使用间充质谱系前体细胞或干细胞治疗急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的方法

技术领域

本公开涉及用于治疗或预防有需要的受试者的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的方法。

背景技术

与多种疾病(诸如病毒感染)相关的呼吸系统疾病对普通人群来说是个问题。在许多情况下，它们伴有炎症，这会加重肺部病症，并可能导致急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。

在患有急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的患者中仍然存在未得到满足的治疗需求，特别是当继发于病毒感染且需要新的治疗方案时。

发明内容

本发明人发现，在ARDS中用地塞米松进行皮质类固醇治疗不能提供免于死亡的保护，尤其是对于年龄小于65岁的患者。本发明人出乎意料地发现，这种缺陷可以通过施用MLPSC与地塞米松来弥补。这些发现表明，通过用皮质类固醇和MLPSC来治疗ARDS患者，可以改善ARDS的治疗，尤其是在生存前景方面。因此，在第一实例中，本公开涉及一种治疗或预防有需要的人受试者的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的方法，所述方法包括向所述受试者施用皮质类固醇和包含间充质谱系前体细胞或干细胞(MLPSC)的组合物。在一个实例中，受试者年龄小于65岁。

本发明人还确定了一种通过向年龄小于65岁的患有急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的受试者施用间充质谱系前体细胞或干细胞(MLPSC)来治疗这些受试者的有效方法。因此，在另一个实例中，本公开涉及一种治疗或预防有需要的人受试者的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含间充质谱系前体细胞或干细胞(MLPSC)的组合物，其中所述受试者年龄小于65岁。在一个实例中，所述方法还包括施用皮质类固醇。

本发明人的发现表明，可以选择年龄小于65岁的受试者来进行根据本文公开的方法的有效治疗。因此，在一个实例中，本公开涉及一种治疗或预防有需要的人受试者的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的方法，所述方法包括选择年龄小于65岁的患有ARDS的受试者，并且向所述受试者施用包含间充质谱系前体细胞或干细胞(MLPSC)的组合物。在一个实例中，选择年龄小于65岁且正在服用皮质类固醇的受试者。

在以上实例中，受试者年龄可以小于60岁。在另一个实例中，受试者年龄可以在18岁和65岁之间。在另一个实例中，受试者年龄可以在18岁和60岁之间。

在一个实例中，受试者的ARDS是中度或重度。

在一个实例中，在施用本文公开的细胞组合物之前，受试者正在服用皮质类固醇。在一个实例中，皮质类固醇是地塞米松。

在一个实例中，受试者依赖于呼吸机。例如，可以在施用MLPSC之前，对受试者进行机械通气。在一个实例中，受试者在治疗后脱离呼吸机。在一个实例中，受试者在治疗的60天内脱离呼吸机。

在一个实例中，ARDS由病毒感染引起。病毒感染可以由例如鼻病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)或冠状病毒引起。

在一个实例中，ARDS由冠状病毒感染引起。冠状病毒可以是例如严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)、COVID-19、229E、NL63、OC43或KHU1。在一个实例中，冠状病毒是SARS-CoV、MERS-CoV或COVID-19(SARS-CoV-2)。

在一个实例中，ARDS是由血栓形成，诸如静脉血栓形成或动脉血栓形成引起的。在另一个实例中，ARDS是由肺栓塞引起的。

在一个实例中，经治疗的受试者的死亡风险在治疗后降低。在一个实例中，经治疗的受试者的死亡风险降低介于30％和60％之间。在一个实例中，经治疗的受试者的60天存活率得以改善。

在一个实例中，改善的存活率是通气存活天数的增加。因此，在一个实例中，死亡风险的降低是在未进行机械通气辅助呼吸的受试者中确定的。

在一个实例中，根据本公开的治疗增加了脱离通气后存活的天数。在一个实例中，在治疗后第60天观察到增加。

在一个实例中，治疗改善呼吸功能。在一个实例中，改善的呼吸功能被定义为在治疗后第7、14、21和30天中的一天或多天或全部处的如柏林标准所定义的ARDS的消退和/或改善。在一个实例中，在第7天观察到改善。在一个实例中，在第14天观察到改善。例如，治疗可以改善在第14天和/或第21天处的如柏林标准所定义的呼吸功能。在一个实例中，相对于基线呼吸功能，改善的呼吸功能在第7天后仍维持。在一个实例中，相对于基线呼吸功能，改善的呼吸功能在第14天仍维持。

在一个实例中，治疗改善了临床结局。在一个实例中，基于基线以及第7、14、21和30天中的一天或多天或全部以及出院处的7分顺序量表来评估临床结局的改善。

在另一个实例中，相对于基线，治疗降低至少一种炎性生物标志物的水平，其中所述至少一种炎性生物标志物指示：

-嗜中性粒细胞和巨噬细胞流入肺部减少；

-炎性体减少；

-巨噬细胞活化和嗜中性粒细胞向肺部迁移减少；

-T细胞流入和活化减少；或者

-巨噬细胞和嗜中性粒细胞炎症的循环生物标志物减少。

在一个实例中，炎性生物标志物是以下中的一种或多种：

-CXCR3结合趋化因子，优选CXCL10和/或CXCL9；

-CCR2结合趋化因子，优选CCL2、CCL3和/或CCL7；

-IL-6；

-IL-8；

-TNF；

-IL-18；

-CCL19；

-IL-4；

-IL-13；

-GM-CSF；

-CRP；或者

-铁蛋白。

在一个实例中，治疗在施用MLPSC的3至14天内降低CRP和/或铁蛋白水平。

在一个实例中，MLPSC已经被冷冻保存和解冻。

在一个实例中，MLPSC是从中间冷冻保存的MLPSC群体培养扩增的。在另一个实例中，将MLPSC培养扩增至少约5代。在一个实例中，MLPSC表达至少13pg TNF-R1/百万个MLPSC。在一个实例中，MLPSC表达约13pg至约44pg TNF-R1/百万个MLPSC。在一个实例中，将培养扩增的MLPSC培养扩增至少20次群体倍增。在另一个实例中，将培养扩增的MLPSC培养扩增至少30次群体倍增。在一个实例中，MLPSC是间充质干细胞(MSC)。在另一个实例中，MLPSC是同种异体的。例如，MLPSC可以是同种异体的MSC。

在另一个实例中，MLPSC被修饰以携带或表达抗病毒药物或溶血栓剂。在一个实例中，抗病毒药物是瑞德西韦。在一个实例中，溶血栓剂选自由以下各项组成的组：Eminase(阿尼普酶(anistreplase))、Retavase(瑞替普酶)、Streptase(链激酶，卡比激酶(kabikinase))。

在另一个实例中，对MLPSC进行遗传修饰以表达抗病毒肽或编码其的核酸。

在一个实例中，将组合物静脉内施用。

在一个实例中，本公开的方法涵盖施用1×10

在一个实例中，受试者在施用第一剂量的7天内接受第二剂量。在一个实例中，第二剂量在第一剂量后4天施用。在一个实例中，剂量包含2×10

在另一个实例中，组合物还包含Plasma-Lyte A、二甲基亚砜(DMSO)、人血清白蛋白(HSA)。在一个实例中，组合物还包含Plasma-Lyte A(70％)、DMSO(10％)、HSA(25％)溶液，所述HSA溶液包含5％HSA和15％缓冲液。

在一个实例中，组合物包含超过6.68×10

附图说明

图1：在第60天，在所有患者中，细胞疗法提供了一定程度的免于死亡的保护。A：所有意向治疗(ITT)患者；B：所有符合方案(PP)患者。

图2：在第60天，在＜65岁的患者中，细胞疗法提供了免于死亡的保护。A：ITT患者＜65岁；B：ITT患者≥65岁。

图3：在第60天，在＜65岁的患者中，细胞疗法提供了免于死亡的保护。A：PP患者＜65岁(n＝123)；B：PP患者≥65岁(n＝94)。

图4：在第60天，在基线处接受地塞米松的＜60岁的ITT和PP患者中，细胞疗法提供免于全因死亡的保护。A：ITT患者；B：PP患者。

图5：在第60天，在对照患者中，基线处的地塞米松不提供免于死亡的保护。A：ITT患者＜65岁；B：ITT患者≥65岁。

图6：在＜65岁的患者中，当与细胞疗法组合时，在第60天，基线处的地塞米松提供免于死亡的协同保护。此外，在60天内，细胞疗法加地塞米松在死亡率降低方面优于所有其他治疗实验组。A：ITT患者；B：PP患者；C：所有服用地塞米松的＜65岁的接受治疗的患者(n＝73)。

图7：细胞疗法加地塞米松：在＜65岁的探索性群体中，呼吸功能和临床改善的分析。呼吸功能改善以在随机化后第7、14、21和30天处的如柏林标准所定义的ARDS的消退和/或改善来衡量；基于基线以及第7、14、21和30天以及出院处的7分顺序量表来评估临床改善。A：服用地塞米松的＜65岁的ITT患者的呼吸功能改善(n＝73)。B：服用地塞米松的＜65岁的ITT患者的临床改善(n＝73)。

