细胞外囊泡与α,β-不饱和羰基化合物的生物偶联方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种细胞外囊泡与α,β-不饱和羰基化合物的生物偶联方法。

背景技术

细胞外囊泡(Extracellular Vesicle,EVs)是一类具备磷脂双分子层膜结构及其包裹的多肽、脂质以及核酸等多种生物分子的来源于细胞的生物纳米囊泡。细胞分泌、产生细胞外囊泡并释放至胞外后，一般通过膜融合的形式将细胞外囊泡所携带的生物大分子递送至受体细胞。因此，细胞外囊泡是细胞间物质交换及信息传递的重要载体。除天然的分子传输属性外，细胞外囊泡自身还具备一定的纳米属性(直径在30～1500nm范围、比表面积大等)以及良好的生物相容性，是药物递送领域中一类新型的内源性药物载体。大量研究表明，细胞外囊泡可用于装载并递送多柔比星、姜黄素等小分子化学药物，体现出显著的抗肿瘤和抗炎活性。

近年来，含笑内酯、小白菊内酯、土木香内酯等倍半萜内酯类天然产物被发现具有抗肿瘤、抗炎、抗菌等多种作用。然而倍半萜内酯类天然产物大多水溶性较差，导致生物利用度较低，严重限制了其药效的发挥。目前多采用转化为前药的方法，改善其水溶性。由于桉叶烷型倍半萜基本骨架中均具备α,β-不饱和羰基结构，因此多将二甲胺在α,β-不饱和键上进行Michael加成，进一步转化为可溶性盐前药。如含笑内酯(Micheliolide,MCL)通过Michael加成转化为二甲氨基含笑内酯(Dimethylaminomicheliolide,DMAMCL)富马酸盐，改善了水溶性及稳定性。

然而仅通过转化为水溶性前药，仍难以有效提高其生物利用度。因此，亟需一种新的药物递送系统能够有效增强以含笑内酯为代表的倍半萜内酯类天然产物的生物利用度，进而提升其药效。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种细胞外囊泡与α,β-不饱和羰基化合物的生物偶联方法。

本发明采用的技术方案是：细胞外囊泡与α,β-不饱和羰基化合物的生物偶联方法，碱催化条件下，使得细胞外囊泡外表面的伯胺与α,β-不饱和羰基化合物发生Michael加成反应，获得由碳氮键连接的细胞外囊泡和α,β-不饱和羰基化合物偶联物。

优选地，碱催化条件中催化剂为强碱弱酸盐、季铵碱或叔胺。

优选地，强碱弱酸盐为碳酸钾或碳酸钠，季铵碱为氢氧化四甲铵，叔胺为三甲胺或三乙胺。

优选地，α,β-不饱和羰基化合物和碱催化剂的摩尔比为1:1-4。

优选地，将细胞外囊泡与α,β-不饱和羰基化合物混合孵育，孵育条件为以超纯水、生理盐水或PBS缓冲液为溶剂，25-37℃反应1-4h。

优选地，孵育后通过离心柱层析纯化，柱层析条件为CORE400填料，pH 7.4的PBS缓冲液作流动相，20-25℃，1000-2000g离心2-5min。

优选地，细胞外囊泡为来源于奶源、血液、尿液或干细胞的细胞外囊泡。

细胞外囊泡与α,β-不饱和羰基化合物的生物偶联方法制备得到的α,β-不饱和羰基化合物和细胞外囊泡的偶联物。

α,β-不饱和羰基化合物和细胞外囊泡的偶联物在药物制备及示踪研究中的应用。

优选地，α,β-不饱和羰基化合物为倍半萜内酯。

优选地，倍半萜内酯为含笑内酯、小白菊内酯、土木香内酯。

本发明具有的优点和积极效果是：对于含有α,β-不饱和羰基结构特征的化合物(荧光示踪剂或药用天然产物)，提供一种基于Michael加成反应的生物偶联方法，通过碱催化，一步法将α,β-不饱和羰基化合物直接与细胞外囊泡偶联，形成细胞外囊泡-α,β-不饱和羰基化合物偶联物；

