鲁维酵母重组工程菌株及其应用。

背景技术

糖化酶(Glucoamylase,EC3.2.1.3)又称为葡萄糖淀粉酶，能够水解淀粉(其他底物如糊精、糖原等)非还原性末端的α-1,4糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解α-1,6葡萄糖苷键转化为葡萄糖，是一类重要的工业酶制剂，广泛应用于食品工业、酿造、医药等领域，有很高的应用价值。工业上发酵生产糖化酶主要采用黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉、土曲霉等天然产酶菌。但现有技术存在产物纯化困难、发酵废菌渣难以处理、底物葡萄糖消耗成本较高等一系列问题，使得利用黑曲霉生产糖化酶的成本高昂。为提升糖化酶天然产生菌的产酶水平，紫外诱变、电子束辐照诱变、N

重组表达技术是另一种糖化酶生产方法。黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中分泌表达的产量28.86IU/mL(刘加爱等，华北农学报，2017,32(6):121-125)，在毕赤酵母中发酵96h表达产量为380.78U/mL(曹慕琛等，安徽农业科学，2011，39：8226-8306)。食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母(Arxula adeninivorans)来源的糖化酶BadGLA是另一种研究较为深入的糖化酶，在A.adeninivorans Ls3中天然表达的胞外酶活为3.81nkat/mL，在酿酒酵母INVSC2中重组表达的胞外酶活为6.2nkat/mL(Bui et al.,Appl Microbiol Biotechnol,1996:44,610–619)。在K.lactis JA6中重组表达的胞外酶活为101nkat/mL(Bui et al.,Appl MicrobiolBiotechnol,1996:45,102–106)。在K.lactis BT16中重组表达的胞外酶活为113±36mU/mL(Morlino et al.,Appl Environ Microbiol.1999；65:4808-13)。在K.lactis MW278-20C中重组表达的胞外酶活为3×10

马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus在重组蛋白表达领域有着广泛应用，在生产食用、饲用和药用蛋白领域具有得天独厚的优势。此外，马克斯克鲁维酵母具有生长速率快，能够在较短时间内达到较高生物量、蛋白量高、生长温度广等特征，更适合工业生产与应用，目前已经成功用于高效表达各类异源蛋白质和有经济价值的产品如菊粉酶、木质纤维素酶类、多聚半乳糖醛酸酶、阿魏酸酯酶、病毒样颗粒以及乙醇等。

蛋白质分泌表达涉及易位、糖基化修饰、折叠、运输和分类等过程。其中，内质网是分泌蛋白进行折叠、修饰和质量控制的主要场所，为了正确折叠以形成天然构象。二硫键的形成对于在分泌蛋白质的折叠中非常重要。在新生的多肽链中，半胱氨酸残基呈硫醇形式，需要氧化成二硫化物再异构化为正确的二硫键模式。对于多个半胱氨酸的蛋白质，不正确的二硫键合模式的数量随着半胱氨酸数量的增加而迅速增加，而正确的二硫化物键合模式数量保持不变。因此，二硫异构酶在蛋白质折叠中起着至关重要的作用，尤其是对于具有多个半胱氨酸残基的蛋白质。在真核生物的内质网中，该过程主要通过二硫键异构酶(Pdi1)和膜相关的氧化还原酶(Ero1和Erv2)组成的途径完成，Pdi1负责催化底物蛋白中的二硫键的形成，而Ero1(/Erv2)则负责为Pdi1提供上游氧化力，这一过程消耗O

糖化酶BadGLA的氨基酸序列中存在两个半胱氨酸，AlphaFold结构预测表明正确折叠的糖化酶BadGLA第19位半胱氨酸和第42位的半胱氨酸之间形成一对二硫键。研究者对SLCTBASE数据库中含有二硫键的215条多肽链的二硫键分布特征进行了统计分析，发现在肽链的前1/4处形成的二硫键数目占二硫键总数的40％，表明二硫键更倾向于在肽链前端形成，说明蛋白质翻译过程中，新生肽链在延伸起始阶段形成正确二硫键，对于后面多肽链的延伸和折叠非常重要(宋江宁等，无锡轻工大学学报，2002，21：464-467)。

发明内容

鉴于糖化酶在酵母中重组表达产量低这一现状，本发明的目的在于提供一种高效表达糖化酶的马克斯克鲁维酵母重组工程菌株及其应用。

本发明提供的高效表达糖化酶马克斯克鲁维酵母重组工程菌株，由如下步骤构建得到：

(1)构建含酵母二硫键异构途径基因的马克斯克鲁维酵母人工染色体；

(2)将含二硫键异构途径基因的酵母人工染色体导入马克斯克鲁维酵母，获得重构二硫键异构途径的马克斯克鲁维酵母；

(3)将糖化酶基因克隆到马克斯克鲁维酵母重组表达载体；

(4)将步骤(3)获得重组表达载体导入步骤(2)得到的重构二硫键异构途径的马克斯克鲁维酵母菌株中，筛选获得高效表达糖化酶的马克斯克鲁维酵母重组工程菌株。

其中：

步骤(1)中，所述酵母二硫键异构途径基因为ERO1、ERV2、PDIA1、PDIA6和RAB1A中一个或多个；其中，二硫键异构基因的来源可以是毕赤酵母或马克斯克鲁维酵母；优选地，为毕赤酵母。