图8：呼吸功能改善的分析：A：＜65岁的患者和B：≥65岁的患者。呼吸功能以在随机化后第7、14、21和30天处的如柏林标准所定义的ARDS的消退和/或改善来衡量。

图9：在＜65岁的预定分析中，在90天内，细胞疗法使死亡率降低48％(n＝123)。

图10：在＜65岁的患者中，在60天内，细胞疗法增加无呼吸机存活天数。A)所有接受治疗的＜65岁的患者(n＝123)。B)所有服用地塞米松的＜65岁的接受治疗的患者(n＝73)。

图11：A：基线以及第3、7和14天的CRP水平；B：基线以及第3、7和14天的铁蛋白水平；C：基线以及第3、7和14天的D-二聚体。

图12：年龄＞65岁的患者具有较高水平的基线炎症。数据是水平的倍数变化。

图13：按年龄组进行的炎性生物标志物分层分析。数据是水平自基线的倍数变化。

具体实施方式

在本说明书通篇中，除非另外明确规定或上下文另有要求，否则提及单个步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组应当被视为涵盖一个(种)和多个(种)(即，一个(种)或多个(种))那些步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组。

本领域技术人员将理解，除了具体描述的内容之外，本文所描述的公开内容易于进行变化和修改。应当理解，本公开包括所有此类变型和修改。本公开还包括本说明书中单独或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何和所有的组合或任两个或更多个所述步骤或特征。

本公开不限于本文所述具体实施方案的范围，这些具体实施方案仅旨在用于举例说明的目的。如本文所述，功能等同的产品、组合物和方法显然在本公开的范围之内。

除非另有明确说明，否则本文公开的任何实例应被视为将作必要修正应用于任何其他实例。

除非另外具体定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语应被认为与本领域(例如，在细胞培养、分子遗传学、干细胞疗法、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学、生物化学)普通技术人员通常理解的具有相同含义。

除非另有说明，否则本公开中使用的手术技术是本领域技术人员众所周知的标准程序。

获得和富集间充质谱系干细胞或前体细胞群体的方法是本领域已知的。例如，间充质谱系干细胞或前体细胞的富集群体可以通过使用流式细胞术和基于使用在间充质谱系干细胞或前体细胞上表达的细胞表面标志物的细胞分选程序来获得。

本文引用或参考的所有文件，以及本文引用的文件中所引用或参考的所有文件，连同本文提及的或通过引用并入本文的任何文件中的任何产品的任何制造商的说明、描述、产品规格和产品表，通过引用以其全文特此并入本文。

选定的定义

术语“和/或”，例如“X和/或Y”应理解为意指“X和Y”或“X或Y”，并且应该用于提供两种含义或任一含义的明确支持。

如本文所用，术语“约”，除非有相反说明，表示指定值的+/-10％，更优选+/-5％。

术语“水平”和“量”用于定义细胞制剂中特定物质的量。例如，特定浓度、重量、百分比(例如v/v％)或比率可用于定义特定物质的水平。在一个实例中，就本公开的细胞在培养条件下表达的特定标志物的量而言来表达水平。在一个实例中，表达代表细胞表面表达。在另一个实例中，就培养条件下从本文描述的细胞中释放的特定标志物的多少来表达水平。

在一个实例中，水平以pg/ml表示。在另一个实例中，水平以pg/10

在一个实例中，在培养条件下确定特定标志物的水平。术语“培养条件”用于指在培养物中生长的细胞。在一个实例中，培养条件是指活跃分裂的细胞群。在一个实例中，此类细胞可以处于指数生长期。例如，可以通过获取细胞培养基样品并测量样品中标志物的水平来确定特定标志物的水平。在另一个实例中，可以通过获取细胞样品并测量细胞裂解物中标志物的水平来确定特定标志物的水平。本领域技术人员将理解，可以通过对培养基进行取样来测量分泌的标志物，而可以通过评估细胞裂解物的样品来测量细胞表面上表达的标志物。在一个实例中，当细胞处于指数生长期时获取样品。在一个实例中，在培养至少两天后获取样品。

从冷冻保存的中间体中培养扩增的细胞表示将细胞解冻，经受低温冷冻，并在适合细胞生长的条件下进行体外培养。

在一个实例中，特定标志物(如TNF-R1)的“水平”或“量”是在细胞被冷冻保存然后接种回培养物后确定的。例如，在细胞第一次冷冻保存后确定水平。在另一个实例中，在细胞第二次冷冻保存后确定水平。例如，细胞可以从冷冻保存的中间体培养扩增，在重新接种到培养物中之前进行第二次冷冻保存，以便可以在培养条件下确定特定标志物的水平。

在整篇本说明书中，词语“包括”或变型形式诸如“包含”或“含有”应理解为暗示包括所述要素、整数或步骤、或成组的要素、整数或步骤，而不排除任何其他要素、整数或步骤、或成组的要素、整数或步骤。

如本文所用，除非上下文另有说明，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括单数和复数参考。

“分离的”或“纯化的”意指已与其自然环境的至少一些组分分离的细胞。该术语包括细胞与其自然环境的总体物理分离(例如，从供体中取出)。术语“分离的”包括通过例如解离来改变细胞与其直接相连的相邻细胞的关系。术语“分离的”并非指组织切片中的细胞。当用于指代细胞群时，术语“分离的”包括由本公开的分离细胞的增殖产生的细胞群。

术语“传代(passage、passaging)”、或“传代培养”在本公开的上下文中用于指用于在培养条件下保持细胞存活和生长持续较长时间使得细胞数量不断增加的已知细胞培养技术。传代培养细胞系的程度通常被表示为“传代次数”表示，通常用于指细胞已经传代培养的次数的数量。在一个实例中，一次传代包括除去非粘附细胞并留下粘附间充质谱系前体或干细胞。然后可以将此类间充质谱系前体细胞或干细胞从基质或烧瓶上解离(例如，通过使用蛋白酶，如胰蛋白酶或胶原酶)，可以添加介质，可以进行任选的洗涤(例如，通过离心)，并然后可以将间充质谱系前体细胞或干细胞重新铺板或重新接种到具有总表面积更大的一个或多个培养容器中。然后，间充质谱系前体细胞或干细胞可以在培养物中继续扩增。在另一个实例中，去除非粘附细胞的方法包括非酶处理(例如，用EDTA)的步骤。在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞在汇合或接近汇合时(例如，约75％至约95％汇合)传代。在一个实例中，按约10％、约15％、或约20％个细胞/ml培养基的浓度接种间充质谱系前体细胞或干细胞。

在本公开的上下文中使用的术语“培养基”或“介质”包括培养物中的细胞周围环境的组分。设想培养基有助于和/或提供适合于细胞生长的条件。介质可以是固体、液体、气体或相和材料的混合物。介质可以包括液体生长介质以及不维持细胞生长的液体介质。示例性气态介质包括在培养皿或其他固体或半固体支持物上生长的细胞所暴露的气相。

如本文所用，术语“治疗(treating、treat或treatment)”包括施用间充质谱系干细胞或前体细胞和/或其子代和/或源自其的可溶性因子的群体，从而减轻或消除至少一种ARDS症状。在一个实例中，治疗包括施用培养扩增的间充质谱系干细胞或前体细胞的群体。在一个实例中，相对于基线确定治疗应答。在一个实例中，相对于对照患者群体确定治疗应答。在一个实例中，治疗将受试者的ARDS从重度改善至中度。

在一个实例中，本公开的方法抑制受试者的疾病进展或疾病并发症。“抑制”受试者的疾病进展或疾病并发症意指预防或减少受试者的疾病进展和/或疾病并发症。因此，在一个实例中，本公开的方法抑制ARDS严重程度的进展。

如本文所用，术语“预防(prevent或preventing)”包括施用间充质谱系干细胞或前体细胞和/或其子代和/或源自其的可溶性因子的群体，从而阻止或抑制ARDS的至少一种症状的发展。

如本文所用，术语“受试者”是指人受试者。例如，受试者可以是成人。诸如“受试者”、“患者”或“个体”的术语是在上下文中可以在本公开中互换使用的术语。

本文使用的术语“血栓形成”是指血栓或血凝块的形成。在一个实例中，血栓形成是“动脉血栓形成”，其中血凝块在动脉中形成。此类血凝块对受试者来说特别危险，因为它们会阻碍血液流向主要器官如心脏或脑。在一个实例中，血栓形成是“静脉血栓形成”，其中血凝块在静脉中形成。

本文使用的术语“肺栓塞”是指通过血液从身体其他部位移动的物质在肺动脉中的阻塞。

如本文所用，术语“遗传上未经修饰的”是指未通过核酸转染而修饰的细胞。为了避免疑问，在本公开的上下文中，用编码Ang1的核酸转染的间充质谱系前体或干细胞将被认为是经遗传修饰的。

“C反应蛋白”或“CRP”是一种炎症介质，其水平在急性炎症复发的情况下升高，并在炎症消退后迅速恢复正常。可以在血浆样品中测量循环CRP水平以提供受试者中炎症的测量。

