一种检测马IL-1β双抗体夹心ELISA试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及二株马IL-1β蛋白单克隆抗体，还涉及利用该单克隆抗体建立的用于马IL-1β的双抗体夹心ELISA方法及试剂盒。本发明属于生物技术领域。

背景技术

IL-1β(Interleukin-1β)是白细胞介素-1(IL-1)家族的重要成员。是先天免疫和炎症的中心介质，广泛参与炎症性疾病的发生和发展。特别是神经性炎症，病毒感染相关性炎性，骨关节性炎症等。IL-1β主要由血液中的单核细胞和巨噬细胞所产生，各种上皮细胞，内皮细胞和间质细胞也可产生IL-1β。IL-1β作为35-kDa的前体蛋白产生，受炎症小体的加工，在稳态条件下IL-1β为低水平表达。当机体受到病原体或损伤相关分子模式的刺激后宿主炎症小体被活化，产生活性蛋白酶Caspase-1(CASP1)。进而将IL-1β的前体蛋白切割成17-kDa活性形式。被释放至组织中启动和促进炎症，IL-1β含量升高表明机体内有组织损伤或者感染产生。更有多项研究表明，IL-1β在原发肿瘤中的表达可用于多种癌症患者发生骨转移风险增加的潜在生物标志物。

IL-1β同样参与马属动物的多种病理免疫和炎症反应过程。IL-1β的高表达与马属动物骨病，神经性相关性疾病，病毒感染性疾病更是息息相关。因此，临床上对IL-1β的评估可以作为多种炎症性疾病进展的判定标准。同时，IL-1β也是基础研究中判定炎症小体活化的重要评估指标。目前，对于IL-1β的检测方法分为血清学检测和分子生物学方法。分子生物学常用方法有传统PCR方法和荧光定量PCR方法。例如，2011年，陈宏备建立了荧光定量PCR方法检测小鼠的IL-1β(陈宏备.小鼠IL-1β、TNF-αTaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及脑心肌炎病毒感染小鼠的检测[D].中国预防兽医学报)。2011年汪伟建了荧光定量PCR方法检测猪的IL-1β的方法(汪伟.猪IL-1β与IL-18SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立)。但这种方法的原理都是通过扩增目的基因，需要从病料中提取核酸，而且对于提取样本的核酸浓度有一定的要求，且PCR方法存在一定的假阳性。目前还尚缺乏针对马IL-1β特异性的分子生物学检测方法。

血清学检测方法具有良好的特异性，简便、易于推广和标准化的优点，可同时检测大量标本且废弃物容易处理，是细胞因子检测的首选方法，更适合在临床检测中推广。已有研究报道，多种属已建立了IL-1β的ELISA诊断方法，包括人，大鼠，小鼠，牛，羊等。但尚缺少马的特异性IL-1β的ELISA的诊断方法。

本发明利用单克隆抗体3G8作为检测抗体，单克隆抗体5G3作为捕获抗体，建立一种快速检测马IL-1β的双抗体夹心ELISA方法，反应中抗原与两种抗体不同抗原决定簇结合，大大提高了检测的特异性，检测结果可信度更高。同时，阴性对照和阳性对照的设置保证了每次试验重复时的准确性。双抗体夹心ELISA方法检测时可保证每次操作步骤相同，大量样品检测都处于同一反应体系中，可将操作过程中的误差降到最低。此外，双抗体夹心ELISA方法的操作步骤简单，耗费时间短，对于试验人员的专业要求相对较低。用于双抗体夹心ELISA方法的试剂非常普遍，试剂价格便宜，使得双抗体夹心ELISA方法具有普适性，并可用于大批量样品的检测。与传统方法相比，更具优势，ELISA具有特异、简便、易于推广和标准化的优点，可同时检测大量标本且废弃物容易处理，是细胞因子检测的首选方法，更适合在临床检测中推广。

发明内容

本发明的目的之一是提供两株能够分泌抗马IL-1β蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及由该杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体。

本发明的目的之二是利用上述单克隆抗体建立一种可用于马IL-1β检测的双抗体夹心ELISA方法及试剂盒。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明根据NCBI公布的马IL-1β基因序列，通过公司合成获得IL-1β基因片段，将其与表达载体连接，构建了pGEX-6P-1-IL-1β重组表达载体，转化后筛选获得重组大肠杆菌，通过诱导表达获得马IL-1β蛋白，将其纯化后免疫小鼠(100μg/只)；根据NCBI公布的马IL-1β基因序列，通过DNAstar分析抗原免疫原性，通过公司合成多肽，将其免疫小鼠(100μg/只)，经过细胞融合、克隆和筛选共获得了两株阳性杂交瘤细胞株，分别命名为EqIL-1β3G8和EqIL-1β5G3，经鉴定，分泌抗体亚型均为IgG1，且两株细胞株均能稳定分泌抗马IL-1β蛋白的单克隆抗体。蛋白免疫印迹实验检测，两株单克隆抗体与马IL-1β均可发生特异性反应，显示特异性条带。且特异性试验结果表明，两株单克隆抗体与马IL-1α、IL-1Ra、IFN-α、SAA均不发生反应。两株杂交瘤细胞EqIL-1β3G8和EqIL-1β5G3分泌单抗效价均为1：640000。