步骤(1)中，所述马克斯克鲁维酵母人工染色体，包含如下基本元件：酵母复制起始序列ARS1，着丝粒CEN，端粒TEL序列，筛选标记基因为组氨酸合成酶基因HIS3、色氨酸合成酶基因TRP1和潮霉素抗性基因HphMX4等。其中，端粒TEL序列可以源自马克斯克鲁维酵母或四膜虫中一种。含四膜虫端粒的酵母人工染色体载体核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，含马克斯克鲁维酵母端粒的酵母人工染色体载体核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

步骤(1)所述构建含酵母二硫键异构途径基因的马克斯克鲁维酵母人工染色体，具体方法如下：首先PCR扩增毕赤酵母(或马克斯克鲁维酵母)二硫键异构途径等相关基因的编码序列(Coding sequence，CDS)，将此CDS序列与马克斯克鲁维酵母来源的天然启动子进行重叠延伸PCR获得基因表达框，并依次克隆到pMD18-T载体上，获得含有多个基因表达框串联的载体。然后通过PCR扩增获得二硫键相关基因的串联表达框，将串联表达框片段与经过酶切的人工染色体载体臂进行体外同源重组连接，连接产物转化马克斯克鲁维酵母，经过鉴定，最后获得二硫键异构途径重构的人工染色体。

步骤(2)中，所述马克斯克鲁维酵母为FIM-1(保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.10621)。为实现本发明的导入重组表达载体技术要求，宿主菌株马克斯克鲁维酵母FIM-1经过常规的分子生物学方法，敲除基因组中一些氨基酸、核苷酸合成代谢途径关键基因，以此作为筛选标记基因。优选地，筛选标记基因为尿嘧啶合成酶基因URA3、组氨酸合成酶基因HIS3、色氨酸合成酶基因TRP1中的一个或多个。

步骤(2)中，所述重构二硫键异构途径的马克斯克鲁维酵母，是将含酵母二硫键异构途径的人工染色体导入到马克斯克鲁维酵母FIM-1构建获得。

步骤(3)中，所述马克斯克鲁维酵母重组表达载体，含酵母自主复制序列、菊粉酶启动子、所述糖化酶基因、菊粉酶终止子和筛选标记基因的元件。优选地，为马克斯克鲁维酵母表达载体pUKDN132(专利申请号201810153537.X)。

步骤(3)中，所述糖化酶基因为食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母糖化酶BadGLA，其核苷酸序列特征如SEQ ID No.3所示，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明中，构建的马克斯克鲁维酵母人工染色体，记为YAC，将马克斯克鲁维酵母来源或毕赤酵母来源的二硫键异构途径基因克隆到人工染色体上，获得“YAC-二硫键异构途径”，含有毕赤酵母来源的二硫键异构途径命名为YAC-二硫键异构P5、YAC-二硫键异构P7；含有马克斯克鲁维酵母来源的二硫键异构途径命名为YAC-二硫键异构K5。

重构二硫键异构途径的马克斯克鲁维酵母菌株，是将人工染色体YAC-二硫键异构P5、YAC-二硫键异构P7和YAC-二硫键异构K5分别导入到马克斯克鲁维酵母FIM-1，获得FIM1/Lin Te_TEL-P5、FIM1/Lin Te_TEL-P7、FIM1/Lin Te_TEL-K5、FIM1/Lin Km_TEL-P5、FIM1/Lin Km_TEL-P7、FIM1/Lin Km_TEL-K5、FIM1/Cir Km_TEL-P5、FIM1/Cir Km_TEL-P7、FIM1/Cir Km_TEL-K5等菌株。

本发明构建的马克斯克鲁维酵母重组工程菌株，可用于高效表达糖化酶，具体步骤为：

1)在不改变氨基酸序列的前提下优化食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母的糖化酶BadGLA基因的密码子；

2)将优化的糖化酶基因序列插入至pUKDN132载体SpeⅠ和NotⅠ位点，获得糖化酶重组表达载体pUKDN132-BadGLA；然后分别转入马克斯克鲁维酵母菌株FIM1/Lin Te_TEL-P5、FIM1/Lin Te_TEL-P7、FIM1/Lin Te_TEL-K5、FIM1/Lin Km_TEL-P5、FIM1/Lin Km_TEL-P7、FIM1/Lin Km_TEL-K5、FIM1/Cir Km_TEL-P5、FIM1/Cir Km_TEL-P7、FIM1/Cir Km_TEL-K5、FIM-1，获得糖化酶表达菌株FIM1/Lin Te_TEL-P5-BadGLA、FIM1/Lin Te_TEL-P7-BadGLA、FIM1/Lin Te_TEL-K5-BadGLA、FIM1/Lin Km_TEL-P5-BadGLA、FIM1/Lin Km_TEL-P7-BadGLA、FIM1/Lin Km_TEL-K5-BadGLA、FIM1/Cir Km_TEL-P5-BadGLA、FIM1/Cir Km_TEL-P7-BadGLA、FIM1/Cir Km_TEL-K5-BadGLA、FIM1/BadGLA；其中，FIM1/Lin Km_TEL-P5-BadGLA简写为FIM1/YAC-P5-BadGLA，FIM1/Lin Km_TEL-P7-BadGLA简写为FIM1/YAC-P7-BadGLA，FIM1/Lin Km_TEL-K5-BadGLA简写为FIM1/YAC-K5-BadGLA；