术语“总剂量”在本公开的上下文中用于指根据本公开治疗的受试者接受的细胞总数。在一个实例中，总剂量由一次细胞施用组成。在另一个实例中，总剂量由两次细胞施用组成。在另一个实例中，总剂量由三次细胞施用组成。在另一个实例中，总剂量由四次或更多次细胞施用组成。例如，总剂量可以由两次至四次细胞施用组成。

术语“临床上证明的”(独立的使用或修饰术语“有效的”)是指功效已通过临床试验证明，其中所述临床试验已经符合美国食品和药物管理局、EMEA或相应国家监管机构的批准标准。例如，临床研究可以是用于临床证明组合物的效果的足够规模的、随机的、双盲的研究。在一个实例中，临床上证明的有效量是临床试验显示满足指定终点的量。在一个实例中，终点是免于死亡的保护。

因此，术语“临床上证明的功效”和“临床上证明有效的”可以在本公开的上下文中用于指剂量、剂量方案、本文公开的治疗或方法。可以基于应答于施用本文公开的组合物的疾病过程的变化来测量功效。例如，以足以引起在反映ARDS严重程度的至少一种指标中改善、优选持续性改善的量和持续时间向受试者施用本公开的组合物。可以评估反映ARDS严重程度的各种指标，用于确定治疗的量和时间是否足够。此类指标包括例如临床上公认的疾病严重程度或症状的指标。在一个实例中，改善程度由医生确定，医生可以基于体征、症状或其他测试结果来做出该确定。在一个实例中，临床上证明有效的量改善患者的存活率。在另一个实例中，临床上证明有效的量降低受试者的死亡风险。在另一个实例中，临床上证明有效的量降低受试者的循环CRP水平。

急性呼吸窘迫综合征(ARDS)

本公开的方法涉及通过施用本文公开的组合物来治疗急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。在一个实例中，所述方法包括施用包含MLPSC的组合物。因此，在一个实例中，组合物可以包含MSC。在一个实例中，本公开的方法包括施用本文公开的细胞组合物，例如包含MLPSC的组合物，和皮质类固醇。在该实例中，可以将皮质类固醇与细胞组合物同时或依次施用。在一个实例中，在施用本文公开的细胞组合物之前，受试者先前已经服用了皮质类固醇。在该实例中，可以将皮质类固醇连同细胞组合物一起继续施用。

在一个实例中，皮质类固醇是长效或中效(半衰期＜36小时)皮质类固醇。在一个实例中，皮质类固醇是长效的(36至72小时的半衰期)。在一个实例中，皮质类固醇是地塞米松。皮质类固醇的其他实例包括泼尼松和甲基泼尼松龙。

术语“急性呼吸窘迫综合征(ARDS)”是一种呼吸衰竭的类型，其特征在于肺部的广泛炎症、氧合不良和非柔性或“僵硬”肺。所述障碍通常与毛细血管内皮损伤和弥漫性肺泡损伤有关。

在一个实例中，本公开的方法预防或治疗患有轻度ARDS的受试者。在另一个实例中，本公开的方法预防或治疗患有中度ARDS的受试者。在另一个实例中，本公开的方法预防或治疗患有重度ARDS的受试者。在另一个实例中，本公开的方法预防或治疗患有中度或重度ARDS的受试者。在一个实例中，本公开的方法治疗需要通气的患有ARDS的受试者。例如，受试者可能依赖于机械呼吸机。

在一个实例中，根据PaO2/FiO2比率来诊断ARDS的严重程度。例如，ARDS的严重程度可以诊断如下：(轻度：26.6kPa＜PaO2/FiO2≤39.9kPa；中度：13.3kPa＜PaO2/FiO2≤26.6kPa；重度：PaO2/FiO2≤13.3kPa)。在一个实例中，可以根据柏林定义(Berlindefinition)来诊断ARDS的严重程度，如下表所总结：

在另一个实例中，ARDS的严重程度可以诊断如下：轻度(PaO2/FiO2200至300mmHg)；中度(PaO2/FiO2100至200mmHg)；重度(PaO2/FiO2小于100mmHg)。

在一个实例中，患有中度至重度ARDS的受试者的循环CRP水平＞4mg/L。

在一个实例中，根据本公开的方法治疗的受试者年龄小于65岁。在另一个实例中，受试者年龄小于60岁。在一个实例中，受试者年龄至少18岁。在一个实例中，受试者年龄在18岁和65岁之间。在另一个实例中，受试者年龄在18岁和60步之间。

在另一个实例中，根据本公开的方法治疗的受试者正在服用皮质类固醇。例如，受试者可以正在服用地塞米松。在一个实例中，受试者年龄小于65岁且正在服用皮质类固醇诸如地塞米松。在一个实例中，受试者年龄小于60岁且正在服用皮质类固醇诸如地塞米松。在一个实例中，皮质类固醇是长效或中效(半衰期＜36小时)皮质类固醇。在一个实例中，皮质类固醇是长效的(36至72小时的半衰期)。在一个实例中，皮质类固醇是地塞米松。皮质类固醇的其他实例包括泼尼松和甲基泼尼松龙。

在另一个实例中，本公开的方法包括施用本文公开的细胞组合物和皮质类固醇。在该实例中，可以将皮质类固醇与细胞组合物同时或依次施用。在一个实例中，在施用本文公开的细胞组合物之前，受试者先前已经服用了皮质类固醇。在该实例中，可以将皮质类固醇连同细胞组合物一起继续施用。

在一个实例中，本公开的方法包括选择年龄小于65岁的受试者进行治疗。在另一个实例中，本公开的方法包括选择年龄小于65岁且正在服用皮质类固醇的受试者进行治疗。在另一个实例中，本公开的方法包括选择年龄小于65岁且正在服用地塞米松的受试者进行治疗。在一个实例中，基于来自治疗临床医生询问例如受试者年龄和目前药物的适当问卷或问题系列来选择受试者。

根据本公开治疗的受试者可能具有指示ARDS的症状。示例性症状可以包括疲劳、呼吸困难、呼吸短促、无法运动或运动能力下降、咳嗽带血或不带血或粘液、吸气或呼气时疼痛、喘息、胸闷、不明原因的体重减轻、肌肉骨骼疼痛、呼吸加速(呼吸急促)以及皮肤呈蓝色(发绀)。

在另一个实例中，受试者患有肺炎。

在另一个实例中，受试者患有继发于病毒感染的ARDS。在一个实例中，受试者的ARDS继发于鼻病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)或冠状病毒的感染。在一个实例中，受试者的ARDS继发于冠状病毒的感染。例如，受试者的ARDS可以继发于SARS-CoV、MERS-CoV或COVID-19的感染。

在一个实例中，受试者患有心肌炎、心包炎或瓣膜炎中的一种或多种。在一个实例中，受试者患有病毒引起的心肌炎、心包炎或瓣膜炎。例如，受试者可以患有病毒性心肌炎。

在一个实例中，ARDS由病毒感染引起。例如，ARDS可以由鼻病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)或冠状病毒引起。在一个实例中，ARDS可以由冠状病毒引起。例如，冠状病毒可以是冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)或COVID-19。在一个实例中，ARDS由艾巴氏病毒(Epstein-Barr virus，EBV)或单纯疱疹病毒(HSV)引起。

在另一个实例中，ARDS是由血栓形成引起的。在另一个实例中，ARDS是由栓塞引起的。在一个实例中，ARDS是由肺栓塞引起的。

在另一个实例中，ARDS继发于噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH)。HLH是危及生命的疾病，其特征是淋巴细胞和巨噬细胞过度炎症。HLH可以由病毒感染(如EBV、CMV、HHV)触发。因此，在一个实例中，HLH是继发性或获得性HLH。例如，HLH可以继发于病毒感染并导致受试者中ARDS的发展。

在一个实例中，治疗保护免于死亡或赋予改善的存活率。在一个实例中，在治疗后60天确定免于死亡的保护。在另一个实例中，在治疗后50至70天确定免于死亡的保护。例如，经治疗的受试者的死亡风险在治疗后可以降低。在一个实例中，经治疗的受试者的死亡风险降低介于30％和60％之间。在一个实例中，经治疗的受试者的死亡风险降低介于40％和50％之间。在一个实例中，经治疗的受试者的死亡风险降低至少30％。在一个实例中，经治疗的受试者的死亡风险降低至少40％。

在一个实例中，根据本公开的方法的治疗降低受试者血栓形成的风险。在一个实例中，相对于未接受治疗的受试者，受试者的风险降低。在一个实例中，治疗降低血栓形成是动脉血栓形成的风险。因此，在一个实例中，治疗降低患有ARDS的受试者心脏病发作或中风的风险。

在一个实例中，治疗使受试者的CRP水平降低。在一个实例中，与基线相比，治疗使CRP降低至少100mg/dl。在另一个实例中，与基线相比，治疗使CRP降低至少150mg/dl。

在一个实例中，治疗使受试者的循环CRP水平降低至80mg/dl或更低。在一个实例中，治疗使受试者的循环CRP水平降低至60mg/dl或更低。在另一个实例中，治疗使受试者的循环CRP水平降低至50mg/d1或更低。在另一个实例中，治疗使受试者的循环CRP水平降低至30mg/dl或更低。在另一个实例中，治疗使受试者的循环CRP水平降低至40mg/dl或更低。在另一个实例中，治疗使受试者的循环CRP水平降低至20mg/dl或更低。在另一个实例中，治疗使受试者的循环CRP水平降低至10mg/dl或更低。在另一个实例中，治疗使受试者的循环CRP水平降低至5mg/dl或更低。在另一个实例中，治疗使受试者的循环CRP水平降低至3mg/dl或更低。

