5′-(E)-乙烯基磷酸酯的合成方法

技术领域

本发明涉及化学合成技术领域，具体而言，涉及一种5′-(E)-乙烯基磷酸酯的合成方法。

背景技术

RNA干扰是一种对双链RNA的生物学反应，介导对内源性寄生和外源性致病核酸的抗性，并调节蛋白质编码基因的表达。近年来，RNA干扰取得了一系列进展，基于RNAi的治疗方法已经进入临床研究。然而，RNAi疗法最大的影响因素是如何将siRNA传送到目标细胞以及siRNA在人体内的分解。

对siRNA的修饰来改善其传递和稳定性成为目前研究的热点。报道使用5’-乙烯基磷酸盐修饰siRNA能有效提高其稳定性。但是将乙烯基磷酸盐引入5’位羟基的合成方法却不多。

目前常见的5’-乙烯基亚磷酰胺单体合成路线如下（文献：J. Med. Chem. 2018,61, 3, 734–744. Facile Synthesis, Geometry, and 2’-Substituent-Dependent inVivo Activity of 5’-(E)- and 5’-(Z)-Vinylphosphonate-Modified siRNAConjugates）：

目前该路线主要问题为化合物3的稳定性，该醛类化合物不稳定，后处理过程中遇水容易形成水合物，对后续反应有影响。且浓缩破坏反应发现该化合物浓缩过程中不稳定，容易变质导致放大收率明显降低。

发明内容

本发明旨在提供一种5′-(E)-乙烯基磷酸酯的合成方法，以解决现有技术中5′-(E)-乙烯基磷酸酯制备收率较低的技术问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种5′-(E)-乙烯基磷酸酯的合成方法。该合成方法包括以下步骤：使用moffatt氧化

进一步地，使用moffatt氧化

。

进一步地，使用moffatt氧化

第一反应釜中加入DMSO和

第二反应釜中加入四氢呋喃和

将第一反应釜中物料滴加到第二反应釜中，保温反应；

向第二反应釜中加入氯化铵水溶液淬灭反应；

采用MTBE对第二反应釜中的物料进行萃取，得到

进一步地，合成方法还包括对有机相进行纯化的步骤；

优选的，采用柱层析纯化

进一步地，第一反应釜中的DMSO加入量为

优选的，吡啶的加入量为0.8~1.5当量，优选1当量，三氟乙酸的加入量为吡啶当量的一半；

优选的，加入吡啶和三氟乙酸，搅拌0.5~1h后，加入二环己基碳二亚胺；更优选的，二环己基碳二亚胺的加入量为1.5~2.0当量，进一步优选为1.6当量；

优选的，加入二环己基碳二亚胺后，第一反应釜的反应温度保持在0~25℃；更优选的，HPLC跟踪至原料≤5%。

进一步地，第二反应釜中四氢呋喃的加入量为8~15V，优选10V，

优选的，第二反应釜中的反应温度为-20~0℃℃；

优选的，第二反应釜中加入的碱为氢化钠、叔丁醇钾或叔丁醇钠中的一种或多种，优选为氢化钠；

更优选的，氢化钠的加入量为1.3 eq. 60%氢化钠；更优选的，加入氢化钠后保温反应的时间为0.5~1h；

优选的，将第一反应釜中物料滴加到第二反应釜中保温反应后取样跟踪HPLC，每1~4h取样一次直至

进一步地，第二反应釜中氯化铵水溶液的加入量为8~25V V，优选20 V，淬灭后搅拌0.5~1h；

优选的，采用MTBE对第二反应釜中的物料进行萃取包括：控温0~25℃，向第二反应釜中加入5~20 V，优选10V MTBE, 搅拌1~2h后静置分层后分液，水相再次使用5~20 V，优选10 V MTBE萃取，将得到的有机相合并后，使用5~10 V，优选5V饱和氯化钠水溶液反洗

优选的，有机相合并后，浓缩至1~2V，柱层析纯化

进一步地，脱保护基反应的反应式为：

。

进一步地，脱保护基反应包括：

向第三反应釜中加入甲酸、纯化水和

采用DCM对第三反应釜中的物料进行萃取，得到

保温45~55℃跟踪反应，HPLC跟踪至

将第三反应釜中体系温度降温至0~10℃，优选降温速度10~30℃/h；

控温0~10℃，向第三反应釜中加入氨水调pH~7；

控温0~20℃，加入5~15 V，优选10V DCM萃取，静置分液后再次使用5~15 V，优选10V DCM萃取后静置分液；

将有机相合并后控温T≤45℃，浓缩至1~2V；

柱层析过柱纯化得到

可选的，

应用本发明的技术方案，使用moffatt氧化（二环己基碳二亚胺和二甲亚砜氧化）

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了实施例1中化合物4的色谱检测图；

图2示出了实施例2中化合物5的色谱检测图；以及

图3示出了实施例3中终产物的色谱检测图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

针对背景技术中提到的5’-乙烯基亚磷酰胺单体合成技术路线存在的问题，本申请对5’-乙烯基亚磷酰胺单体的合成方法进行了优化，为研究5’-乙烯基-siRNA的合成提供原料单体的优化合成方案。即在本发明中没有具体描述的步骤，可以参考背景技术中Facile Synthesis, Geometry, and 2’-Substituent-Dependent in Vivo Activity of5’-(E)- and 5’-(Z)-Vinylphosphonate-Modified siRNA Conjugates的技术方案完成。