3)将糖化酶表达菌株接种于50mL YG培养基(2％酵母提取物、4％葡萄糖)中，在30℃、220rpm条件下培养72h；

4)离心收集培养液上清，获得重组表达糖化酶。

可以有效提高马克斯克鲁维酵母重组表达量。

例如，实施例中，糖化酶为B.adeninivorans来源的糖化酶BadGLA、Talaromycesemersonii来源的糖化酶TeGlaA、Neocallimastix patriciarum来源的木聚糖酶耐热突变体β-1,4-内切木聚糖酶Xyn-CDBFV等外源蛋白。摇瓶发酵时，与不含“YAC-二硫键异构途径”的对照菌株相比，YAC-二硫键异构P5、YAC-二硫键异构P7，以及YAC-二硫键异构K5均能提高测试的外源蛋白的表达水平：糖化酶BadGLA的分泌表达量分别提高55％、60％和33％；糖化酶TeGlaA的分泌表达量分别提高87％、65％和123％；木聚糖酶Xyn-CDBFV的分泌表达量分别提高了90％、92％、56％。

本发明在马克斯克鲁维酵母中导入线型、毕赤酵母来源的“YAC-二硫键异构途径”的工程菌株，高密度发酵表达食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母糖化酶的表达水平达到8345.7U/mL，蛋白产量最高达到16.8g/L，是目前最高产量。本发明提供的制备糖化酶技术具有显著的技术进步。

糖化酶是重要工业酶制剂之一，主要应用于淀粉加工、酿造发酵业、纺织品工业、面包工业、医药工业、饲料工业等。由于糖化酶重组表达产量较低水平，难以达到工业生产的需求。本发明所提供的重组表达糖化酶的马克斯克鲁维酵母菌株以及利用该菌株制备糖化酶的方法，在产量上具有显著优势，因此有良好的应用价值。

附图说明

图1马克斯克鲁维酵母人工染色体载体“YAC”示意图。

图2含有二硫键异构途径的酵母人工染色体“YAC-二硫键异构途径”的构建示意图。

图3“YAC-二硫键异构途径”转入马克斯克鲁维酵母的PCR鉴定。(a)为线形的含有四膜虫端粒的二硫键异构途径的酵母人工染色体菌株FIM1/Lin Te_TEL-P5、FIM1/Lin Te_TEL-P7、FIM1/Lin Te_TEL-K5的菌落PCR扩增产物电泳图；(b)为线形的含有马克斯克鲁维酵母端粒的二硫键异构途径的酵母人工染色体菌株FIM1/Lin Km_TEL-P5、FIM1/Lin Km_TEL-P7、FIM1/Lin Km_TEL-K5的菌落PCR产物电泳结果；(c)为环形的含有马克斯克鲁维酵母端粒的二硫键异构途径的酵母人工染色体菌株FIM1/Cir Km_TEL-P5、FIM1/Cir Km_TEL-P7、FIM1/Cir Km_TEL-K5。

图4不同端粒的线形“YAC-二硫键异构途径”对马克斯克鲁维酵母表达糖化酶的影响。将野生型马克斯克鲁维酵母糖化酶表达菌株FIM1/BadGLA的BadGLA蛋白产量定义为1，柱状表示平均值±S.D(n＝3)。Te_TEL表示四膜虫端粒，Km_TEL表示马克斯克鲁维酵母端粒。FIM1/Lin P5-BadGLA、FIM1/Lin P7-BadGLA分别表示含有毕赤酵母来源的线形的YAC-二硫键异构P5、YAC-二硫键异构P7的糖化酶表达菌株，FIM1/Lin K5-BadGLA表示含有马克斯克鲁维酵母来源的线形的YAC-二硫键异构K5的糖化酶表达菌株。

图5线形或环形“YAC-二硫键异构途径”对马克斯克鲁维酵母表达糖化酶的影响。将野生型马克斯克鲁维酵母糖化酶表达菌株FIM1/BadGLA的BadGLA蛋白产量定义为1，柱状表示平均值±S.D(n＝3)。Linear表示线形，Circular表示环形。FIM1/Km_TEL-P5-BadGLA、FIM1/Km_TEL-P7-BadGLA分别表示含马克斯克鲁维酵母端粒的毕赤酵母来源的YAC-二硫键异构P5、YAC-二硫键异构P7的糖化酶表达菌株，FIM1/Km_TEL-K5-BadGLA表示含马克斯克鲁维酵母端粒的马克斯克鲁维酵母来源的YAC-二硫键异构K5的糖化酶表达菌株。

图6含有“YAC-二硫键异构途径”的马克斯克鲁维酵母工程菌株重组表达糖化酶的摇瓶结果。将野生型马克斯克鲁维酵母糖化酶表达菌株FIM1/BadGLA的BadGLA蛋白产量定义为1，柱状表示平均值±S.D(n＝3)。FIM1/YAC-P5-BadGLA、FIM1/YAC-P7-BadGLA表示线形的含马克斯克鲁维酵母端粒的毕赤酵母来源的YAC-二硫键异构P5、YAC-二硫键异构P7的糖化酶表达菌株，FIM1/YAC-K5-BadGLA表示线形的含马克斯克鲁维酵母端粒的马克斯克鲁维酵母来源的YAC-二硫键异构K5的糖化酶表达菌株。