在另一个实例中，治疗使CRP降低至0.5mg/d1和30mg/d1之间。在另一个实例中，治疗使CRP降低至0.5mg/dl和10mg/dl之间。在一个实例中，治疗在施用MLPSC的3至14天内降低CRP和/或铁蛋白水平。

在另一个实例中，本公开涵盖选择患有ARDS的受试者进行治疗。在一个实例中，受试者患有中度或重度ARDS。在一个实例中，所述方法包括选择小于65岁的患有ARDS的受试者。在一个实例中，所述方法包括选择小于65岁且正在服用皮质类固醇的受试者。在一个实例中，根据本文公开的方法治疗所选择的受试者。

炎性生物标志物

在一个实例中，治疗降低受试者的炎性生物标志物水平。在一个实例中，炎性生物标志物的减少指示嗜中性粒细胞和巨噬细胞流入肺部减少，例如，CCR2结合趋化因子，如CCL2、CCL3和CCL7。在一个实例中，受试者的CCL2水平降低。在另一个实例中，受试者的CCL3水平降低。在另一个实例中，受试者的CCL7水平降低。在另一个实例中，炎性生物标志物是CXCR3结合趋化因子，如CXCL10和CXCL9。在一个实例中，受试者的CXCL10水平降低。在另一个实例中，受试者的CXCL9水平降低。

在另一个实例中，炎性生物标志物的减少指示炎性体减少。炎性体是刺激诱导的细胞质多聚蛋白复合物。在另一个实例中，炎性生物标志物的减少指示巨噬细胞活化减少和嗜中性粒细胞归巢至肺。当减少时，指示炎性体减少和巨噬细胞活化/嗜中性粒细胞归巢至肺减少的炎性生物标志物的实例是IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子(TNF)和白介素-18(IL-18)。在一个实例中，受试者的IL-6水平降低。在另一个实例中，受试者的IL-8水平降低。在另一个实例中，受试者的TNF水平降低。在另一个实例中，受试者的IL-18水平降低。

在另一个实例中，炎性生物标志物的减少指示T细胞流入和活化减少。炎性生物标志物的实例指示，当C-C基序趋化因子配体19(CCL19)、白介素-4(IL-4)、白介素-13(IL-13)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)减少时，T细胞流入和活化减少。在一个实例中，受试者的CCL19水平降低。在另一个实例中，受试者的IL-4水平降低。在另一个实例中，受试者的IL-13水平降低。在另一个实例中，受试者的GM-CSF水平降低。

在另一个实例中，炎性生物标志物的减少指示巨噬细胞和嗜中性粒细胞炎症的循环生物标志物，例如，CRP、铁蛋白、或D--二聚体的减少。在一个实例中，减少的循环生物标志物是“C反应蛋白”或”CRP“。CRP是一种炎症介质，其水平在急性炎症复发的情况下升高，并在炎症消退后迅速恢复正常。可以在血浆样品中测量循环CRP水平以提供受试者中炎症的测量。

在一个实例中，治疗使受试者的CRP水平降低。在一个实例中，与基线相比，治疗使CRP降低至少100mg/dl。在另一个实例中，与基线相比，治疗使CRP降低至少150mg/dl。在一个实例中，治疗使受试者的CRP水平降低约0.1倍。在另一个实例中，治疗使受试者的CRP水平降低约0.2倍。在另一个实例中，治疗使受试者的CRP水平降低约0.3倍。在另一个实例中，治疗使受试者的CRP水平降低约0.4倍。在另一个实例中，治疗使受试者的CRP水平降低约0.5倍。在另一个实例中，治疗使受试者的CRP水平降低0.6倍。在这些实例中，治疗使受试者的CRP水平降低相对于受试者的基线CRP水平的倍数变化。

在另一个实例中，减少的循环生物标志物是铁蛋白。铁蛋白是含有铁的血液蛋白。可以在血液样品中测量铁蛋白水平，以提供对受试者的铁水平的测量。在一个实例中，治疗使受试者的铁蛋白水平降低。在一个实例中，治疗使受试者的铁蛋白水平降低约0.1倍。在另一个实例中，治疗使受试者的铁蛋白水平降低约0.2倍。在另一个实例中，治疗使受试者的铁蛋白水平降低约0.3倍。在另一个实例中，治疗使受试者的铁蛋白水平降低约0.4倍。在另一个实例中，治疗使受试者的铁蛋白水平降低约0.5倍。在这些实例中，治疗使受试者的铁蛋白水平降低相对于受试者的基线铁蛋白水平的倍数变化。

测定本文公开的炎性生物标志物水平的方法是本领域已知的。在一个实例中，在从患者或受试者(例如，血液样品、血浆样品、或血清样品)获得的一种或多种样品中确定特定标志物的水平。例如，在血浆样品中确定根据本公开的炎性生物标志物的水平。在另一个实例中，在血清样品中确定炎性生物标志物的水平。

在一个实例中，通过测量从受试者获得的样品中的蛋白质表达水平来确定炎性生物标志物的水平。例如，可以使用基于抗体的免疫测定(例如酶联免疫吸附(ELISA))测定，多重免疫测定(例如，Luminex测定)(参见，例如，Cook等人.Methods.158：27-32.2019)或基于荧光珠的免疫测定在样品中测量炎性生物标志物水平。在这些实例中，炎性生物标志物的水平以pg/mL表示。在另一个实例中，炎性生物标志物的水平表示为相对于适当对照的倍数变化。在另一个实例中，通过测量从受试者获得的样品中的基因表达水平来确定炎性生物标志物的水平。例如，可以使用基于分子的测定(如基于定性聚合酶链式反应(PCR)的测定)或多重PCR测定(如，Luminex测定)(参见，例如，Cook等人.Methods.158∶27-32.2019)在样品中测量炎性生物标志物水平。在一个实例中，炎性生物标志物的基因表达水平表示为相对于适当对照的倍数变化。例如，倍数变化被计算为log2(倍数变化)。

在实例中，在单个样品中测量多种炎性生物标志物的水平。在另一个实例中，在单独的样品中测量多种炎性生物标志物的水平。在一个实例中，在用MLPSC治疗之前，测量生物标志物的水平。在另一个实例中，在用MLPSC治疗之后，测量生物标志物的水平。在另一个实例中，在基线处测量生物标志物的水平，并随时间监测以确定受试者是否需要更高剂量或更长时间的给药。

可以比较样品之间的炎性生物标志物的水平以确定炎性生物标志物的水平是否降低。在这些实例中，可以评估样品以确定炎症是否已经减轻并且炎症的减轻是否是持久性的。在实例中，基于在施用细胞疗法后至少两个样品中观察到的炎症自基线的减少来确定炎症的持久性减少。

间充质谱系前体细胞

如本文所用，术语“间充质谱系前体或干细胞(MLPSC)”是指未分化的多能细胞，其具有自我更新的能力，同时保持多能性，并且具有分化成间充质来源的许多细胞类型(例如，成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、基质细胞、成纤维细胞和肌腱)或非中胚层来源的细胞类型(例如，肝细胞、神经细胞和上皮细胞)的能力。为了避免疑问，“间充质谱系前体细胞”是指能够分化成间充质细胞的细胞，例如骨、软骨、肌肉和脂肪细胞以及纤维结缔组织。

术语“间充质谱系前体细胞或干细胞”包括亲本细胞及其未分化的子代。术语还包括间充质前体细胞、多能基质细胞、间充质干细胞(MSC)、血管周间充质前体细胞及其未分化的子代。

间充质谱系前体细胞或干细胞可以是自体的、同种异体的、异种的、同基因或等基因。自体细胞是从将被重新植入的相同体中分离出来的。同种异体的细胞是从相同物种的供体中分离出来的。异种的细胞是从另一个物种的供体中分离出来的。同基因或等基因细胞是从基因相同的生物体中分离出来的，例如双胞胎、克隆或高度近交的研究动物模型。

在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞是同种异体的。在一个实例中，将同种异体的间充质谱系前体细胞或干细胞进行培养扩增和冷冻保存。

间充质谱系前体细胞或干细胞主要存在于骨髓中，但也显示存在于多种宿主组织中，包括例如脐带血和脐带、成人外周血、脂肪组织、骨小梁和牙髓。它们还存在于皮肤、脾、胰腺、脑、肾、肝、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、淋巴结、胸腺、韧带、肌腱、骨骼肌、真皮和骨膜中；并且能够分化成种系，例如中胚层和/或内胚层和/或外胚层。因此，间充质谱系前体细胞或干细胞能够分化成大量细胞类型，包括但不限于脂肪、骨、软骨、弹性软骨、肌肉和纤维结缔组织。这些细胞进入的特定谱系定型和分化途径取决于来自机械影响和/或内源生物活性因子(例如生长因子、细胞因子)和/或由宿主组织建立的局部微环境条件的各种影响。