选择EqIL-1β3G8和EqIL-1β5G3建立双抗体夹心ELISA方法，通过对反应条件进行优化，最终确定捕获抗体EqIL-1β3G8最佳包被浓度为7.5μg/mL，检测抗体EqIL-1β5G3最佳稀释倍数为1：500，最佳封闭液为以体积比1:1混合的商品化封闭液②与5％v/v山羊血清，最佳封闭条件为37℃1h，最佳抗原孵育条件为37℃2h，最佳检测抗体孵育条件为25℃2h，最佳亲和素稀释倍数为1:1000，最佳亲和素孵育条件为25℃1h，最佳显色条件为25℃15min。双抗体夹心ELISA方法的特异性检测结果表明，除马IL-1β检测为阳性，与其它细胞因子马IL-1α、IL-1Ra、IFN-α、SAA均不发生反应，显示了良好的特异性。灵敏性试验结果显示，该方法对马IL-1β的最低检出限为9.3pg/mL。且重复性试验的变异系数均在5％以下，表明建立的双抗体夹心ELISA方法具有良好的重复性。通过对样品的检测，结果表明本发明建立的双抗体夹心ELISA方法与RD公司DY3340试剂盒的符合率为94％。

在上述研究的基础上，本发明首先提出了一种分泌抗马IL-1β蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株组合，所述的杂交瘤细胞株组合由杂交瘤细胞株EqIL-1β3G8和EqIL-1β5G3组成，其中杂交瘤细胞株EqIL-1β3G8以及杂交瘤细胞株Eq IL-1β5G3保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏号分别为:CGMCCNo.45601和CGMCCNo.45602。

进一步的，本发明还提出了一种抗马IL-1β蛋白的单克隆抗体组合，所述的单克隆抗体组合由所述的杂交瘤细胞株组合分泌产生的单克隆抗体EqIL-1β3G8以及单克隆抗体EqIL-1β5G3组成。

再进一步的，本发明还提出了所述的杂交瘤细胞株组合在制备检测马IL-1β试剂中的用途。以及所述的单克隆抗体组合在制备检测马IL-1β试剂中的用途。

更进一步的，本发明还提出了一种检测马IL-1β的双抗体夹心ELISA试剂盒，所述的试剂盒包括所述的单克隆抗体组合，其中所述的单克隆抗体EqIL-1β3G8作为检测抗体，生物素标记的单克隆抗体EqIL-1β5G3作为捕获抗体。

其中，优选的，所述的试剂盒还包括标准品、三抗、封闭液、稀释液、洗涤液、显色液以及终止液。

其中，优选的，所述的标准品为马IL-1β重组蛋白；所述的三抗为HRP标记的亲和素(streptavidin)；所述的封闭液为1:1混合的商品化封闭液②与含5％山羊血清的PBS缓冲液；所述的稀释液为含有酪蛋白的PBST溶液；所述的洗涤液是将0.2gKH

其中，优选的，所述的试剂盒用于定量检测马IL-1β，按照以下步骤进行：

(1)将单克隆抗体EqIL-1β3G8以稀释液稀释至7.5μg/mL，每孔加入100μL，4℃包被过夜；每孔加入200μL洗涤液，洗涤3次，每次5min；

(2)每孔加入封闭液200μL，37℃封闭1h，每孔加入200μL洗涤液，洗涤3次，每次5min；

(3)将标准品用稀释液稀释至8500pg/mL浓度，倍比稀释至第7孔；将待测样本溶液加入ELISA板中，100μL/孔，设置平行孔，37℃作用2h；每孔加入200μl洗涤液，洗涤3次，每次5min；同时设置阳性对照以及阴性对照；

(4)将生物素标记的单克隆抗体EqIL-1β5G3用稀释液1:500稀释后，加入ELISA板中，每孔100μL，25℃作用2h；每孔加入200μL洗涤液，洗涤3次，每次5min；

(5)将HRP标记的亲和素用稀释液以1:1000稀释，25℃作用1h；每孔加入200μL洗涤液，洗涤3次，每次5min；

(6)每孔加入TMB底物显色液100μL，25℃显色15min；

(7)加入2MH

(8)根据标准品的OD

其中，优选的，单克隆抗体EqIL-1β3G8以稀释液稀释至7.5μg/mL，生物素标记的单克隆抗体EqIL-1β5G3的稀释倍数为1：500。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明使用纯化后的单克隆抗体EqIL-1β3G8作为捕获抗体，单克隆抗体EqIL-1β5G3作为检测抗体，建立了双抗体夹心ELISA方法。将双抗体夹心ELISA方法的反应条件和试剂进行优化，提高了检测的敏感性和特异性，使得双抗体夹心ELISA方法的检测结果更加准确。建立了双抗体夹心ELISA方法。特异性试验结果表明该方法特异性良好，与马IL-1α、IL-1Ra、IFN-α、SAA均不发生反应。灵敏性试验表明该方法对马IL-1β的最低检出限为143pg/mL。重复性试验表明该方法变异系数均小于5％，确定该方法具有良好的重复性。通过对样品的检测发现，双抗体夹心ELISA方法与国外试剂盒的检测结果基本一致，符合率为94％。综上，本发明建立的双抗体夹心ELISA方法特异性强、稳定性好、耗时少，且成本低廉，可用于马IL-1β的检测。