图7含有“YAC-二硫键异构途径”的马克斯克鲁维酵母工程菌株重组表达糖化酶BadGLA的高密度发酵结果。(a)马克斯克鲁维酵母工程菌株高密度发酵72h的糖化酶酶活；(b)马克斯克鲁维酵母工程菌株高密度发酵72h的蛋白产量；(c)马克斯克鲁维酵母工程菌株FIM1/YAC-P7-BadGLA在24、48、60、72h的SDS-PAGE胶图。FIM1/BadGLA表示野生型马克斯克鲁维酵母糖化酶表达菌株，FIM1/YAC-P5-BadGLA、FIM1/YAC-P7-BadGLA表示线形的含马克斯克鲁维酵母端粒的毕赤酵母来源的YAC-二硫键异构P5、YAC-二硫键异构P7的糖化酶表达菌株，FIM1/YAC-K5-BadGLA表示线形的含马克斯克鲁维酵母端粒的马克斯克鲁维酵母来源的YAC-二硫键异构K5的糖化酶表达菌株。

图8含有“YAC-二硫键异构途径”的马克斯克鲁维酵母工程菌株促进外源蛋白的重组表达。将野生型马克斯克鲁维酵母外源蛋白表达菌株FIM1/BadGLA、FIM1/TeGlaA、FIM1/Xyn-CDBFV的BadGLA、TeGlaA、Xyn-CDBFV蛋白产量定义为1，柱状表示平均值±S.D(n＝3)。(a)(b)(c)外源蛋白BadGLA、TeGlaA、Xyn-CDBFV表达菌株发酵72h的胞外酶活；(d)(e)(f)外源蛋白BadGLA、TeGlaA、Xyn-CDBFV表达菌株发酵72h的蛋白表达量。FIM1/YAC-P5-BadGLA、FIM1/YAC-P7-BadGLA、FIM1/YAC-P5-TeGlaA、FIM1/YAC-P7-TeGlaA、FIM1/YAC-P5-Xyn-CDBFV、FIM1/YAC-P7-Xyn-CDBFV表示线形的含马克斯克鲁维酵母端粒的毕赤酵母来源的YAC-二硫键异构P5、YAC-二硫键异构P7的糖化酶BadGLA、TeGlaA、木聚糖酶Xyn-CDBFV表达菌株，FIM1/YAC-K5-BadGLA、FIM1/YAC-K5-TeGlaA、FIM1/YAC-K5-Xyn-CDBFV表示线形的含马克斯克鲁维酵母端粒的马克斯克鲁维酵母来源的YAC-二硫键异构K5的糖化酶BadGLA、TeGlaA、木聚糖酶Xyn-CDBFV表达菌株。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1、马克斯克鲁维酵母人工染色体的构建

马克斯克鲁维酵母人工染色体的设计引入了以下重要元件：复制起始序列ARS1、着丝粒CEN、两个端粒TEL(马克斯克鲁维酵母来源或四膜虫来源)、筛选标记组氨酸合成酶基因HIS3、色氨酸合成酶基因TRP1和潮霉素抗性基因HphMX4。复制起始序列ARS1的功能是维持人工染色体正常起始复制。引入着丝粒CEN目的是使复制的人工染色体在有丝分裂和减数分裂中可均等地分配到子细胞中。为保持人工染色体在马克斯克鲁维酵母中的遗传稳定性，采用了自身的双重营养缺陷互补型筛选标记基因HIS3和TRP1。

为提高马克斯克鲁维酵母人工染色体的复制效率和遗传稳定性，对人工染色体内嵌重要元件的序列进行优化设计。四膜虫端粒序列重复单元为5’-GGGGTT-3’(6bp)，重复次数为44。马克斯克鲁维酵母端粒序列参考基因组的端粒序列重复单元为：

5’-GGTGTACGGATTTGATTAGTTATGT-3’(25bp)，8条染色体端粒重复单元的重复次数均值为25，故对人工染色体两侧的马克斯克鲁维酵母来源的端粒序列重复单元的重复次数设计为25。以此设计了两种马克斯克鲁维酵母人工染色体端粒作为对比。筛选标记基因HIS3和TRP1序列采用马克斯克鲁维酵母自身来源。含有两个四膜虫(Tetrahymena)来源的端粒的酵母人工染色体命名为KM-YAC

实施例2、二硫键异构基因的克隆与重构二硫键异构途径酵母人工染色体的构建

本发明采用的酵母表达宿主菌株来源于马克斯克鲁维酵母菌FIM-1(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10621，保藏单位代码：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年3月13日，分类命名：马克斯克鲁维酵母Kluyveromycesmarxianus)，通过同源重组的方法依次敲除URA3、HIS3、TRP1基因，每次敲除均利用含有5氟乳清酸(1.5g/L)的YPD平板筛选获得尿嘧啶缺陷、组氨酸缺陷和色氨酸缺陷的表达宿主菌，被命名为马克斯克鲁维酵母FIM-1URA3ΔHIS3ΔTRP1Δ。

蛋白质的表达涉及转录、翻译、折叠修饰和运输等过程。分泌蛋白翻译后修饰和折叠是在内质网中进行。许多分泌蛋白需要在分子内或分子间形成二硫键方能正确折叠，该过程主要通过二硫键异构酶Pdi1和内质网氧化还原酶Ero1(Erv2)组成的途径完成，Pdi1蛋白除了具有二硫键异构酶的作用外，还在内质网到高尔基体的运输过程中发挥分子伴侣的作用。