采用细胞外囊泡携带具有示踪作用或药用的含有α,β-不饱和羰基结构特征的化合物，细胞外囊泡上包括多个伯胺，能够连接多个化合物分子，装载量较大，能够实现高效装载；

偶联过程在不影响细胞外囊泡的形态学、膜结构及生物学功能的条件下完成，有助于对细胞外囊泡的示踪及载药研究，并保证装载含有α,β-不饱和羰基结构特征的化合物的细胞外囊泡有效的载药作用。

附图说明

图1为细胞外囊泡与式2化合物经Michael加成反应直接共价偶联形成细胞外囊泡-α,β-不饱和羰基化合物偶联物的制备路线图；

图2为细胞外囊泡与式2化合物共价偶联得到的偶联物结构图；

图3为细胞外囊泡的荧光标记率及粒径分布，其中图3A为实施例2的荧光标记率，图3B为对比例1的荧光标记率，图3C为实施例2的粒径分布，图3D为纯细胞外囊泡的粒径分布；

图4为实施例3、对比例2与对比例3中偶联药物的定性及定量分析，其中图4A为偶联药物定性分析(HPLC图谱)，其中MCL-STD表示含笑内酯标准品，EV-MCL表示实施例3中获得的细胞外囊泡-含笑内酯偶联药物，EVs表示对比例2中获得的细胞外囊泡，MCL residue表示对比例3中的残留含笑内酯，图4B为偶联药物定量分析(载药率与包封率)；

图5为细胞外囊泡的透射电镜图片(形态学)，其中图5A为实施例2的透射电镜图片，图5B为实施例3的透射电镜图片，图5C为纯细胞外囊泡的透射电镜图片；

图6为纯细胞外囊泡、实施例2和实施例3获得的细胞外囊泡标志蛋白CD9、CD81与TSG101的Western blot鉴定结果，其中EVs表示纯细胞外囊泡，ABF-EVs表示实施例2获得的细胞外囊泡，MCL-EVs表示实施例3获得的细胞外囊泡；

图7为细胞外囊泡的纯度分析，其中图7A为实施例2获得的细胞外囊泡纯度分析，图7B为实施例3获得的细胞外囊泡纯度分析，图7C为纯细胞外囊泡纯度分析；

图8为细胞外囊泡被U251细胞摄取的效果，其中图8A为纯细胞外囊泡的FSC-SSC散点图，图8B为纯细胞外囊泡的流式直方图，图8C为实施例2获得的荧光标记的细胞外囊泡的FSC-SSC散点图，图8D为实施例2获得的荧光标记的细胞外囊泡的流式直方图；其中EVs表示纯细胞外囊泡，ABF-EVs表示实施例2获得的荧光标记的细胞外囊泡；

图9为细胞外囊泡在U251细胞内成像效果，其中图9A为实施例2获得的荧光标记的细胞外囊泡在U251细胞内成像图片，图9B为对比例1获得的荧光标记的细胞外囊泡在U251细胞内成像图片；

图10为25℃下细胞外囊泡-含笑内酯偶联药物与含笑内酯的溶解性曲线，MCL表示含笑内酯，EV-MCL表示实施例3中获得的细胞外囊泡-含笑内酯偶联药物；

图11为不同浓度的细胞外囊泡-含笑内酯偶联药物与含笑内酯对U118MG细胞生长抑制的量效关系曲线，MCL表示含笑内酯，EV-MCL表示实施例3中获得的细胞外囊泡-含笑内酯偶联药物；

图12为不同浓度的细胞外囊泡-含笑内酯偶联药物与含笑内酯对U251细胞生长抑制的量效关系曲线，MCL表示含笑内酯，EV-MCL表示实施例3中获得的细胞外囊泡-含笑内酯偶联药物。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例做出说明。

本发明公开一种细胞外囊泡与α,β-不饱和羰基化合物的生物偶联方法，在碱催化条件下，使得细胞外囊泡外表面的伯胺与α,β-不饱和羰基化合物发生Michael加成反应，获得由碳氮键连接的细胞外囊泡和α,β-不饱和羰基化合物偶联物。α,β-不饱和羰基化合物可以为荧光示踪剂或药用天然产物，通过这样的方法，能够将荧光示踪剂或药用天然产物直接共价结合到细胞外囊泡上。