附图说明

图1为Gst-IL-1β、IL-1β蛋白表达的SDS-PAGE鉴定结果；

注：M：预染蛋白Marker；1.：pGEX-6P-1-IL-1β诱导前；2：pGEX-6P-1-IL-1β诱导后；纯化后的IL-1β蛋白；

图2为纯化后单抗SDS-PAGE鉴定结果；

注：M：低分子量蛋白Marker；1：单抗EqIL-1β3G8腹水；2：纯化后单抗EqIL-1β3G8；3：单抗EqIL-1β5G3腹水；4：纯化后单抗EqIL-1β5G3；

图3为单克隆抗体效价；

图4为单克隆抗体WB鉴定结果；

注：M：低分子量蛋白Marker；1：马原代单核巨噬细胞NC(3G8)；2：马原代单核巨噬细胞LPS(3G8)；3：马原代单核巨噬细胞LPS+Nig(3G8)；4：马原代单核巨噬细胞NC(5G3)；5：马原代单核巨噬细胞LPS(5G3)；6：马原代单核巨噬细胞LPS+Nig(5G3)；

图5为单克隆抗体的特异性鉴定结果；

注：M：低分子量蛋白Marker；1：IL-1β(3G8)；2：IL-1α(3G8)；3：IL-1Ra(3G8)4：IFN-α(3G8)；5：SAA(3G8)；6：IL-1β(5G3)；7：IL-1α(5G3)；8：IL-1Ra(5G3)9：IFN-α(5G3)；10：SAA(5G3)；

图6为单克隆抗体5G3表位鉴定结果；

注：M：低分子量蛋白Marker；

图7为捕获抗体与检测抗体最佳工作浓度的确定；

图8为封闭液的确定；

图9为封闭条件的确定；

图10为抗原孵育条件的确定；

图11为二抗孵育条件的确定；

图12为HRP标记的亲和素三抗浓度的确定；

图13为HRP标记的亲和素三抗孵育条件的确定；

图14为显色条件的确定；

图15为双抗体夹心ELISA方法检测限、灵敏度、检测范围的确定；

图16为特异性试验结果。

菌种保藏信息：

1、杂交瘤细胞株Eq IL-1β3G8

命名：Eq IL-1β3G8

分类命名：马IL-1β单克隆细胞株

保藏号：CGMCC No.45601

保藏时间：2023年4月27日

保藏机构：中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General MicrobiologicalCulture Collection Center,CGMCC)

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

2、杂交瘤细胞株Eq IL-1β5G3

命名：Eq IL-1β5G3

分类命名：马IL-1β单克隆细胞株

保藏号：CGMCC No.45602

保藏时间：2023年4月27日

保藏机构：中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General MicrobiologicalCulture Collection Center,CGMCC)

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但该实施例仅用于说明本发明，并不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌株

大肠杆菌感受态DH5α、BL21购自北京擎科生物科技有限公司；pGEX-6P-1表达载体来自于本实验室。

1.1.2细胞与病毒

SP2/0、马巨噬细胞来自于本实验室。

1.1.3实验动物

6周龄SPF级BALB/c雌鼠(体重为15～20g)购自辽宁长生生物技术有限公司。

1.1.4主要试剂

表1主要试剂

1.1.5主要试剂的配制

1.1.5.1细胞培养液以及细胞融合所需试剂配方

(1)完全1640培养液：400mL基础1640培养液中加入100mL胎牛血清、5.5mLL-谷氨酰胺和5.5mL双抗，4℃备用。

(2)HAT/HT培养液：400mL基础1640培养液中加入100mL胎牛血清、5.5mLL-谷氨酰胺、5.5mL双抗和使用培养基溶解的HAT或HT培养基添加剂，4℃备用。