术语“富集的”、“富集”或其变体在本文中用于描述如下细胞群，其中当与未经处理的细胞群(例如，天然环境中的细胞)相比时，一种特定细胞类型的比例或多种特定细胞类型的比例增加。在一个实例中，富含间充质谱系前体细胞或干细胞的群体包含至少约0.1％或0.5％或1％或2％或5％或10％或15％或20％或25％或30％或50％或75％间充质谱系前体细胞或干细胞。在这方面，术语“富含间充质谱系前体细胞或干细胞的细胞群”将被认为是为术语“包含X％间充质谱系前体细胞或干细胞的细胞群”提供明确支持，其中X％是如本文所述的百分比。在一些实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞可以形成克隆形成集落，例如，CFU-F(成纤维细胞)，或其子集(例如，50％或60％或70％或70％或90％或95％)可以具有这种活性。

在本公开的实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞是间充质干细胞(MSC)。MSC可以是均质组合物或可以是富含在MSC中的混合细胞群。可以通过培养粘附的骨髓或骨膜细胞来获得均质MSC组合物，并且可以通过用独特的单克隆抗体来鉴定的特定细胞表面标志物来鉴定MSC。用于获得在MSC中富集的细胞群体的方法描述于例如，美国专利号5,486,359中。MSC的可替代性来源包括但不限于血液、皮肤、脐带血、肌肉、脂肪、骨骼和软骨膜。在一个实例中，MSC是同种异体的。在一个实例中，将MSC冷冻保存。在一个实例中，将MSC进行培养扩增并冷冻保存。

在另一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞是CD29+、CD54+、CD73+、CD90+、CD102+、CD105+、CD106+、CD166+、MHC1+MSC。

在一个实例中，将间充质谱系前体细胞或干细胞从表达标志物(包括CD73、CD90、CD105和CD166)且缺乏造血细胞表面抗原(如CD45和CD31)表达的MSC群体进行培养扩增。例如，可以将间充质谱系前体细胞或干细胞从MSC群体(CD73+、CD90+、CD105+、CD166+、CD45-和CD31-)进行培养扩增。在一个实例中，MSC的群体的进一步的特征在于低水平的主要组织相容性复合物(MHC)I类。在另一个实例中，MSC对主要组织相容性复合物II类分子呈阴性，并且对共刺激分子CD40、CD80和CD86呈阴性。在一个实例中，培养扩增包括5代。

在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞是CD105+、CD156+和CD45-。在另一个实例中，间充质谱系或前体细胞还表达TNFR1，并抑制活化的淋巴细胞上的IL-2Rα表达。

可以将分离的或富集的间充质谱系前体细胞或干细胞通过培养在体外扩增。可以将分离的或富集的间充质谱系前体细胞或干细胞冷冻保存、解冻，并随后通过培养进行体外扩增。

在一个实例中，将分离的或富集的间充质谱系前体细胞或干细胞以50,000个活细胞/cm

如本领域技术人员将理解的，培养的间充质谱系前体细胞或干细胞在表型上不同于体内细胞。例如，在一个实施方案中，它们表达以下标志物中的一种或多种：CD44、NG2、DC146和CD140b。培养的间充质谱系前体细胞或干细胞在生物学上也与体内细胞不同，与体内大部分非循环(静止)细胞相比，具有更高的增殖率。

在一个实例中，细胞群是从包含处于可选择形式的STRO-1+细胞的细胞制剂中富集的。在这点上，术语“可选择的形式”应理解为意指细胞表达允许选择STRO-1+细胞的标志物(例如，细胞表面标志物)。标志物可以是STRO-1，但不一定是。例如，如本文所述和/或本文所例证的，表达STRO-2和/或STRO-3(TNAP)和/或STRO-4和/或VCAM-1和/或CD146和/或3G5的细胞(例如，间充质前体细胞)也表达STRO-1(并且可以是STRO-1bright)。因此，细胞是STRO-1+的指示并不意味着细胞仅通过STRO-1表达来选择。在一个实例中，基于至少STRO-3表达来选择细胞，例如，它们是STRO-3+(TNAP+)。

提及细胞或其群体的选择并不一定需要从特定的组织来源中进行选择。如本文所述，STRO-1+细胞可以选自或分离自或富集自多种来源。也就是说，在一些实例中，这些术语为从包含STRO-1+细胞(例如，间充质前体细胞)的任何组织或血管化的组织或包含周细胞(例如，STRO-1+周细胞)的组织或本文所列举的任何一种或多种一种或多种组织进行选择提供了支持。

在一个实例中，本公开中使用的细胞表达一种或多种单个地或共同地选自下组的标志物，该组由以下组成：TNAP+、VCAM-1+、THY-1+、STRO-2+、STRO-4+(HSP-90β)、CD45+、CD146+、3G5+或其任何组合。

“单个地”意味着本公开单独涵盖所列举的标志物或标志物组，并且尽管本文中可能未单独列出单个的标志物或标志物组，但所附权利要求可以彼此单独且可分割地定义这样的标志物或标志物组。

“共同地”意味着本公开涵盖所列举的标志物或标志物组的任何数量或组合，并且尽管本文可能没有具体列出此类标志或标志组的数量或组合，但所附权利要求可以将此类组合或子组合与标志物或标志物组的任何其他组合单独地或分开地定义。

如本文所用，术语“TNAP”旨在涵盖组织非特异性碱性磷酸酶的所有同种型。例如，术语涵盖肝同种型(LAP)、骨同种型(BAP)和肾同种型(KAP)。在一个实例中，TNAP是BAP。在一个实例中，如本文所用的TNAP是指可以结合由杂交瘤细胞系产生的STRO-3抗体的分子，所述杂交瘤细胞系在根据布达佩斯条约的规定下、于2005年12月19日以保藏登录号PTA-7282保藏于ATCC。

此外，在一个实例中，STRO-1+细胞能够产生克隆源性CFU-F。

在一个实例中，很大比例的STRO-1+细胞能够分化成至少两种不同的种系。STRO-1+细胞可以定型的谱系的非限制性实例包括骨前体细胞；肝细胞祖细胞，它对胆管上皮细胞和肝细胞具有多能性；神经限制细胞，它可以产生神经胶质细胞前体，该神经胶质细胞前体进展为少突胶质细胞和星形胶质细胞；神经元前体，它进展为神经元；心肌和心肌细胞的前体，葡萄糖反应性胰岛素分泌性胰腺β细胞系。其他谱系包括但不限于成牙质细胞、牙质生成细胞和软骨细胞，以及以下的前体细胞：视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞、皮肤细胞如角质形成细胞、树突细胞、毛囊细胞、肾管上皮细胞、平滑肌和骨骼肌细胞、睾丸祖细胞、血管内皮细胞、肌腱、韧带、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、血管、上皮、神经胶质、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞获得自单个供体、或多种供体，其中随后汇集这些供体样品或间充质谱系前体细胞或干细胞，并然后进行培养扩增。

还可以将本公开涵盖的间充质谱系前体细胞或干细胞在向受试者施用之前进行冷冻保存。在一个实例中，将间充质谱系前体细胞或干细胞在向受试者施用之前进行培养扩增和冷冻保存。

在一个实例中，本公开涵盖间充质谱系前体细胞或干细胞及其子代、源自其的可溶性因子和/或从其分离的细胞外囊泡。在另一个实例中，本公开涵盖间充质谱系前体细胞或干细胞以及从其分离的细胞外囊泡。例如，可以持续一段时间并且在适合细胞外囊泡分泌到细胞培养基中的条件下，将本公开的间充质前体谱系或干细胞进行培养扩增。随后可以从培养基中获得分泌的细胞外囊泡用于在疗法中使用。

如本文所用，术语“细胞外囊泡”是指从细胞天然释放的脂质颗粒，并且其尺寸范围为约30nm至大到10微米，但通常它们的尺寸小于200nm。它们可以包含来自释放细胞(例如，间充质干细胞；STRO-1

如本文所用，术语“外来体”是指尺寸通常在约30nm至约150nm范围内，并且起源于哺乳动物细胞的内体区室的一类细胞外囊泡，它们从所述内体区室运输至细胞膜并释放。它们可能包含核酸(例如，RNA；微小RNA)、蛋白质、脂质和代谢物，并通过从一个细胞分泌并被其他细胞吸收以递送其物质而在细胞间通讯中发挥作用。