不同物种蛋白的分泌运输能力不同，毕赤酵母作为一类广泛应用的重组蛋白表达系统，已成功用于表达1000多种异源蛋白，其中有70多种异源蛋白已经进行了商业化生产。毕赤酵母高分泌表达能力是其优于其他表达系统如大肠杆菌和酿酒酵母的突出优势之一。然而，关于毕赤酵母二硫键异构途径活性是否与它高分泌表达能力相关并不清楚。本发明通过实现毕赤酵母来源的分泌运输途径(二硫键异构途径)在马克斯克鲁维酵母中进行模块化的重组表达，以提高马克斯克鲁维酵母的分泌运输能力，从而促进异源蛋白如糖化酶的分泌表达。

鉴于马克斯克鲁维酵母自身的同源重组效率低，本发明采用体外同源重组连接的方法，构建含有二硫键异构途径等相关基因重构的人工染色体。构建方法如下：首先PCR扩增毕赤酵母(或马克斯克鲁维酵母)来源的二硫键异构途径等相关基因的CDS序列，将此CDS序列与马克斯克鲁维酵母来源的天然启动子进行重叠延伸PCR获得基因表达框，并依次克隆到pMD18-T载体上，获得含有多个基因表达框串联的出发载体。然后通过PCR扩增获得二硫键相关基因的串联表达框，将串联表达框片段与经过酶切的人工染色体载体臂进行体外同源重组连接，连接产物转化马克斯克鲁维酵母，经过鉴定，最后获得二硫键异构途径重构的人工染色体。

按照酵母基因组DNA提取试剂盒(Solarbio,D1900)说明书的方法，抽提毕赤酵母菌株GS115和马克斯克鲁维酵母菌株FIM-1的基因组。以毕赤酵母GS115的基因组为模板，利用引物扩增二硫键异构途径相关基因：ERO1(Pp_110011,1584bp)、ERV2(Pp_30338,618bp)、PDIA1(Pp_40844,1416bp)和PDIA6(Pp_130125,897bp；Pp_110160,1110bp；Pp_40991,876bp)，以及Rab蛋白基因RAB1A(Pp_31167,612bp)，引物分别为Pp-F1/Pp-R1、Pp-F2/Pp-R2、Pp-F3/Pp-R3、Pp-F4/Pp-R4、Pp-F5/Pp-R5、Pp-F6/Pp-R6、Pp-F7/Pp-R7。同样以FIM-1的基因组为模板，利用引物扩增同源的二硫键异构途径基因：ERO1(Km_1526,1656bp)、ERV2(Km_4421,603bp)、PDI1(Km_809,1563bp)、MPD1(Km_225,1113bp)，以及Rab蛋白基因YPT1(Km_4358,615bp)，引物分别为Km-F1/Km-R1、Km-F2/Km-R2、Km-F3/Km-R3、Km-F4/Km-R4、Km-F5/Km-R5。PCR的过程参照Phanta Super Fidelity DNA Polymerase的产品说明进行(Vazyme，货号P505-d1/d2/d3)。PCR完成后，通过1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物，获得目的片段。按照SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(生工，货号B518131-0050)的说明书操作，对PCR扩增产物进行回收，即得毕赤酵母和马克斯克鲁维酵母来源的二硫键异构途径基因。同样以FIM-1的基因组为模板，利用引物ENO2-F/ENO2-R、PDC1-F/PDC1-R、INU1-F/INU-R、HXT4-F/HXT4-R、OM45-F/OM45-R分别扩增ENO2(1000bp)、PDC1(1000bp)、INU1(1136bp)、HXT4(1000bp)和OM45(1000bp)启动子，并分别以质粒LHZ676和LHZ679(BiotechnologyJournal 17(4):e2100382,2022)为模板，利用引物TEF-F/TEF-R、ADH1-F/ADH1-R分别扩增TEF(379bp)、ADH1(1447bp)启动子。PCR反应采用Phanta Super Fidelity DNAPolymerase。PCR完成后经过1％琼脂糖凝胶电泳分析，并利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对产物进行回收，获得系列启动子片段。