(3)SP2/0细胞培养液：400mL基础1640培养液中加入100mL胎牛血清、5.5mLL-谷氨酰胺和5.5mL双抗，4℃备用。

(4)马巨噬细胞培养液：200mL基础1640培养液中加入150mL新生牛血清、150mL马血清，5.5mL双抗，4℃备用。

1.1.5.2蛋白质电泳试剂配方

(1)5×SDSbuffer：0.25MTris，10％SDS，50％甘油，0.5％溴酚蓝，2MHCl，1MDTT，溶解在乙酸钠中，充分溶解后-20℃冻存。

(2)电泳缓冲液：一包预制蛋白胶电泳液，加水定容到1L，充分溶解后室温保存。

1.1.5.3Westernblot试剂配方

(1)转印buffer：39mMGlycine，48mMTris，0.037％SDS，20％甲醇，加水定容至1L，充分溶解后室温保存。

(2)封闭液：5g脱脂乳定容于100mLTBST缓冲液中。

(3)10×TBS缓冲液：0.2MTris-HCl，1.5MNaCl，加水定容到1L，充分溶解后室温保存。

(4)1×TBST缓冲液：取100mL10×TBS加水稀释，加入500mLTween-20，定容至1L，充分混匀后室温保存。

1.1.5.4ELISA试剂配方

(1)PBST洗涤液：0.2gKH

(2)稀释液：PBSTw-酪蛋白封闭液。

(3)封闭液：5g脱脂乳定容于100mLPBS缓冲液(pH7.4)中。

(4)终止液：2MH

1.1.5.5蛋白纯化试剂及配方

蛋白纯化试剂为裂解缓冲液、洗脱缓冲液(表2)。

表2蛋白纯化试剂

1.1.5.6腹水纯化试剂及配方

腹水纯化试剂为平衡缓冲液、洗脱缓冲液、中和缓冲液(表3)。

表3腹水纯化试剂

1.2试验方法

1.2.1多肽免疫原的获得

根据NCBI上GeneID:100034237的序列，使用DNAstar分析抗原免疫原性，送金斯瑞生物技术有限公司合成多肽。

1.2.2马IL-1β基因的获得

根据NCBI上GeneID:100034237的序列，送金斯瑞生物技术有限公司合成马IL-1β基因。合成时将目的基因与表达载体pGEX-6P-1连接。

1.2.2.1重组表达载体的转化

将重组表达载体pGEX-6P-1-IL-1β转化到BL21感受态当中，具体步骤如下：

(1)取出大肠杆菌BL21感受态，置于冰浴中融化5min。

(2)将1uLpGEX-6P-1-IL-1β和100uL感受态在无菌条件下混匀，冰浴30min。

(3)42℃热击45s。

(4)冰浴5min。

(5)无菌条件下加入LB液体培养基200uL。

(6)37℃培养60min。

(7)吸取200uL涂于氨苄抗性LB固体培养基。

(8)在恒温培养箱中37℃培养12h，得到重组大肠杆菌

pGEX-6P-1-IL-1β/BL21。

1.2.2.2重组蛋白免疫原的制备

1.2.2.2.1重组大肠杆菌的诱导表达

(1)将重组大肠杆菌pGEX-6P-1-IL-1β/BL21划线于氨苄抗性LB固体培养基，活化后，挑取单菌落接种于氨苄抗性的LB培养基中，扩大培养至2mL。每隔半小时测一次OD

(2)当OD

(3)取2mL诱导后的菌液通过4℃低温离心机12000×g离心10min，弃去上清，并用2mLPBS重悬菌体沉淀；

(4)重悬后的菌液于4℃低温离心机12000×g离心10min，弃去上清，并用2mLPBS液重悬；

(5)重悬液中加0.02mL溶菌酶，0.02mLPMSF；

(6)使用超声仪将菌体超声破碎15s，程序为超声5s暂停5s；

(7)超声结束后，悬液于4℃低温离心机5000×g离心10min，弃去上清，加入2mLPBS将沉淀悬起；

(8)以1：4的比例加入5×SDS-PAGE上样缓冲液(含DTT)，煮沸10min，-20℃保存备用；

1.2.2.2.2重组大肠杆菌表达的鉴定

将诱导前和诱导后的大肠杆菌分别超声处理并加入5×SDS-PAGE上样缓冲液(含DTT)煮样。获得的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分析鉴定目的蛋白表达情况。

1.2.2.2.3马Gst-IL-1β蛋白的纯化及鉴定

(1)将重组大肠杆菌pGEX-6P-1-IL-1β/BL21划线于氨苄抗性LB固体培养基，活化后，挑取单菌落接种于氨苄抗性的LB培养基中，扩大培养至250mL。每隔半小时测一次OD

(2)当OD

(3)取250mL诱导后的菌液通过4℃低温离心机6000×g离心10min，弃去上清，并用10mLPBS液重悬菌体沉淀；

(4)重悬后的菌液于4℃低温离心机6000×g离心10min，弃去上清，并用40mL裂解缓冲液重悬；

(5)重悬液中加0.4mL溶菌酶，0.4mLPMSF；

(6)使用超声仪将菌体超声破碎30min，程序为超声5s暂停5s；

(7)超声结束后，悬液于4℃低温离心机8000×g离心10min，收集上清；

(8)取1ml混合均匀的GST-tagPurificationResin装入亲和层析柱，然后用0.5ml裂解缓冲液平衡2-3次后，将超声后细菌裂解液上清加入，在水平摇床上4℃孵育1h；

(9)将纯化柱底部的盖子打开，在重力作用下使柱内液体流出；

(10)洗涤5次，每次加入1ml裂解缓冲液；

(11)洗脱10次，每次加入1ml洗脱缓冲液。

(12)测定蛋白浓度，于-80℃保存

(13)取纯化后的马Gst-IL-1β蛋白加入5×SDS-PAGE上样缓冲液(含DTT)煮沸10min后，进行SDS-PAGE分析鉴定纯化蛋白。

1.2.2.2.4马IL-1β蛋白的纯化及鉴定

(1)将纯化的马Gst-IL-1β以1:100加入PMSF和PPase，4℃混悬，酶切过夜。

(2)取1ml混合均匀的GST-tagPurificationResin装入亲和层析柱，然后用0.5ml裂解缓冲液平衡2-3次后，将酶切后液体过柱。收集过柱后液体即为马IL-1β蛋白。