细胞的培养扩增

在一个实例中，将间充质谱系前体细胞或干细胞培养扩增。“培养扩增的”间充质谱系前体细胞或干细胞介质与新鲜分离的细胞的区别在于，它们已在细胞培养基中培养并传代(即传代培养)。在一个实例中，将培养扩增间充质谱系前体细胞或干细胞培养扩增约4-10代。在一个实例中，将间充质谱系前体细胞或干细胞培养扩增至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10代。例如，可以将间充质谱系前体细胞或干细胞培养扩增至少5代。在一个实例中，可以将间充质谱系前体细胞或干细胞培养扩增至少5-10代。在一个实例中，可以将间充质谱系前体细胞或干细胞培养扩增至少5-8代。在一个实例中，可以将间充质谱系前体细胞或干细胞培养扩增至少5-7代。在一个实例中，可以将间充质谱系前体细胞或干细胞培养扩增超过10代。在另一个实例中，可以将间充质谱系前体细胞或干细胞培养扩增超过7代。在这些实例中，可以在冷冻保存之前将干细胞培养扩增，以提供中间冷冻保存的MLPSC群体。在一个实例中，本公开的组合物由中间冷冻保存的MLPSC群体制备。例如，如下文进一步讨论的，可以在施用之前进一步培养扩增中间冷冻保存的MLPSC群体。因此，在一个实例中，将间充质谱系前体细胞或干细胞进行培养扩增和冷冻保存。在这些实例的实施方案中，间充质谱系前体细胞或干细胞可以从单个供体或多个供体获得，其中随后汇集这些供体样品或间充质谱系前体或干细胞，并然后进行培养扩增。在一个实例中，培养扩增过程包括：

-i.通过传代扩增来扩增活细胞的数量，以提供至少约10亿个活细胞的制剂，其中所述传代扩增包括建立分离的间充质谱系前体细胞或干细胞的原代培养物，并然后连续建立从先前的培养物中分离的间充质谱系前体细胞或干细胞的第一非原代(P1)培养物；

-ii.通过传代扩增将分离的间充质谱系前体细胞或干细胞的P1培养物扩增为间充质谱系前体细胞或干细胞的第二非原代(P2)培养物；并且

-iii.制备并冷冻保存从间充质谱系前体细胞或干细胞的P2培养物获得的过程中的中间间充质谱系前体细胞或干细胞制剂；并且

-iv.将冷冻保存的过程中的中间间充质谱系前体细胞或干细胞制剂解冻，并通过传代扩增来对过程中的中间间充质谱系前体细胞或干细胞制剂进行扩增。

在一个实例中，扩增的间充质谱系前体或干细胞制剂具有抗原属性和活性属性，包含：

-i.少于约0.75％CD45+细胞；

-ii.至少约95％CD105+细胞；

-iii.至少约95％CD166+细胞。

在一个实例中，相对于对照，扩增的间充质谱系前体或干细胞制剂能够将由CD3/CD28活化的PBMC的IL2Ra表达抑制至少约30％。

在一个实例中，将培养扩增的间充质谱系前体细胞或干细胞培养扩增约4-10代，其中在至少2或3代之后在进一步培养扩增之前将所述间充质谱系前体细胞或干细胞冷冻保存。在一个实例中，将间充质谱系前体细胞或干细胞培养扩增至少1、至少2、至少3、至少4、至少5代，冷冻保存并然后在施用或进一步冷冻保存之前进一步培养扩增至少1、至少2、至少3、至少4、至少5代。

在一个实例中，本公开的组合物中大多数间充质谱系前体细胞或干细胞具有大约相同的代数(即，它们彼此在约1或约2或约3或约4个细胞倍增之内)。在一个实例中，本发明组合物中细胞倍增的平均次数为约20至约25次倍增。在一个实例中，本发明的组合物中细胞倍增的平均次数为来原代培养物的约9至约13(例如，约11或约11.2)次倍增，加上约1、约2、约3或约4次倍增/代(例如，约2.5次倍增/代)。当分别由约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9和约10代产生时，本发明的组合物中示例性平均细胞倍增为约13.5、约16、约18.5、约21、约23.5、约26、约28.5、约31、约33.5和约36中的任一者。

可以使用本领域已知的任何设备和细胞处理方法进行间充质谱系前体或干细胞分离和离体扩增的过程。本公开的各种培养扩增实施方案采用需要操纵细胞的步骤，例如，接种、补料、解离粘附培养物或洗涤的步骤。操纵细胞的任何步骤都有可能损伤细胞。尽管间充质谱系前体细胞或干细胞在制备过程中通常可以承受一定量的损伤，但优选通过充分执行一个或多个给定步骤同时最小化对细胞的损伤的处理程序和/或设备来操纵细胞。

在一个实例中，在器具中洗涤间充质谱系前体细胞或干细胞，所述器具包括细胞源袋、洗涤溶液袋、再循环洗涤袋、具有入口和出口的旋转膜过滤器、滤液袋、混合区、用于经洗涤的细胞的最终产品袋，以及适当的管道，例如，如US 6,251,295中所述，将其通过应用并入本文中。

在一个实例中，根据本公开的间充质谱系前体或干细胞组合物就CD105阳性和CD166阳性和CD45阴性而言是95％均质的。在一个实例中，这种同质性通过离体扩增；即，通过多种群体倍增而持续。在一个实例中，组合物包含至少一个治疗剂量的间充质谱系前体细胞或干细胞，并且所述间充质谱系前体细胞或干细胞包含少于约1.25％CD45+细胞、至少约95％CD105+细胞和至少约95％CD166+细胞。在一个实例中，该同质性在低温储存和解冻后持续存在，其中细胞通常也具有约70％或更高的存活力。

在一个实例中，本公开的组合物包含表达相当水平的TNF-R1的间充质谱系前体细胞或干细胞，例如超过13pg TNF-R1/百万个间充质谱系前体细胞或干细胞.在一个实例中，该表型在离体扩增和低温储存的过程中是稳定的。在一个实例中，在约13至约179pg(例如，约13pg至约44pg)/百万个间充质谱系前体细胞或干细胞范围内的TNF-R1表达水平与所期望的治疗潜力相关，所述治疗潜力还贯穿离体扩增和冷冻保存持续存在。

在一个实例中，培养扩增的间充质谱系前体细胞或干细胞以至少110pg/ml的量表达肿瘤坏死因子受体1(TNF-R1)。例如，间充质谱系前体细胞或干细胞能够以至少150pg/ml、或至少200pg/ml、或至少250pg/ml、或至少300pg/ml、或至少320pg/ml、或至少330pg/ml、或至少340pg/ml、或至少350pg/ml的量表达TNF-R1。

在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞以至少13pg/10

在另一个实例中，本文公开的间充质谱系前体细胞或干细胞抑制T细胞上的IL-2Rα表达。在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞能够将IL-2Rα表达抑制至少约30％、替代地至少约35％、替代地至少约40％、替代地至少约45％、替代地至少约50％、替代地至少约55％、替代地至少约60。

在一个实例中，本公开的组合物包含至少一个治疗剂量的间充质谱系前体细胞或干细胞，这些细胞例如可以包含至少约10000万个细胞或约12500万个细胞。

细胞的修饰

在一个实例中，本公开的间充质谱系前体细胞或干细胞能够以这样的方式发生改变：在施用后，细胞的裂解被抑制。抗原的改变可以诱导免疫无反应性或耐受性，从而阻止免疫应答效应阶段(例如，细胞毒性T细胞的产生、抗体产生等)的诱导，而免疫反应阶段最终导致正常免疫应答中对外来细胞的排斥。可以改变以实现该目标的抗原包括例如，MHC I类抗原、MHC II类抗原、LFA-3和ICAM-1。

还可以对间充质谱系前体细胞或干细胞进行遗传修饰以表达对于横纹骨骼肌细胞的分化和/或维持重要的蛋白质。示例性蛋白质包括生长因子(TGF-β、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、FGF)、生肌因子(例如，myoD、肌细胞生成素、生肌因子5(Myf5)、生肌调节因子(MRF))、转录因子(例如，GATA-4)、细胞因子(例如，心肌素-1)、神经调节蛋白家族成员(例如，神经调节蛋白1、2和3)和同源盒基因(例如，Csx、tinman和NKx家族)。

还可以修饰本公开间充质谱系前体细胞或干细胞以携带或表达抗病毒药剂或溶血栓剂。在一个实例中，药剂是抗病毒药物。在一个实例中，药剂是抗流感药物。在一个实例中，药剂是抗SARS-CoV(例如，SARS-Cov2)。示例性药剂是瑞德西韦。在一个实例中，药剂是溶血栓药物。溶血栓剂的实例包括Eminase(阿尼普酶)、Retavase(瑞替普酶)、Streptase(链激酶、卡比激酶)。在一个实例中，溶血栓剂是肝素。

可以修饰本公开的间充质前体细胞或干细胞以携带抗病毒或溶血栓剂，通过将细胞与药剂一起培养一段时间并且在足以允许所述药剂被细胞吸收的条件下进行培养。在一个实例中，将抗病毒或溶血栓剂添加至本文公开的间充质谱系前体细胞或干细胞的培养基中。例如，可以将本文公开的间充质谱系前体细胞或干细胞在包含抗病毒或溶血栓剂的培养基中进行培养扩增。

在另一个实例中，抗病毒或溶血栓剂是肽。在一个实例中，对间充质谱系前体细胞或干细胞进行遗传修饰以表达抗病毒或溶血栓肽或编码其的核酸。在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞通过在体外与病毒载体接触而被修饰。例如，可以将病毒添加至细胞培养基中。还可以采用遗传修饰的非病毒方法。实例包括质粒转移和通过使用整合酶或转座酶技术、脂质体或蛋白质转导结构域介导的递送以及物理方法(如电穿孔)进行靶向基因整合的应用。