具体的，将α,β-不饱和羰基化合物与细胞外囊泡在碱性环境(pH 8.0-9.0)中混合孵育，在碱催化条件下细胞外囊泡表面的伯胺在α,β-不饱和键上进行Michael加成，获得细胞外囊泡-α,β-不饱和羰基化合物偶联物。本发明某些实施例中，可使用末端具有α,β-不饱和羰基结构的荧光示踪剂与细胞外囊泡偶联，实现对细胞外囊泡的直接荧光标记，在细胞内取得了良好的细胞外囊泡示踪效果。在本发明某些实施例中，使用具有α,β-不饱和羰基结构的含笑内酯天然产物与细胞外囊泡偶联，经一步法形成细胞外囊泡-倍半萜内酯偶联药物，改善了倍半萜内酯的水溶性及抗肿瘤活性；倍半萜内酯为可为含笑内酯、小白菊内酯、土木香内酯。

使用的碱催化剂为强碱弱酸盐、季铵碱或叔胺，强碱弱酸盐为碳酸钾(K

以式2为例，细胞外囊泡经一步法与式2化合物直接生物偶联，如图1所示，将式2化合物和细胞外囊泡混合孵育，孵育条件为以超纯水、生理盐水或PBS缓冲液为溶剂，在碱催化条件下25-37℃反应1-4h，细胞外囊泡表面的伯胺在式2化合物的α,β-不饱和键中取代基较少的碳原子上发生Michael加成，形成的碳氮键将细胞外囊泡与式2化合物直接共价偶联。其中，式2化合物和细胞外囊泡可以以任意比例混合，均能够实现两者间的生物偶联，基于偶联效果和成本控制，可按照一定混合比例将二者进行混合，以200μg蛋白质/150μL PBS的细胞外囊泡为基准，式2化合物用量为10-200nmol，优选为150nmol；三乙胺用量为10-800nmol，优选为225nmol。

获得的偶联有式2化合物的细胞外囊泡，结构如图2所示。反应过程中，温度优选为25℃，溶剂优选为PBS缓冲液，反应时长优选为2h。制备得到细胞外囊泡-α,β-不饱和羰基化合物偶联物后通过离心柱层析法进行纯化，柱层析条件为采用CORE400填料，PBS缓冲液(pH7.4)作流动相；离心条件为20-25℃，1000-2000g离心2-5min；离心温度优选为25℃，离心速度优选为1000g，离心时长优选为2min。

含笑内酯(式1化合物)与细胞外囊泡的偶联也可参考前述式2化合物的偶联方式。本发明基于碱催化条件下伯胺或仲胺在α,β-不饱和羰基化合物的α,β-不饱和键上的Michael加成反应的高灵敏性、高产率且副反应较少等优势，选择适当的碱(三乙胺或K

本发明中细胞外囊泡为来源于奶源、血液、尿液或干细胞的细胞外囊泡，其中干细胞包括脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞中的一种或多种。与其他来源的细胞外囊泡相比，牛奶来源的细胞外囊泡制备简单，成本低廉，产量较大且纯度较高，适合用于细胞外囊泡的研究。此外，实验说明，牛奶来源的细胞外囊泡的荧光标记效果以及与含笑内酯的偶联效率最佳。

下面实施例以牛奶来源的细胞外囊泡为例，结合附图对本发明方案做出进一步说明。其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。实施例中细胞培养基、FBS、双抗及胰酶等试剂均购于Gibco公司，培养板、爬片等细胞培养耗材均购于Corning公司。本发明的实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实施例中的定量实验结果，均为自设置的三次平行重复实验结果所取的平均值。实施例中细胞培养基、FBS、双抗及胰酶等试剂均购于Gibco公司，培养板、爬片等细胞培养耗材均购于Corning公司。

实施例1：牛奶外泌体的获取

通过将新鲜牛奶依次通过酸沉(pH 4.0)、超速离心及柱层析等工艺分离纯化得到牛奶来源的细胞外囊泡(EVs)，通过纳米流式检测技术表征牛奶细胞外囊泡的粒径分布、透射电镜观察细胞外囊泡的形态学、Western blot检测细胞外囊泡的表面标志物蛋白和超高液相-分子排阻色谱法检测细胞外囊泡的纯度，其结果将分别如图3D、图5C、图6和图7C所示。