(3)取纯化后的马IL-1β蛋白加入5×SDS-PAGE上样缓冲液(含DTT)煮沸10min后，进行SDS-PAGE分析鉴定纯化蛋白。

1.2.3抗马IL-1β单克隆抗体的制备

1.2.3.1动物免疫

将纯化的马IL-1β蛋白免疫6周龄SPF级雌性BALB/c小鼠，具体免疫程序如下：取纯化蛋白(100μg)与弗氏完全佐剂以1:1比例等体积混合乳化后，腹腔注射，间隔15天进行第二次免疫，将纯化蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化后，腹腔注射(剂量与第一次相同)，间隔15天后进行第三次免疫，将纯化蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化后，腹腔注射(剂量与第一次相同)，第三次免疫后一周进行加强免疫，取纯化蛋白100μg(不加佐剂)腹腔注射小鼠。

1.2.3.2SP2/0细胞的准备

(1)于融合前1周复苏SP2/0细胞。将冻存的细胞从-80℃冰箱取出，并迅速放入37℃水浴融化。

(2)于15mL离心管内加入6mL基础1640培养液，将融化后的细胞液吸出，并逐滴滴加入离心管内，轻轻混匀。

(3)800×g离心4min，弃去上清液，用完全1640培养液轻轻悬起细胞，混匀后移入细胞瓶内，于37℃培养箱培养。

(4)显微镜下观察SP2/0细胞状态，选择大小均一、边缘整齐、透光度好的细胞。将细胞用6mL基础1640培养液重悬，800×g离心4min，弃去上清，用5mL基础1640培养液重悬细胞混匀，将细胞悬液稀释并计数。

1.2.3.3饲养层细胞的制备

(1)取未免疫的BALB/c小鼠，拉颈处死，于75％酒精中浸泡5min。

(2)将小鼠固定于消毒后的解剖板上。用灭菌后的剪刀沿小鼠腹中线将腹部皮肤剪开，钝性分离皮肤与腹膜，将皮肤固定使其腹膜充分暴露。

(3)于小鼠腹腔内注射5mL预冷的HAT培养液，用注射器反复吸吹培养液，然后将培养液吸出。

(4)将注射器针头取下，将吸出的培养液加入45mL预冷的HAT培养液中，轻轻混匀。

(5)将培养液加入96孔板中，每孔100μL，标记时间和序号，于37℃恒温培养箱中培养。

1.2.3.4免疫鼠脾细胞的制备

(1)将免疫鼠眼球采血，用EP管收集血液，用于阳性血清的制备。

(2)拉颈处死小鼠，于75％酒精中浸泡5min。

(3)将小鼠固定于消毒后的解剖板上，用灭菌后的剪刀将小鼠皮肤沿腹中线剪开，将皮肤固定，然后剪开腹膜，将脾脏取出。

(4)将脾脏剥离结缔组织后，转移至平皿中，用注射器在脾脏下缘扎几个小孔，然后用注射器吸取20mL基础1640培养液从脾脏上缘反复吹出，直至脾脏变的透明。

(5)将含有脾细胞的培养液加入离心管中，用基础1640培养液补齐到20mL,将细胞悬液进行计数。

1.2.3.5细胞融合

(1)细胞计数后，将脾细胞与SP2/0细胞按8：1的比例加入离心管中，1000×g离心5min，弃上清。

(2)用手指轻轻弹击离心管底，使两种细胞混匀。

(3)将离心管37℃水浴，将1mL预热的细胞融合剂在1min内逐滴加入离心管，一边滴一边轻轻晃动离心管，静置1min。

(4)将预热的5mL基础1640培养液悬空缓慢加入，1mL/30s，速度逐渐加快。

(5)将预热的10mL基础1640培养液对着底层的PEG慢慢加入。

(6)将预热的35mL基础1640培养液对着细胞团块慢慢加入。加完后，轻轻混匀细胞，800×g离心4min，弃掉上清液。用50mL基础1640培养液将细胞悬起，800×g离心4min，弃掉上清液。

(7)将融合后的细胞用10mLHAT培养液悬起，然后将细胞悬液加入到含有饲养层细胞的培养板中，每孔100μL，置于恒温培养箱培养。

1.2.3.6阳性杂交瘤细胞的筛选和克隆

(1)融合后第四天观察融合后的细胞，并记录融合情况。

(2)融合一周后，用HAT培养液对细胞培养板进行半换液。

(3)融合两周后，用完全1640培养液对细胞培养板进行全换液。

(4)细胞长满孔板底部1/3时，吸出100μL上清液，并加入100μL完全1640培养液。通过间接ELISA方法检测细胞上清效价，阳性抗体对照为免疫小鼠血清，阴性抗体对照为未免疫小鼠血清。测OD

(5)采用有限稀释法对检测结果为阳性的杂交瘤细胞进行克隆，克隆之后进行三次以上亚克隆，直至检测结果均为阳性。

1.2.3.7杂交瘤细胞的冻存

将杂交瘤细胞株扩大培养，由96孔板转移至24孔板，再转移到细胞瓶中扩大培养。调整细胞状态，至少10mL以上可以冻存，选取边缘整齐、形态圆润、大小均一、折光度良好且处于对数生长期的细胞，冻存之前12小时更换培养液，然后进行冻存。冻存方法如下：弃上清，取10mL培养液将细胞吹下，800×g离心4min，弃上清，用10％的DMSO将细胞悬起并移入冻存管内，将冻存管放入冻存盒内冻存。