以ENO2启动子和PpERO1或KmERO1为模板，利用引物ENO2-F/Pp-R1、ENO2-F/Km-R1分别扩增PENO2-PpERO1-T27(2650bp)、PENO2-KmERO1-T27(2722bp)；以PDC1启动子和PpERV2或KmERV2为模板，利用引物PDC1-F/Pp-R2、PDC1-F/Km-R2分别扩增PPDC1-PpERV2-T19(1665bp)、PPDC1-KmERV2-T19(1650bp)；以INU1启动子和PpPDIA1或KmPDI1为模板，利用引物INU1-F/Pp-R3、INU1-F/Km-R3分别扩增PINU1-PpPDIA1-T28(2618bp)、PINU1-KmPDI1-T28(2765bp)；以HXT4启动子和Pp_130125或KmMPD1为模板，利用引物HXT4-F/Pp-R4、INU1-F/Km-R4分别扩增PHXT4-Pp130125-T19(1944bp)、PHXT4-KmMPD1-T19(2183bp)；以TEF启动子和Pp_110160为模板，利用引物TEF-F/Pp-R5扩增PTEF-Pp110160-T30(1557bp)；以ADH1启动子和Pp_40991为模板，利用引物ADH1-F/Pp-R6扩增PADH1-Pp40991-T3(2392bp)；以OM45启动子和PpRAB1A或KmYPT1为模板，利用引物OM45-F/Pp-R7、OM45-F/Km-R5分别扩增POM45-PpRAB1A-T8(1661bp)、POM45-KmYPT1-T8(1664bp)。PCR反应采用Phanta Super FidelityDNA Polymerase。PCR完成后将扩增产物经过1％琼脂糖凝胶电泳分析，并利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收，获得毕赤酵母以及马克斯克鲁维酵母来源的二硫键异构途径基因表达框。采用Gibson Assembly无痕连接系统(NEB公司，货号E2611S/L)，将这些基因表达框与pMD18-T载体(Takara,D1010A)进行连接，获得含有多个二硫键异构基因表达框的出发载体pMD18-T-Pp40844-Pp110160-Pp31167-Pp30338、pMD18-T-Pp130125-Pp40991-Pp110011、pMD18-T-Km809-Km225-Km4358、pMD18-T-Km4421-Km1526。

以pMD18-T-Pp40844-Pp110160-Pp31167-Pp30338质粒为模板，利用引物Pp-F8/Pp-R8扩增Pp40844-Pp110160-Pp31167片段，利用引物Pp-F8/Pp-R9扩增

Pp40844-Pp110160-Pp31167-Pp30338片段；以pMD18-T-Pp130125-Pp40991-Pp110011质粒为模板，利用引物Pp-F9/Pp-R10扩增Pp130125-Pp40991片段，利用引物Pp-F10/Pp-R11扩增Pp130125-Pp40991-Pp110011片段；以pM18-T-Km809-Km225-Km4358质粒为模板，利用引物Km-F6/Km-R6扩增Km809-Km225-Km4358片段；以pMD18-T-Km4421-Km1526质粒为模板，利用引物Km-F7/Km-R7扩增Km4421-Km1526片段。PCR反应采用Phanta SuperFidelity DNA Polymerase。PCR完成后通过1％琼脂糖凝胶电泳分析产物，并利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对扩增产物进行回收，获得二硫键异构途径的多基因串联表达框片段。

用限制性内切酶NotⅠ和BamHⅠ对马克斯克鲁维酵母人工染色体载体KM-YAC

P5(Pp40844-Pp110160-Pp31167-Pp130125-Pp40991)；

P7(Pp40844-Pp110160-Pp31167-Pp30338-Pp130125-Pp40991-Pp110011)；

K5(Km809-Km225-Km4358-Km4421-Km1526)。

实施例3、含重构二硫键异构途径和糖化酶表达载体的马克斯克鲁维酵母菌株的构建

为构建含多基因的毕赤酵母来源的“YAC-二硫键异构途径”YAC-二硫键异构P5、YAC-二硫键异构图P7和马克斯克鲁维酵母来源的“YAC-二硫键异构途径”YAC-二硫键异构K5(表1)，本发明采用体内外重组连接策略，分步式构建表达框，具体流程如图3所示。构建流程包括对酵母人工染色体KM-YAC

表1为本发明构建人工染色体所含酵母二硫键异构途径基因

从SD平板挑取单克隆转接到新的SD平板上活化后进行菌落PCR鉴定。用牙签挑取菌体重悬于30μL 0.2％ SDS中，沸水浴5min。冷却后离心取上清作为模板，对重组酵母人工染色体Te_TEL-P5或Km_TEL-P5进行PCR反应的引物为1F/1R、2F/2R、3F/3R、4F/4R、LAF/P44R、407F/407R、075F/075R、751F/751R、91F/RAR、5F/5R、6F/6R，对Te_TEL-P7或Km_TEL-P7进行PCR反应的引物为1F/1R、2F/2R、3F/3R、4F/4R、LAF/P44R、407F/407R、78F/78R、85F/85R、51F/51R、11F/11R、1YF/RAR、5F/5R、6F/6R，对Te_TEL-K5或Km_TEL-K5进行PCR反应的引物为1F/1R、2F/2R、3F/3R、4F/4R、LAF/95R、58F/58R、81F/816R、6RF/RAR、5F/5R、6F/6R。PCR过程参照Phanta Super Fidelity DNA Polymerase的产品说明进行。对PCR扩增产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，获得2kb左右(大部分PCR产物)条带的阳性克隆，即为含有二硫键异构途径基因的重组酵母人工染色体的底盘菌株(图3)。含有线形的“YAC-二硫键异构途径”的菌株分别命名为FIM1/Lin Te_TEL-P5、FIM1/Lin Te_TEL-P7、FIM1/Lin Te_TEL-K5、FIM1/Lin Km_TEL-P5、FIM1/Lin Km_TEL-P7、FIM1/Lin Km_TEL-K5；含有环形的“YAC-二硫键异构途径”的菌株命名为FIM1/Cir Km_TEL-P5、FIM1/Cir Km_TEL-P7、FIM1/Cir Km_TEL-K5。