实施例2：细胞外囊泡与末端具有α,β-不饱和羰基的荧光示踪剂的生物偶联

按照图1制备流程，将150μL实施例1制备得到的牛奶来源的细胞外囊泡(含200μg蛋白质)与末端具有α,β-不饱和羰基的荧光示踪剂，细胞外囊泡的终浓度为1000μg/mL蛋白质，末端具有α,β-不饱和羰基的荧光示踪剂式2化合物(5.0μL,150nmol)混合，加入三乙胺(45.0μL,225nmol)，在25℃下反应2h。

将上述孵育混合液转移至经PBS缓冲液润洗2次后的装填有CORE400填料的重力离心管中，并将重力离心管置于15mL离心管中，25℃下以1000g速度离心2min后，分离除去反应体系中游离的式2化合物及三乙胺，收集样品，获得纯化后的偶联有式2化合物荧光示踪剂的牛奶来源的细胞外囊泡。

实施例3：细胞外囊泡与含笑内酯的生物偶联

将150μL实施例1制备得到的牛奶来源的细胞外囊泡(含200μg蛋白质)与含笑内酯(MCL)，即式1化合物(5.0μL,150nmol)混合，细胞外囊泡的终浓度为1000μg/mL蛋白质，加入K

将上述孵育混合液转移至经PBS缓冲液润洗2次后的装填有CORE400填料的重力离心管中，并将重力离心管置于15mL离心管中，25℃下以1000g速度离心2min后，分离除去反应体系中游离的含笑内酯(MCL)及K

对比例1：

将150μL实施例1制备得到的牛奶来源的细胞外囊泡(含200μg蛋白质)与末端无α,β-不饱和羰基的荧光示踪剂(5.0μL,150nmol)混合，加入三乙胺(45.0μL,225nmol)，在25℃下反应2h。采用的末端无α,β-不饱和羰基的荧光示踪剂结构如式3所示；

荧光示踪剂与细胞外囊泡通过非共价结合方式连接，能够在疏水作用力下插入到外膜疏水区域，实现对细胞外囊泡的荧光标记。

将上述孵育混合液转移至经PBS缓冲液润洗2次后的装填有CORE400填料的重力离心管中，并将重力离心管置于15mL离心管中，25℃下以1000g速度离心2min后，分离除去反应体系中游离的式3化合物及三乙胺，收集样品，获得式3化合物荧光示踪的细胞外囊泡。

对比例2：

只包括细胞外囊泡不包括含笑内脂的对比例。向150μL实施例1制备得到的牛奶来源的细胞外囊泡(含200μg蛋白质)中加入50μL的超纯水，在25℃下孵育3h。

将上述孵育混合液转移至经PBS缓冲液润洗2次后的装填有CORE400填料的重力离心管中，并将重力离心管置于15mL离心管中，25℃下以1000g速度离心2min后，收集样品，获得的产物为未偶联含笑内酯的牛奶来源的细胞外囊泡。

对比例3：

不包括细胞外囊泡只包括含笑内脂的对比例。将含笑内酯(MCL)，即式1化合物(5.0μL,150nmol)溶于150μL的PBS缓冲液，加入K

将上述对比例的混合液转移至经PBS缓冲液润洗2次后的装填有CORE400填料的重力离心管中，并将重力离心管置于15mL离心管中，25℃下以1000g速度离心2min后，收集流穿液，获得的产物为可能含有未被除尽的含笑内酯溶液。

实施例4：应用纳米流式检测技术表征细胞外囊泡的荧光标记率及粒径分布

将实施例2与对比例1中获得的荧光标记的细胞外囊泡用PBS分别稀释1000倍，选择250±5nm的单分散纳米荧光硅球用于纳米流式检测仪的光学校准和计数标准，选择一组粒径分别为68±2nm，91±3nm，113±3nm及155±3nm的纳米硅球用于纳米流式检测仪的粒径标准，通过纳米流式检测技术(Nano flow cytometry,NanoFCM)分别检测实施例2与对比例1中至少5000个细胞外囊泡的荧光标记率。