1.2.4小鼠腹水的制备

取5只Balb/c小鼠，每只腹腔注射1mL弗氏不完全佐剂，1d后将单克隆细胞株按1×10

1.2.4.1小鼠腹水的纯化

(1)腹水14000rpm离心20min后，取上清，用0.45μm过滤器过滤；

(2)用20mL平衡缓冲液激活ProteinGResin。

(3)过滤后上清与平衡缓冲液1:1混合。混合后上清过三遍ProteinGResin(或者结合15min)。

(4)用20mL平衡缓冲液洗涤ProteinGResin。

(5)用800uL洗脱缓冲液洗脱ProteinGResin，洗12次。并立刻加入200uL中和缓冲液。

(6)测定抗体浓度，于-80℃保存。

(7)取纯化后的抗体加入5×SDS-PAGE上样缓冲液(含DTT)煮沸10min后，进行SDS-PAGE分析鉴定纯化抗体。

1.2.5单克隆抗体生物学特性鉴定

1.2.5.1单克隆抗体效价测定

取纯化单克隆抗体，采用间接ELISA方法检测单克隆抗体的效价。

1.2.5.2单克隆抗体亚类鉴定

将收集的2株杂交瘤细胞上清，用单克隆抗体免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒鉴定单抗亚类。具体步骤按照试剂盒说明书操作。

1.2.5.3单克隆抗体WB验证

检测马原代单核巨噬细胞中内源性IL-1β蛋白的表达情况。将马原代单核巨噬细胞分为未处理组、LPS处理组、LPS+Nig处理组。使用纯化的抗体作为一抗，进行WB检测。

1.2.5.4单克隆抗体特异性鉴定

通过WB方法，将2株单抗分别与IL-1α、IL-1Ra、IFN-α、SAA反应，分析2株单抗的特异性。

1.2.6单克隆抗体表位鉴定

1.2.6.1EqIL-1β3G8表位鉴定

因EqIL-1β3G8单克隆抗体是免疫多肽获得的，故其抗原表位直接明确。

1.2.6.2EqIL-1β5G3表位鉴定

通过将IL-1β分段截短，用EqIL-1β5G3作为一抗，WB鉴定其表位。

1.2.6双抗体夹心ELISA方法的建立

1.2.6.1捕获抗体与检测抗体最佳工作浓度的确定

(1)将捕获抗体EqIL-1β3G8以2.5、5、7.5、10μg/mL浓度使用稀释液稀释，每孔加入100μL，4℃包被过夜。过夜后，每孔加入200μLPBST溶液，洗涤3次，每次5min。

(2)加入5％w/v脱脂乳，200μL每孔，37℃封闭1h。洗涤三次，方法同前。

(3)将重组蛋白和PBS(即阴性对照)同时加入ELISA板中，设置平行孔，37℃作用1h。洗涤三次，方法同前。

(4)将检测抗体EqIL-1β5G3以1：100、1：500、1：1000、1：2000比例使用稀释液稀释，加入ELISA板中，每孔100μL，设置平行孔，37℃作用1h。然后洗涤三次，方法同前。

(5)将HRP标记的亲和素三抗以1：1000倍使用稀释液稀释，37℃作用1h。然后洗涤三次，方法同前。

(6)TMB底物显色液每孔100μL，室温显色15min。

(7)加入2MH

1.2.6.2双抗体夹心ELISA方法最佳反应条件的选择

分别选取含2％w/vBSA、5％w/vBSA、2％w/v脱脂乳、5％w/v脱脂乳、2％w/vNH

封闭条件分别为：37℃60min，37℃120min，25℃60min，25℃120min其余步骤同1.2.6.1，根据OD

待检样品作用条件分别为：37℃60min，37℃120min，25℃60min，25℃120min，其余步骤同1.2.6.1。根据OD

二抗作用时间分别为：37℃60min，37℃120min，25℃60min，25℃120min，其余步骤同1.2.6.1。根据OD

分别将HRP标记的亲和素三抗以1：500、1:1000、1:2000、1:4000、1:6000、1:8000、1:10000、1:15000、1:20000稀释，其余步骤同1.2.6.1。根据OD

HRP标记的亲和素三抗作用时间分别为：37℃30min，37℃60min，25℃30min，25℃60min，其余步骤同1.2.6.1。根据OD

显色作用时间分别为：37℃5min，37℃10min，37℃15min，25℃5min，25℃10min，25℃15min，其余步骤同1.2.6.1。根据OD

1.2.6.3双抗体夹心ELISA方法检测限的确定

对阴性样品进行检测，测得每份样品的OD

1.2.6.4双抗体夹心ELISA方法灵敏度的确定

将重组蛋白以2381、1190.5、595.25、297.63、148.81、74.41、37.20、18.60、9.30、4.65pg/mL稀释，其余步骤按照上述双抗体夹心ELISA方法进行。确定除“0”样品外，浓度最小的样品浓度即为双抗体夹心ELISA方法的灵敏度。

1.2.6.5双抗体夹心ELISA方法检测范围的确定

在标准曲线成线性范围的上下限处，将重组蛋白稀释若干个浓度，其余步骤按照上述双抗体夹心ELISA方法进行。根据标准曲线，回算浓度在标示值的±25％即为可接受范围。在可接受范围内的样品最低、最高浓度即检测范围。