遗传修饰的效率很少是100％，并且通常需要富集已被成功修饰的细胞群。在一个实例中，可以通过利用新基因型的功能特征来富集经修饰的细胞。富集经修饰的细胞的一个示例性方法是使用可选择或可筛选的标志物基因进行的正向选择。“标志物基因”是指赋予表达标志物基因的细胞不同表型，并因此允许此类经转化的细胞与不具有标志物的细胞区分开的基因。基于对选择剂(例如，抗生素)的耐药性，可选择的标志物基因赋予可供“选择”的性状。可筛选的标志物基因(或报告基因)赋予可以通过观察或测试，即，通过“筛选”(例如，未经转化的细胞中不存在的β-葡萄糖醛酸酶、荧光素酶、GFP或其他酶活性)来鉴定的性状。在一个实例中，基于对药物(如新霉素)的抗性来选择经遗传修饰的间充质谱系前体细胞或干细胞，或基于lacZ表达来进行比色选择。

本公开的组合物

在本公开的一个实例中，将间充质谱系前体细胞或干细胞和/或其子代和/或源自其的可溶性因子以组合物的形式施用。在一个实例中，这样的组合物包含药学上可接受的载剂和/或赋形剂。因此，在一个实例中，本公开的组合物可以包含培养扩增的间充质谱系前体细胞或干细胞。

术语“载剂”和“赋形剂”是指本领域常规使用以促进活性化合物的储存、施用和/或生物活性的物质的组合物(参见，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences,第16版，Mac Publishing Company(1980)。载剂还可以减少活性化合物的任何不希望的副作用。合适的载剂例如是稳定的，例如不能与载剂中的其他成分反应。在一个实例中，载剂在用于治疗而采用的剂量和浓度下不会对接受者产生显著的局部或全身副作用。

用于本公开的合适载剂包括常规使用的那些，例如水、盐水、水性右旋糖、乳糖、林格氏溶液、缓冲溶液、透明质酸和二醇是示例性液体载剂，特别是(当等渗时)用于溶液。合适的药物载剂和赋形剂包括淀粉、纤维素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、甘油、丙二醇、水、乙醇等。

在另一个实例中，载剂是介质组合物，例如细胞在其中生长或悬浮。例如，这样的介质组合物不会在其所施用的受试者中引起任何副作用。

示例性载剂和赋形剂不会不利地影响细胞的存活力和/或细胞减少、预防或延迟代谢综合征和/或肥胖的能力。

在一个实例中，载剂或赋形剂提供缓冲活性以将细胞和/或可溶性因子维持在合适的pH，从而发挥生物活性，例如，载剂或赋形剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。PBS代表有吸引力的载剂或赋形剂，因为它最低限度地与细胞和因子相互作用，并且允许所述细胞和因子快速释放，在这种情况下，可以将本公开的组合物生产为液体以直接应用于血流或进入组织或组织周围或邻近的区域，例如通过注射。

还可以将间充质谱系前体细胞或干细胞和/或其子代和/或源自其的可溶性因子掺入或嵌入到与受体相容的支架内，并且所述支架降解成对受体无害的产物。这些支架为有待移植到受体受试者体内的细胞提供支持和保护。天然的和/或合成的可生物降解支架是此类支架的实例。

多种不同的支架可以成功地用于本公开的实践中。示例性支架包括但不限于生物的、可降解支架。天然的可生物降解支架包括胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白支架。用于细胞移植支架的合适的合成材料应该能够支持广泛的细胞生长和细胞功能。此类支架也可以是可再吸收的。合适的支架包括聚乙醇酸支架(例如，如Vacanti等人，J.Ped.Surg.23：3-91988；Cima等人，Biotechno1.Bioeng.38：1451991；Vacanti等人，Plast.Reconstr.Surg.88：753-91991所述)；或合成聚合物，例如聚酸酐、聚原酸酯和聚乳酸。

在另一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞和/或其子代和/或源自其的可溶性因子可以在凝胶支架(如来自Upjohn Company的Gelfoam)中施用。

可以将本文所述的组合物单独施用或作为与其他细胞的混合物施用。可以将不同类型的细胞在施用前立即或不久与本公开的组合物混合，或可以将它们在施用前一起共培养一段时间。

在一个实例中，组合物包含有效量或治疗上有效量或预防上有效量的间充质谱系前体细胞或干细胞和/或其子代和/或源自其的可溶性因子。例如，组合物包含约1×10

在一个实例中，施用50×10

在一个实例中，组合物包含大于5.00×10

在一个实例中，本公开的方法涵盖施用6亿个细胞的总剂量。例如，根据本公开治疗的受试者可以接受多个剂量的上述组合物，只要细胞的总剂量不超过6亿个细胞即可。例如，受试者可以接受3个剂量的2亿个细胞。在一个实例中，细胞的总剂量为5亿个细胞。在一个实例中，细胞的总剂量为4亿个细胞。例如，受试者可以接受4个剂量的1亿个细胞。在一个实例中，受试者在基线处接受1个剂量的1亿个细胞，然后在三个月内施用三个剂量的1亿个细胞，每月施用一个剂量。在一个实例中，剂量为2×10

在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞包含组合物细胞群体的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％。

可以将本公开的组合物冷冻保存。可以使用本领域已知的慢速冷却方法或“快速”冷冻方案来进行间充质谱系前体细胞或干细胞的冷冻保存。优选地，与未冷冻的细胞相比，冷冻保存的方法维持冷冻保存的细胞的相似的表型、细胞表面标志物和生长速率。

冷冻保存的组合物可以包含冷冻保存溶液。冷冻保存溶液的pH通常为6.5至8，优选7.4。

冷冻保存溶液可以包含无菌、无热原等渗溶液，例如PlasmaLyte A

冷冻保存溶液可以包含Profreeze

为促进冷冻，通常将冷冻保护剂例如二甲基亚砜(DMSO)添加至冷冻保存溶液中。理想情况下，冷冻保护剂应该对细胞和患者无毒、无抗原性、化学惰性，在解冻后提供高存活率并且无需洗涤即可移植。然而，最常用的冷冻保护剂DMSO显示出一些细胞毒性。可以将羟乙基淀粉(HES)用作替代物或与DMSO组合以降低冷冻保存溶液的细胞毒性。

冷冻保存溶液可以包含DMSO、羟乙基淀粉、人血清组分和其他蛋白质填充剂的一种或多种。在一个实例中，冷冻保存的溶液包含约5％人血清白蛋白(HSA)和约10％DMSO。冷冻保存溶液可以还包含甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和海藻糖中的一种或多种。

在一个实施方案中，将细胞悬浮于42.5％Profreeze

可以将冷冻保存的组合物解冻并直接施用于受试者或添加至另一种溶液，例如，包含HA的溶液。替代地，可以在施用之前将冷冻保存的组合物解冻，并将间充质谱系前体细胞或干细胞重悬浮于可替代性载剂中。

在一个实例中，本公开的细胞组合物可以包含Plasma-Lyte A、二甲基亚砜(DMSO)和人血清白蛋白(HSA)。例如，本公开的组合物可以包含Plasma-Lyte A(70％)、DMSO(10％)、HSA(25％)溶液，所述HSA溶液包含5％HSA和15％缓冲液。

在一个实例中，本文所述的组合物可以作为单剂量施用。

在一些实例中，可以通过多种剂量施用本文所述的组合物。例如，至少2、至少3、至少4个剂量。在其他实例中，可以通过至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10个剂量施用本文所述的组合物。

在一个实例中，间充质谱系前体细胞或干细胞可以在向受试者施用之前进行培养扩增。细胞培养的各种方法是本领域已知的。在一个实例中，将间充质谱系前体细胞或干细胞培养扩增约4-10代。在一个实例中，将间充质谱系前体细胞或干细胞培养扩增至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10代。在一个实例中，将间充质谱系前体细胞或干细胞培养扩增至少5代。在这些实例中，可以将干细胞在冷冻保存之前进行培养扩增。

在一个实例中，在施用之前，将间充质谱系前体细胞或干细胞在无血清培养基中培养扩增。

在一些实例中，细胞包含在不允许细胞出来进入受试者的循环系统中，但允许细胞分泌的因子进入循环系统内的室内。以这种方式，可通过允许细胞将因子分泌到受试者的循环中来将可溶性因子施用于受试者。这样的室可以同样地植入受试者的某个部位以增加可溶性因子的局部水平。

在一个实例中，可以全身施用间充质谱系前体细胞或干细胞。在一个实例中，可以将问充质谱系前体细胞或干细胞施用于受试者的气道。在一个实例中，可以将间充质谱系前体细胞或干细胞施用于受试者的肺。在另一个实例中，可以将本公开的组合物静脉内施用。在另一个实例中，将组合物静脉内施用，并施用于受试者的气道。

在一个实例中，将间充质谱系前体细胞或干细胞每周施用一次。例如，每两周可以将间充质谱系前体细胞或干细胞每周施用一次。在另一个实例中，将间充质谱系前体细胞或干细胞每周施用两次。在一个实例中，可以将间充质谱系前体细胞或干细胞每月施用一次。在一个实例中，在两周内将两剂间充质谱系前体细胞或干细胞每周施用一次。在另一个实例中，每两周将两剂间充质谱系前体细胞或干细胞每周施用一次。在另一个实例中，在两周内施用四个剂量的间充质谱系前体细胞或干细胞，随后每月施用后续剂量。在一个实例中，每两周将两剂间充质谱系前体细胞或干细胞每周施用一次，随后每月一次施用后续剂量。在一个实例中，每月施用四剂。