检测条件：488nm的激光器，检测通道分别为散射通道和FITC荧光通道，衰减系数10％，进样压力1.0kPa，进样速度25.10nL/min。

将实施例2中获得的荧光标记的细胞外囊泡与150μL未标记的细胞外囊泡(含200μg蛋白质)原液用PBS稀释1000倍，选择250±5nm的单分散纳米荧光硅球用于纳米流式检测仪的光学校准和计数标准，选择一组粒径分别为68±2nm，91±3nm，113±3nm及155±3nm的纳米硅球用于纳米流式检测仪的粒径标准，通过纳米流式检测技术(Nano flowcytometry,NanoFCM)分别检测实施例2中获得的荧光标记的细胞外囊泡与未标记的细胞外囊泡的粒径。检测条件：检测通道为散射通道，衰减系数10％，进样压力1.0kPa，进样速度25.10nL/min。

如图3A所示，由实施例2获得的细胞外囊泡的荧光标记率为96.3％；如图3B所示，由对比例1获得的细胞外囊泡的荧光标记率为5.1％。说明实施例2获得的细胞外囊泡的荧光标记率远高于对比例1；荧光示踪剂因具有α,β-不饱和羰基结构而与囊泡的亲和力更强，更能够有效地与囊泡结合。如图3C所示，实施例2获得的荧光标记的细胞外囊泡的平均粒径为76.72nm；如图3D所示，未标记的细胞外囊泡的平均粒径为74.25nm。说明实施例2获得的荧光标记的细胞外囊泡的平均粒径相比未标记的细胞外囊泡略有增加，但未有显著变化。

实施例5：应用高效液相色谱(HPLC)方法表征细胞外囊泡-含笑内酯偶联药物的载药率及包封率

精密称取含笑内酯标准品1.0mg，加流动相溶解并稀释成浓度为0.2mg/mL的含笑内酯标准品溶液。

选取色谱柱

如图4A所示，含笑内酯标准品与实施例3的出峰时间基本一致，分别为29.339min与29.800min，而并未观测到对比例2与对比例3的出峰，说明实施例3中存在含笑内酯，且对比例2与对比例3中不存在含笑内酯；对比例2的色谱数据证明在没有加入含笑内酯的情况下，囊泡自身不会产生类似含笑内酯的响应(图4A中d线为基线)，即无假阳性产生；对比例3中，在没有细胞外囊泡的存在下，所有的含笑内脂都被除尽了，因此没有相应峰的出现(图4A中c线为基线)，可见实施例3中不存在未被除尽的含笑内酯；根据含笑内酯标准品与实施例3的峰面积，计算得到实施例3中含笑内酯的净含量为24.0μg，证明本发明所述方法能够有效将含笑内酯偶联到细胞外囊泡上。图4B中可知实施例3中获得的细胞外囊泡-含笑内酯偶联物的载药率为19.0％，包封率为64.5％。

实施例6：应用透射电镜观察细胞外囊泡的形态学

将实施例2获得的荧光标记的细胞外囊泡、实施例3获得的偶联有含笑内酯的细胞外囊泡与纯细胞外囊泡(200μg蛋白质/150μL PBS)分别用PBS稀释10倍，各取10μL与同体积的4％的多聚甲醛(PFA)混合固定后，静置15min。取15μL样品滴于200目的铜网上，室温静置3min，用吸水纸吸干铜网上多余液体；在样品的铜网上滴加2％醋酸双氧铀溶液(15μL)，室温静置1min，对样品进行负染，用吸水纸吸干铜网上多余液体，将制备好的样品置于透射电镜(TEM)下观察，并采集图片。

如图所示，实施例2(图5A)与实施例3(图5B)获得的细胞外囊泡的形态均为较完整的杯托状囊泡结构。与纯细胞外囊泡(图5C)相比，形态学未发生显著变化。实施例7：通过Western blot检测细胞外囊泡的表面标志物蛋白CD9、CD81和TSG101

蛋白样品制备：在纯细胞外囊泡、实施例2与实施例3获得的细胞外囊泡中分别加入RIPA裂解液裂解细胞外囊泡，反复吹打后转移至洁净1.5mL EP管内，冰上裂解30min，每10min涡旋振荡一次，再于4℃下以12000rpm速度离心15min，转移上清至新的EP管中；使用BCA法测定细胞外囊泡蛋白浓度，向其余蛋白液中加入5倍上样缓冲液，在沸水中煮10min，于-80℃冰箱中贮备。