实施例4、糖化酶在重构二硫键异构途径的马克斯克鲁维酵母菌株中重组表达

参照马克斯克鲁维酵母的密码子偏好性，在不改变氨基酸序列的前提下将来源于食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母(Blastobotrys adeninivorans)的糖化酶BadGLA基因核苷酸序列进行密码子优化，其核苷酸和氨基酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。在本实施例中，基因序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成得到，并通过公司将糖化酶基因序列插入至pUKDN132载体(专利申请号201810153537.X)的SpeⅠ和NotⅠ之间，获得糖化酶重组表达载体pUKDN132-BadGLA。该重组表达载体包括酵母自主复制序列、菊粉酶启动子、食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母来源的糖化酶BadGLA基因、菊粉酶终止子、筛选标记基因URA3序列。

采用醋酸锂转化法将糖化酶重组表达载体pUKDN132-BadGLA分别转入含有“YAC-二硫键异构途径”的马克斯克鲁维酵母工程菌株FIM1/Lin Te_TEL-P5、FIM1/Lin Te_TEL-P7、FIM1/Lin Te_TEL-K5、FIM1/Lin Km_TEL-P5、FIM1/Lin Km_TEL-P7、FIM1/Lin Km_TEL-K5；含有环形重组酵母人工染色体的菌株命名为FIM1/Cir Km_TEL-P5、FIM1/Cir Km_TEL-P7、FIM1/Cir Km_TEL-K5和不含“YAC-二硫键异构途径”的马克斯克鲁维酵母菌株FIM-1URA3ΔHIS3ΔTRP1Δ，转化后的产物涂布于SD平板(0.67％无氨基酸氮源、2％葡萄糖、2％琼脂)，平板置于30℃培养，转化子筛选鉴定后分别命名为：

FIM1/Lin Te_TEL-P5-BadGLA、FIM1/Lin Te_TEL-P7-BadGLA、FIM1/Lin Te_TEL-K5-BadGLA、FIM1/Lin Km_TEL-P5-BadGLA、FIM1/Lin Km_TEL-P7-BadGLA、FIM1/Lin Km_TEL-K5-BadGLA、FIM1/Cir Km_TEL-P5-BadGLA、FIM1/Cir Km_TEL-P7-BadGLA、FIM1/CirKm_TEL-K5-BadGLA、FIM1/BadGLA，其中，FIM1/Lin Km_TEL-P5-BadGLA简写为FIM1/YAC-P5-BadGLA、FIM1/Lin Km_TEL-P7-BadGLA简写为FIM1/YAC-P7-BadGLA、FIM1/Lin Km_TEL-K5-BadGLA简写为FIM1/YAC-K5-BadGLA。

从每组转化中分别挑取3个克隆接种于50mL YG培养基(2％酵母提取物、4％葡萄糖)中，在30℃、220rpm条件下培养72h，取发酵液上清通过DNS法测定糖化酶酶活。用20mMNaAc(pH 5.5)缓冲液稀释15倍，取5μL稀释后的酶液与45μL NaAc缓冲液和50μL 1％可溶性淀粉(20mM NaAc配制)，于60℃反应5min，结束后，立即加入100μL DNS溶液(1％3,5-二硝基水杨酸，1％ NaOH，20％酒石酸钠，0.2％苯酚，0.5％无水硫酸钠)，于沸水中反应5min，结束后冰上冷却，取100μL反应液于96孔平底板中，酶标仪测定OD

实施例5、马克斯克鲁维酵母中二硫键异构途径的重构对糖化酶表达水平的提升效果

以野生型的马克斯克鲁维酵母作对照，对比分析了在马克斯克鲁维酵母中导入毕赤酵母来源的二硫键异构途径YAC-二硫键异构P5、YAC-二硫键异构P7，以及马克斯克鲁维酵母来源的二硫键异构途径YAC-二硫键异构K5后，食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母的糖化酶BadGLA的表达水平。不同马克斯克鲁维酵母重组菌株的糖化酶BadGLA表达水平检测结果如图4和图5所示。图4为含有不同端粒包括四膜虫端粒和马克斯克鲁维酵母端粒的“YAC-二硫键异构途径”对糖化酶表达影响水平的比较，图5为不同构型包括线形和环形的“YAC-二硫键异构途径”对糖化酶表达影响水平的比较。比对结果表明，不同“YAC-二硫键异构途径”导入到马克斯克鲁维酵母中可促进糖化酶的分泌表达，其中以线形的含有马克斯克鲁维酵母端粒的YAC-二硫键异构P5对糖化酶的促进作用最显著，分泌表达水平比对照菌株提升了130％。此外，不同来源的染色体端粒对糖化酶表达的影响与基因组成有关，含有毕赤酵母来源的YAC-二硫键异构P5的菌株FIM1/Lin P5-BadGLA和含有马克斯克鲁维酵母来源的YAC-二硫键异构K5的菌株FIM1/Lin K5-BadGLA表达糖化酶时，马克斯克鲁维酵母端粒对糖化酶BadGLA的表达水平的促进作用优于四膜虫端粒。