在一个实例中，本公开的组合物包含“临床上证明有效的”量的MLPSC。在一个实例中，本公开的组合物包含“临床上证明有效”量的MSC。

本领域技术人员将了解，在不脱离本公开的广泛一般范围的情况下，可对上述实施方案作出许多改变和/或修改。因此，本发明的实施方案被视为在所有方面都是说明性而非限制性的。

以下具体实例应被解释为仅是说明性的，而不以任何方式限制本公开的其余部分。无需进一步详细说明，相信本领域技术人员可以基于本文的描述最大限度地利用本发明。

实施例

离体培养扩增的成体同种异体的骨髓源性间充质干细胞(MSC)用于治疗急性呼吸窘迫综合征(ARDS)

组合物

所述组合物由从健康成年供体的骨髓中分离出来的经培养扩增的间充质干细胞(ceMSC)组成。最终组合物包含在Plasma-Lyte A、二甲基亚砜(DMSO)和人血清白蛋白(HSA)中配制的ceMSC。

目标

以确定：

-安全性

-存活率的改善。

受试者

被确定为患有中度COVID-19相关ARDS的患者接受间充质干细胞(静脉内；200万个细胞/千克)或对照疗法。125名患者＜65岁(即意向治疗(ITT)群体；表1)。ITT群体中58名接受细胞疗法，67名接受对照疗法。一些ITT患者被确定为患有轻度ARDS和/或低水平的炎症，特征在于循环CRP＜4。这些患者被排除在符合方案(PP)患者群体之外。因此，PP群体减少至89(从125)，其中38名接受细胞疗法，并且51名接受对照疗法。此外，PP群体代表始终患有最严重疾病的研究群体，因为他们都患有中度至重度ARDS。

表1：基线汇总数据：意向治疗预定年龄＜65岁和≥65岁的患者

分析

在第60天，在所有患者中，细胞疗法提供了一定程度的免于死亡的保护(图1)。

然而，对经治疗的患者的进一步分析出乎意料地显示，在第60天，在年龄小于65岁的患者中，细胞疗法提供了显著的免于死亡的保护(图2、3和9；A)，该分析是相对于年龄大于65岁的患者进行的(图2、3和9；B)。显著地，在意向治疗的(ITT)患者(与对照相比，死亡减少38.3％；p＝0.0484；图2)和符合方案(PP)患者(与对照相比，死亡减少43.3％；p＝0.0285；图3)中，年龄小于65岁的患者在第60天的免于死亡的保护很明显。还如图2和图3所示，与ITT患者相比，在PP患者中观察到死亡大幅减少。这是意想不到的结果，因为相比ITT患者，PP患者始终患有更严重的疾病。这些数据表明，患有更严重的ARDS诸如中度至重度ARDS的受试者可以对细胞疗法产生更好的反应。

在基线处接受地塞米松的年龄小于60岁的患者中也观察到显著的免于死亡的保护，这进一步支持了选择年龄小于65岁的ARDS患者来进行细胞疗法治疗的理由，尤其是当受试者还接受皮质类固醇时(图4：A，ITT患者，死亡减少68.9％，p＝0.0074；B，PP患者，死亡减少78.9％，p＝0.0043)。

通常预期年龄小于65岁的患者比年龄大于65岁的患者具有更高的健康状况。虽然这些患者的健康状况较高，但是他们仍然死于ARDS，与年龄大于65岁的患者相比，治疗后结局出人意料地得以改善。这些数据支持对细胞疗法反应良好的ARDS患者群体的确定，尤其是考虑到在这些患者中提供免于死亡的保护。

对照群体的分析显示，在基线处施用地塞米松不降低对照患者的死亡率(图5：A：所有年龄＜65岁的对照ITT患者，p＝0.554；B：所有年龄≥65岁的对照ITT患者，p＝0.815)。出乎意料的是，在用细胞疗法和地塞米松治疗的患者中，这种在第60天缺乏免于死亡的保护得到弥补(图4)，并且在用细胞疗法和地塞米松治疗的患者中观察到超出加和的免于死亡的保护(图6、7和8)。显著地，在细胞疗法和地塞米松之间观察到的协同作用在ITT患者(p＝0.0669)和PP患者(p＝0.0363)中很明显。在＜65岁患者的探索性分析中，在60天内，细胞疗法与地塞米松的组合也使脱离呼吸机存活天数协同增加(图10)。

图6汇总了年龄小于65岁的患者的免于死亡的保护。未提供对于对照患者或单独施用地塞米松的患者的保护。用细胞疗法治疗赋予了一定程度的免于死亡的保护，用细胞疗法和地塞米松治疗可以显著增加这种保护(另外参见图4)。在细胞疗法与地塞米松组合后，记录到临床和呼吸功能均得以改善(图7和8)。这种组合还增加了患者的无呼吸机存活天数(图10)。

这些数据为选择年龄小于65岁的患有ARDS的患者来进行细胞疗法治疗，尤其是用细胞疗法和皮质类固醇诸如地塞米松来治疗提供了令人信服的理由。这些数据还表明，通过选择正在服用皮质类固醇的年龄小于65岁的ARDS患者并且给这些患者施用细胞疗法，可以显著改善ARDS患者的治疗结局。

生物标志物分析

测量107名经治疗的患者和106名对照的炎性生物标志物的水平(治疗＜65n＝55；对照＜65n＝65；治疗＞65n＝52；对照＞65n＝41)，该测量在基线处和在细胞疗法治疗后进行(固定给药方案为在3-5天内200万(2×10

对年龄＜65岁和＞65岁的经治疗的受试者之间的炎性生物标志物水平进行的比较提供了独特机会来鉴定用于选择进行治疗的患者的可测量标准。令人惊讶地，如图12和图13所示，年龄＞65岁似乎与基线处炎症活性增加相关，无论患者是否服用皮质类固醇。事实上，对基线处服用皮质类固醇的所有患者的分析显示，＞65岁的患者相比＜65岁的患者具有＞5倍高的炎症活性(细胞因子/趋化因子)。

图12显示大于65岁的患者相比＜65的患者具有更高的炎症细胞因子/趋化因子基线水平，特别是：

(i)CCR2结合趋化因子(包括CXCL10/IP10和CXCL9)和CXCR3结合趋化因子(包括CCL2、CCL3和CCL7/MCP3)。这组趋化因子指示嗜中性粒细胞和巨噬细胞流入肺部增加。

(ii)IL-6和IL-8，指示巨噬细胞炎症增加和嗜中性粒细胞向肺部迁移增强。

(ii)CCL19和IL-2，指示T细胞活化/增殖和细胞凋亡性死亡。

在＞65岁的患者中增加的其他炎性生物标志物包括TGF-α、TNF、CXCL8、G-CSF/CSF-3和IL17C(图12和图13)。

＜65岁的患者表达与＞65岁的患者相同的炎症途径，尽管处于较低的基线水平。在＜65岁的患者中，细胞疗法减少炎症标志物，特别是：在＜65岁的患者中与COVID-19ARDS严重程度相关，尤其是：

-CCR2和CXCR3结合趋化因子，可能导致嗜中性粒细胞和巨噬细胞流入肺部减少；

-IL-6/IL-8/TNF/IL-18，指示IL-18驱动的炎性体减少，以及巨噬细胞活化/嗜中性粒细胞归巢至肺部减少；

-CCL19、以及IL-4/IL-13/GM-CSF减少，指示T细胞流入和活化减少。

总之：

-在经治疗的＜65岁患者中炎症途径被下调(图12和图13)，并且这与改善的预后(图2至图4)和呼吸功能的持久性改善相对应(图8)；

-在第7天，在＞65岁的经治疗的患者中观察到呼吸功能改善，但是改善是不可持续的(图8)；随后的生物标志物分析显示，这些患者的炎症基线水平较高(图12和图13)；

-生物标志物分析揭示无论年龄如何(＜65与＞65岁)，在ARDS患者中都涉及相似的炎症途径。

安全性

没有发生与输注相关的不良事件。

本领域技术人员应当理解，在不脱离广泛描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对具体实施方案中所示的本发明进行多种变化和/或修改。因此，本发明的实施方案被视为在所有方面都是说明性而非限制性的。

以上讨论的所有出版物均以其全文并入本文中。

本申请要求2021年4月23日提交的AU2021901214、2021年7月15日提交的AU2021902180、2022年2月9日提交的AU2022900260和2022年2月18日提交的AU2022900372的优先权，其公开内容通过引用并入本文中。

已包括在本说明书中的关于文献、法令、材料、装置、物品等的任何讨论仅仅是出于提供本发明的上下文的目的。这不应被视为是承认，这些内容中的任何部分或其全部构成现有技术基础的组成部分，或是与本发明有关的领域中的公知常识，如同它在本申请的每一项权利要求的优先权日之前就存在一样。