1.2.6.5特异性试验

选择四种细胞因子进行双抗体夹心ELISA方法的特异性试验，分别为IL-1α、IL-1Ra、IFN-α、SAA。按照上述双抗体夹心ELISA方法检测。

1.2.6.6重复性试验

1.2.6.6.1板内重复性试验

在1块酶标板内检测4份样品，每份样品做7个重复孔。计算样品在同一块板内OD

1.2.6.6.2板间重复性试验

选2块酶标板，检测4份样品，每份样品做14个重复孔，计算样品在不同板间OD

1.2.7临床样品的检测

通过RD公司DY3340双抗体夹心ELISA方法和本研究建立的双抗体夹心ELISA方法检测84份马场收集来的马血清样品。马血清处理方法如下：1000×g离心10min，吸上清，进行检测。将RD公司DY3340双抗体夹心ELISA方法和本研究建立的双抗体夹心ELISA方法检测结果进行对比。

2结果

2.2目的蛋白的表达及纯化鉴定结果

2.2.1目的蛋白表达的SDS-PAGE鉴定结果

将重组菌pGEX-6P-1IL-1β/BL21扩大培养，并进行诱导表达，经SDS-PAGE鉴定，结果如图1，表达蛋白条带大小约为43KD，与Gst-IL-1β目的蛋白大小相符。

2.2.3IL-1β蛋白纯化后的SDS-PAGE鉴定结果

将表达的马Gst-IL-1β、IL-1β蛋白过柱纯化，经SDS-PAGE电泳后，结果如图1，纯化蛋白大小约为43、17KD，与Gst-IL-1β、IL-1β目的蛋白大小相符。经检测，纯化蛋白浓度为1mg/mL。

2.3阳性杂交瘤细胞株筛选方法

用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤，纯化的IL-1β蛋白、多肽以50ng/孔包被，4℃过夜包被，拍干，200μL/孔PBST洗3次，5min/次，拍干，200μL/孔封闭液室温孵育1.5h，200μL/孔PBST洗3次，3min/次，拍干，用杂交瘤细胞上清作为一抗，100μL/孔，37℃静置孵育1h，200μL/孔PBST洗3次，3min/次，拍干，HRP标记的鼠二抗1:2000稀释后100μL/孔，37℃静置孵育1h，200μL/孔PBST洗3次，3min/次，拍干，TMB显色液100μL/孔，室温显色15min，50μL/孔2MH2SO4终止液。终止后立即检测OD

共获得2株阳性杂交瘤细胞株，分别命名为EqIL-1β3G8、EqIL-1β5G3。保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏号分别为:CGMCCNo.45601和CGMCCNo.45602。

2.4单克隆抗体纯化后的SDS-PAGE鉴定结果

将小鼠腹水过柱纯化，经SDS-PAGE电泳后，结果如图2。可见清晰的重链和轻链条带，且无杂带，结果表明单克隆抗体纯化效果较好。经检测，纯化抗体浓度为1mg/mL。

2.5杂交瘤细胞生物学特性鉴定结果

2.5.1单克隆抗体效价的测定结果

取纯化后的单克隆抗体，采用间接ELISA方法测定单克隆抗体效价，两株杂交瘤细胞EqIL-1β3G8、EqIL-1β5G3分泌单抗效价均为1:640000。结果如图3。

2.5.2单克隆抗体亚类鉴定结果

使用单抗免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒抗体对单抗亚型进行检测，经鉴定，Eq IL-1β3G8、EqIL-1β5G3分泌抗体亚型均为IgG1。

2.6.4单克隆抗体反应性的鉴定结果

2.6.4.1Westernblot鉴定结果

Westernblot鉴定结果如图4，用2株单克隆抗体(EqIL-1β3G8、EqIL-1β5G3)检测马原代单核巨噬细胞中内源性pro-IL-1β、IL-1β蛋白的表达情况，未处理组、LPS处理组与LPS+Nig处理组均在37KD处有特异性条带；LPS处理组与LPS+Nig处理组在17KD处有特异性条带，结果表明2株单克隆抗体均可与IL-1β蛋白特异性结合。

2.6.5单克隆抗体的特异性鉴定结果

采用WB方法将单抗与IL-1β、IL-1α、IL-1Ra、IFN-α、SAA反应，结果如图5，2株单抗只与IL-1β发生特异性反应，与IL-1α、IL-1Ra、IFN-α、SAA均不发生反应。

2.6.6单克隆抗体表位鉴定结果

2.6.6.1EqIL-1β3G8表位鉴定结果

因3G8单克隆抗体是免疫多肽获得的，故其抗原表位直接明确。

2.6.6.1EqIL-1β5G3表位鉴定结果

将IL-1β分段截短，采用WB方法，将EqIL-1β5G3与截短后IL-1β反应，结果如图6，最终明确抗原表位。

2.7双抗体夹心ELISA方法的建立

2.7.1捕获抗体与检测抗体最佳工作浓度的确定

捕获抗体EqIL-1β3G8以2.5、5、7.5、10μg/mL浓度稀释，检测抗体EqIL-1β5G3以1：100、1：500、1：1000、1：2000比例稀释，结果如图7，最终确定捕获抗体以7.5μg/mL稀释，检测抗体最佳稀释倍数为1：500。此时灵敏度高、标准曲线R