人工染色体的结构(线或环形)会影响它的稳定性以及嵌入基因的转录翻译，从而产生不同的生物学功能。为此，本发明对比分析了线形或环形马克斯克鲁维酵母人工染色体对糖化酶表达效果的影响。发现不同构型的“YAC-二硫键异构途径”都促进了BadGLA在马克斯克鲁维酵母中的分泌表达。整体来看，线形和环形“YAC-二硫键异构途径”对糖化酶表达的影响同样与嵌入的二硫键异构途径基因构成有关，FIM1/Km_TEL-P5-BadGLA中毕赤酵母来源的线形YAC-二硫键异构P5和FIM1/Km_TEL-K5-BadGLA菌株中马克斯克鲁维酵母来源的线形YAC-二硫键异构K5组成的线形“YAC-二硫键异构途径”比环形“YAC-二硫键异构途径”更能促进BadGLA的分泌表达。具体为，毕赤酵母来源的YAC-二硫键异构P5对糖化酶的分泌表达的促进作用最强，糖化酶表达水平比对照菌株提升了130％以上。证实本发明采用二硫键异构途径整体植入马克斯克鲁维酵母可以有效促进糖化酶分泌表达水平。

进一步地，为比较本发明提供的技术与现有技术的实施效果，本发明定量检测了在含有二硫键异构途径重构的马克斯克鲁维酵母菌株FIM1/YAC-P5-BadGLA、FIM1/YAC-P7-BadGLA、FIM1/YAC-K5-BadGLA在摇瓶发酵时糖化酶的表达水平。结果如图6所示，线形的含有马克斯克鲁维酵母端粒的毕赤酵母来源的YAC-二硫键异构P5、YAC-二硫键异构P7，以及马克斯克鲁维酵母来源的YAC-二硫键异构K5都促进了糖化酶的分泌表达，分泌表达量分别提高55％、60％和33％，其中，毕赤酵母来源的人工染色体YAC-二硫键异构P5和YAC-二硫键异构P7对糖化酶的促进作用最为显著，最高是对照的1.6倍，72h发酵液上清酶活分别达到209.3U/mL，216.5U/mL。

实施例6、含有“YAC-二硫键异构途径”的马克斯克鲁维酵母表达糖化酶的高密度发酵

将三种含有毕赤酵母来源或马克斯克鲁维酵母来源的“YAC-二硫键异构途径”的糖化酶BadGLA表达菌株FIM1/YAC-P5-BadGLA、FIM1/YAC-P7-BadGLA、FIM1/YAC-K5-BadGLA以及不含“YAC-二硫键异构途径”的野生型表达菌株FIM1/BadGLA进行5L发酵罐的高密度发酵，并对糖化酶产量进行定量分析。在5L自动发酵罐中对糖化酶BadGLA表达菌株进行了连续补料发酵培养，发酵参数设置为30℃、pH＝5.5，定期取样检测糖化酶表达情况。

取72h发酵液上清测定糖化酶酶活，并对24、48、60、72h的蛋白表达量进行SDS-PAGE分析。结果如图7所示，72h时，糖化酶表达菌株FIM1/YAC-P5-BadGLA、FIM1/YAC-P7-BadGLA、FIM1/YAC-K5-BadGLA的胞外酶活分别达到7414.6U/mL、8345.7U/mL、5973.2U/mL，相比于出发菌株，酶活分别提高116.5％、143.7％、74.5％。根据糖化酶BadGLA的比活498.02U/mg可得，含有毕赤酵母来源或马克斯克鲁维酵母来源的“YAC-二硫键异构途径”的糖化酶BadGLA表达菌株FIM1/YAC-P5-BadGLA、FIM1/YAC-P7-BadGLA、FIM1/YAC-K5-BadGLA表达糖化酶BadGLA的产量分别为14.9g/L、16.8g/L、12g/L，这是迄今为止已有报道的最高产量。

实施例7、“YAC-二硫键异构途径”促进了外源蛋白在马克斯克鲁维酵母中的重组表达水平

在含有“YAC-二硫键异构途径”的马克斯克鲁维酵母工程菌株中分别表达不同的外源蛋白，包括食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母来源的糖化酶BadGLA，Talaromyces emersonii来源的糖化酶TeGlaA，Neocallimastix patriciarum来源的木聚糖酶Xyn-CDBFV；马克斯克鲁维酵母工程菌株中含有的“YAC-二硫键异构途径”有三种：YAC-二硫键异构P5，YAC-二硫键异构P7，YAC-二硫键异构K5。将9株工程菌株FIM1/YAC-P5-BadGLA、FIM1/YAC-P7-BadGLA、FIM1/YAC-K5-BadGLA、FIM1/YAC-P5-TeGlaA、FIM1/YAC-P7-TeGlaA、FIM1/YAC-K5-TeGlaA、FIM1/YAC-P5-Xyn-CDBFV、FIM1/YAC-P7-Xyn-CDBFV、FIM1/YAC-K5-Xyn-CDBFV分别发酵，分别在30℃、220rpm条件下培养72h，取发酵液上清通过DNS法测定糖化酶酶活。

结果如图8所示，与不含“YAC-二硫键异构途径”的对照相比，毕赤酵母来源的YAC-二硫键异构P5、YAC-二硫键异构P7和马克斯克鲁维酵母来源的YAC-二硫键异构K5均能提高测试的外源蛋白的表达水平：糖化酶BadGLA的分泌表达量分别提高55％、60％和33％；糖化酶TeGlaA的分泌表达量分别提高87％、65％和123％；木聚糖酶Xyn-CDBFV的分泌表达量分别提高了90％、92％、56％。由此说明，线形的含有马克斯克鲁维酵母端粒的毕赤酵母来源和马克斯克鲁维酵母来源的“YAC-二硫键异构途径”都能提高异源蛋白的重组表达水平，并且具有普适性。