聚丙烯酰胺凝胶电泳：将洁净的玻板装于制胶架上，底边吻合严密，用蒸馏水验漏。按分离胶配方制备10％的分离胶溶液，充分混匀后用移液器将4.5ml分离胶溶液加入玻板缝隙中，立即缓慢加入蒸馏水将分离胶液面压平，约20min后分离胶凝固。再按配方制备5％的浓缩胶溶液，将1.5ml浓缩胶溶液灌注于分离胶的上方，立即插入梳子，待浓缩胶凝固。将配好的胶板置于电泳槽内，使短玻板向内侧，在两块玻板间加入电泳液，拔出梳子后按测定蛋白浓度统一上样量，将蛋白样品加入上样孔中，添加电泳液至电泳槽标记处，90V开始电泳，待溴酚蓝移至分离胶处，将电压调至120V，直至溴酚蓝接近玻板底部时则停止电泳。

转膜与封闭：将聚丙烯酰胺凝胶置于黑色夹板一侧，剪取适宜大小的PVDF膜，置于甲醇中活化60s，置于胶上，除尽气泡后夹好转膜夹，放置于转膜槽中，添加转膜液，冰浴恒压120V转膜2h。将转膜完成的PVDF膜取出，用TBST溶液清洗后置于5％的脱脂牛奶(封闭液)中，使用水平摇床以100rpm室温封闭1h。

抗体杂交：1)一抗孵育：用封闭液按说明书稀释一抗(CD9，稀释比1:1000；CD81，稀释比1:1000；TSG101，稀释比1:10000)，转移2mL一抗至抗体孵育盒中，对比蛋白Marker将目的条带剪下后浸泡于对应一抗中，4℃孵育过夜；2)二抗孵育：将目的条带用TBST清洗5min，反复3次，然后加入对应二抗，使用水平摇床以100rpm室温孵育2h，待孵育完成后用TBS清洗5min，反复3次。

发光检测：将发光液A与B等比例混合制备成工作液，在暗室中在膜上滴加发光液，待目的条带发出绿色荧光时，进行曝光、显影及定影。

如图6所示，实施例2与实施例3获得的细胞外囊泡的标志蛋白CD9、CD81和TSG101表达水平与纯细胞外囊泡基本一致，未发生显著变化。

实施例8：通过超高液相-分子排阻色谱法检测细胞外囊泡的纯度

将纯细胞外囊泡、实施例2与实施例3获得的细胞外囊泡用PBS分别稀释10倍(浓度至少为2×10

如图7A/B所示，实施例2与实施例3获得的细胞外囊泡纯度分别为97.2％和93.5％；如图7C所示，单纯细胞外囊泡纯度为99.6％。说明实施例2与实施例3获得的细胞外囊泡纯度比单纯细胞外囊泡纯度略有下降，但未有显著性变化。

综上，实施例2-8的结果证明，实施例2中在三乙胺催化条件下细胞外囊泡能够与末端具有α,β-不饱和羰基的荧光示踪剂直接共价偶联，获得荧光标记的细胞外囊泡。实施例3中在K

实施例9：通过流式细胞术检测荧光标记的细胞外囊泡被人胶质瘤细胞摄取的效果

人胶质瘤细胞(U251)的培养：在24孔培养板中以5×10

检测前的细胞处理：24孔培养板每孔弃去培养基后加入500μL的PBS缓冲液洗涤细胞。弃去PBS，向每孔中加入200μL胰酶消化细胞3min后，直接加入300μL的10％FBS终止消化。将每孔混合液转移至1.5mL EP管中，以350g的速度离心5min。弃去上清后，加入1mL的PBS重悬细胞，再次以350g的速度离心5min。弃去上清后，加入200-400μL的PBS重悬细胞，可上机检测。

如图8D所示，实施例2获得的荧光标记的细胞外囊泡被U251细胞中99.88％的群体摄取，说明经本发明所述的生物偶联方法对细胞外囊泡进行荧光标记后，不影响人胶质瘤U251细胞对细胞外囊泡的吞噬。

实施例10：通过激光共聚焦显微镜观察荧光标记的细胞外囊泡在人胶质瘤细胞内成像

人胶质瘤细胞(U251)的培养：将U251细胞培养于24孔培养板每孔内的细胞爬片上。待细胞融合度达70～80％，向每孔加入实施例2获得的荧光标记的细胞外囊泡，保证每孔细胞外囊泡的终浓度为50μg/mL，混合均匀后在37℃和5％CO