2.7.2双抗体夹心ELISA方法最佳反应条件的选择

2.7.2.1封闭液的选择

选择封闭液分别为：2％w/vBSA、5％w/vBSA、2％w/v脱脂乳、5％w/v脱脂乳、2％w/vNH

2.7.2.2封闭条件的选择

封闭条件分别为：37℃60min，37℃120min，25℃60min，25℃120min，结果如图9。最终确定最佳封闭条件是37℃60min。此时P/N最大。

2.7.2.3抗原孵育条件的选择

待检样品作用条件分别为：37℃60min，37℃120min，25℃60min，25℃120min，结果如图10。最终确定最佳抗原孵育条件是37℃120min。此时P/N最大。

2.7.2.4二抗孵育条件的选择

二抗作用条件分别为：37℃60min，37℃120min，25℃60min，25℃120min，结果如图11。最终确定最佳二抗孵育条件是25℃120min。此时P/N最大。

2.7.2.5HRP标记的亲和素三抗浓度的选择

HRP标记的亲和素三抗以1：500、1:1000、1:2000、1:4000、1:6000、1:8000、1:10000、1:15000、1:20000稀释，结果如图12。最终确定最佳HRP标记的亲和素三抗最佳稀释倍数为1:1000。此时P/N值较大、标准曲线R

2.7.2.6HRP标记的亲和素三抗孵育条件的选择

HRP标记的亲和素三抗作用条件分别为：37℃30min，37℃60min，25℃30min，25℃60min，结果如图13。最终确定最佳HRP标记的亲和素三抗孵育条件为25℃60min。此时P/N最大。

2.7.2.7显色条件的选择

显色作用条件分别为37℃5min，37℃10min，37℃15min，25℃5min，25℃10min，25℃15min，结果如图14。最终确定最佳显色条件为25℃15min，此时P/N最大。

2.7.3双抗体夹心ELISA方法检测限的确定

通过双抗体夹心ELISA方法对阴性样品进行检测，将OD

2.7.4双抗体夹心ELISA方法灵敏度的确定

通过双抗体夹心ELISA方法对浓度为2381、1190.5、595.25、297.63、148.81、74.41、37.20、18.60、9.30、4.65pg/mL的重组蛋白进行检测。除“0”样品外，浓度最小的样品浓度为9.30pg/mL，即为双抗体夹心ELISA方法的灵敏度。结果如图15。

2.7.5双抗体夹心ELISA方法检测范围的确定

在标准曲线成线性范围的上下限处，将重组蛋白稀释若干个浓度，预估检测下限稀释浓度为：5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200pg/mL；预估检测上限稀释浓度为：5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000pg/mL。通过双抗体夹心ELISA方法对其进行检测。根据标准曲线y＝0.0002x+0.0622，回算浓度在标示值的±25％即为可接受范围。即检测范围为200-10000pg/mL。结果如图15。

2.7.6特异性试验结果

通过双抗体夹心ELISA方法将2株单抗分别与IL-1β、IL-1α、IL-1Ra、IFN-α、SAA进行反应，结果如图16，表明2株单抗只与IL-1β发生特异性反应，而与其它细胞因子(IL-1α、IL-1Ra、IFN-α、SAA)均不发生反应。

2.7.7重复性试验结果

对建立的双抗体夹心ELISA方法进行板内重复性试验和板间重复性试验，结果见表4和表5，重复性试验的变异系数均在5％以下，表明建立的双抗体夹心ELISA法具有良好的重复性。

表4板内重复性试验结果

表5板间重复性试验结果

注：S.D.表示标准差；Mean表示算术平均值；CV表示变异系数，CV％＝S.D./Mean

2.7.8临床样品的检测

将84份马血清样品通过RD公司DY3340双抗体夹心ELISA方法和本发明建立的双抗体夹心ELISA方法进行检测。对IL-1β含量超出正常生理范围(800pg/mL)的血清样本进行统计。RD公司DY3340方法共检出2份IL-1β含量超出800pg/mL的血清样品。本发明建立的双抗体夹心ELASA方法共检出7份IL-1β含量超出800pg/mL的血清样品，结果见表6和表7。总符合率94％。

表6临床样品的本发明建立的双抗体夹心ELISA方法检测结果

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表7临床样品的RD公司的的双抗体夹心ELISA方法检测结果

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实施例2定量检测马IL-1β的双抗体夹心ELISA试剂盒的组装

所述的试剂盒包括以下组分：

1、检测抗体：抗马IL-1β蛋白单克隆抗体Eq IL-1β3G8，所述的单克隆抗体由保藏号为:CGMCC No.45601的杂交瘤细胞株分泌产生。

2、标准品：重组蛋白马IL-1β。

3、生物素标记捕获抗体：单克隆抗体EqIL-1β5G3，所述的单克隆抗体由保藏号为:CGMCCNo.45602的杂交瘤细胞株分泌产生。并且该抗体由生物素标记。

4、HRP标记的亲和素三抗：HRP标记的亲和素(streptavidin)。

5、封闭液：体积比1:1混合的商品化封闭液②与含5％v/v山羊血清的PBS缓冲液。

6、稀释液：PBSTw-酪蛋白封闭液(Macklin)

7、洗涤液：0.2g KH

8、显色液：TMB底物显色液

9、终止液：2M H