将对比例1获得的荧光标记的细胞外囊泡用同样的方法与U251细胞共培养24h，在激光共聚焦显微镜下观察其细胞内成像。

如图9A所示，实施例2获得的荧光标记的细胞外囊泡在U251细胞中清晰可见(细胞核周围明亮区域)，而对比例1获得的荧光标记的细胞外囊泡(图9B)在U251细胞内成像较实施例2为弱。

实施例11：通过溶解性曲线比较细胞外囊泡-含笑内酯偶联药物与含笑内酯的水溶性

以含笑内酯(MCL)为溶质，通过平衡法测定在不同体积的水中细胞外囊泡-含笑内酯偶联药物的最大溶质质量，评价细胞外囊泡-含笑内酯偶联药物与含笑内酯的水溶性。

在20℃条件下，以超纯水做溶剂，按实施例3中方法制备细胞外囊泡-含笑内酯偶联药物(EV-MCL)，通过平衡法依次测定0、1、2、5、10、20、50、75和100mL超纯水中所能溶解的含笑内酯最大质量。同时，将含笑内酯原料药加入超纯水中，连续搅拌并充分溶解，按相同方法测定不同体积的超纯水中所能溶解的含笑内酯最大质量。绘制20℃下的细胞外囊泡-含笑内酯偶联药物与含笑内酯的溶解性曲线。

如图10所示，随溶剂体积上升，细胞外囊泡-含笑内酯偶联药物与含笑内酯中所能溶解的溶质质量均呈现递增趋势，但在相同溶剂体积下细胞外囊泡-含笑内酯偶联药物中溶质质量均不低于含笑内酯原料药。已测定20℃下的含笑内酯的溶解度为2.9mg/100g水，而细胞外囊泡-含笑内酯偶联药物中含笑内酯的溶解度为13.3mg/100g水。说明本发明所述的生物偶联方法在一定程度上改善了含笑内酯天然产物的水溶性，含笑内酯的溶解度提高了4.6倍。

实施例12：细胞外囊泡-含笑内酯偶联药物在细胞水平的抗脑胶质瘤活性

通过噻唑蓝(MTT)方法在细胞水平评价实施例3中获得的细胞外囊泡-含笑内酯偶联药物分别对人脑胶质瘤细胞U118MG和U251的细胞毒性水平，以期在脑胶质瘤治疗领域获得应用。

MTT法是实验室常用的测试药物细胞毒性的方法之一。其原理为MTT可被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒，并且沉积在细胞中，通过显色来测试药物作用后细胞的生存状态(细胞活力)，以此间接评价药物的活性。在96孔板中以3000细胞/孔的接种密度种入U118MG细胞，使用高糖DMEM培养基(含10％FBS和1％双抗)在37℃和5％CO

如图11与图12所示，随实施例3中获得的细胞外囊泡-含笑内酯偶联药物浓度递增，U118MG和U251的细胞活力显著下降。与含笑内酯的作用相比，在相同浓度条件下，细胞外囊泡-含笑内酯偶联药物对脑胶质瘤细胞的生长有更强的抑制效果。

本发明实施例中使用末端含有α,β-不饱和羰基的荧光示踪剂与细胞外囊泡直接偶联，实现了细胞外囊泡的直接荧光标记，通过纳米流式、细胞流式及激光共聚焦显微镜体外检测实验表明，细胞外囊泡的荧光标记效率超过95％，并取得了良好的示踪效果，为开发细胞外囊泡活体示踪方法提供了新策略。另一实施例中使用含有α,β-不饱和羰基的含笑内酯(MCL)与细胞外囊泡直接偶联，获得细胞外囊泡-含笑内酯偶联物(EV-MCL)。实验结果表明，含笑内酯的溶解度提高了4.6倍，体外抗脑胶质瘤细胞U118和U251的活性比含笑内酯原药分别提高了2.3倍和1.7倍。这说明，本发明提供的方法有助于含有α,β-不饱和羰基的天然产物提升水溶性及抗肿瘤活性，为改善倍半萜内酯类天然产物的生物利用度及药效提供了新方法。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。