根据本发明一种典型的实施方式，提供5′-(E)-乙烯基磷酸酯的合成方法。该方法包括以下步骤：使用moffatt氧化

应用本发明的技术方案，使用moffatt氧化（二环己基碳二亚胺和二甲亚砜氧化）

典型的，使用moffatt氧化

。

在本发明一实施例中，使用moffatt氧化

合成方法还包括对有机相进行纯化的步骤；

优选的，采用柱层析纯化

为了保证反应充分有效的进行，第一反应釜中的DMSO加入量为

为了充分的利用反应原料，保证反应效率，第二反应釜中四氢呋喃的加入量为8~15V，优选10V，

第二反应釜中氯化铵水溶液的加入量为8~25V，优选10V，淬灭后搅拌0.5~1h；优选的，采用IPAc或者MTBE（甲基叔丁基醚，优选甲基叔丁基醚）对第二反应釜中的物料进行萃取包括：控温0~25℃，向第二反应釜中加入5~20 V，优选10V IPAc或者MTBE（甲基叔丁基醚，优选甲基叔丁基醚）, 搅拌1~2h后静置分层后分液，水相再次使用5~20 V，优选10 V IPAc或者MTBE（甲基叔丁基醚，优选甲基叔丁基醚）萃取，将得到的有机相合并后，使用5~10 V饱和氯化钠水溶液反洗

脱保护基反应的反应式为：

。

脱保护基反应包括：

向第三反应釜中加入甲酸、纯化水和

采用DCM对第三反应釜中的物料进行萃取，得到

第三反应釜中保持温度15~30℃，将5~15 V，优选12.5 V甲酸和5~15 V，优选12.5V纯化水混匀，加入包含1当量

保温45~55℃跟踪反应，HPLC跟踪至

将第三反应釜中体系温度降温至0~10℃，优选降温速度10~30℃/h；控温0~10℃，向第三反应釜中加入氨水调pH~7；控温0~20℃，加入5~15 V，优选DCM萃取，静置分液后再次使用5~15 V，优选DCM萃取后静置分液；将有机相合并后控温T≤45℃，浓缩至1~2V；柱层析过柱纯化得到

在本发明一种典型的实施方式中，

下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。

本发明中化合物编号见背景技术中的描述。

实施例1

车间投料1Kg/80L反应化合物2到化合物4，反应IPC正常，2步连投收率~70%，产品（化合物4）过柱纯度~90%（产品：异构体~8：1）。

具体步骤：

1. 反应釜1中加入10 L DMSO(10 V)和原料2，15~25℃搅拌至全溶。

2. 降温至10~20℃。

3. 10~20℃加入158.44 g吡啶（1当量）和114.18 g三氟乙酸（0.5当量），搅拌0.5~1h后10~20℃缓慢加入661.27 g二环己基碳二亚胺（DCC）（1.5当量）。

4. 保温15~25℃反应，HPLC跟踪至原料≤5%area。

5. 反应釜2中加入10 L四氢呋喃（10 V）和1393.82 g原料7（1当量），搅拌至全溶后反应釜2降温至-20~-10℃。

6. -20~-10℃反应釜2中加入120 g氢化钠（60%）（1.5当量），保温-20~-10℃反应0.5~1h。

7. 控温0~10℃，将反应釜1中物料通过管路缓慢滴加到反应釜2中，保温反应2h后取样跟踪HPLC，每1~4h取样一次直至原料3HPLC≤5%area。

8. 控温0~10℃，向反应釜2中加入20 V氯化铵水溶液淬灭反应。淬灭后搅拌0.5~1h。

9. 控温0~25℃，向反应釜2中加入10 V MTBE, 搅拌1~2h后静置分层后分液。水相再次使用10 V MTBE萃取。将有机相合并后，使用5 V盐水反洗有机相。

10. 有机相合并后，浓缩至1~2V。柱层析纯化（庚烷/IPAc=10/1~1/1）得到产品有机相。有机相浓缩得到1221.32 g淡黄色油状产品HPLC纯度为92.11%，内标含量为83%，直接用于下一步反应（Wittig反应反式产物：顺式异构体~15：1）。

化合物4的核磁检测结果：

化合物4的色谱检测图见图1。

实施例2

根据专利方法，车间投料1Kg/80L，将~90%HPLC纯度化合物4投水解反应至化合物5，反应IPC跟踪至原料反应HPLC≤5%area，产品过柱后收率~60%，产品（化合物5）95%HPLC纯度。

1.15~30℃，反应釜1中将12.5 L甲酸（12.5 V）和12.5 L纯化水（12.5 V）混匀，加入1 Kg原料。

2.将体系升温至45~55℃，参考升温速度5~15℃/h。

3.保温45~55℃跟踪反应，跟踪至原料4≤2%area且原料4异构体≤1%area。

4.将体系温度降温至0~10℃，参考降温速度10~30℃/h。

5.控温0~10℃，向反应釜1中加入氨水调pH~7。

6.控温0~20℃，加入10V MTBE萃取产品。静置分液后再次使用10V MTBE萃取后静置分液。

7.将有机相合并后控温T≤45℃，浓缩至1~2V。

8.柱层析过柱纯化（庚烷/IPAc=10/1~1/1）得到纯品溶液，浓缩后得到606.70 g产品，HPLC纯度为99.04%，内表含量为84.85%，用于下一步。

化合物5的核磁检测结果：

化合物5的色谱检测图见图2。

实施例3

车间投料0.5 Kg/80L反应化合物5到化合物6，反应IPC跟踪至原料反应HPLC≤1%area，经过反向制备后得到产品纯度为100%，纯化后收率为80%。

1.在反应釜中加入2.50 L二氯甲烷（5 V），再加入327.98 g磷试剂（1.5当量）和68.54 g 4，5-二氰基咪唑（0.8当量），15~25℃搅拌至溶解。

2.使用2.50 L二氯甲烷（5 V）溶解原料，加入反应釜中。

3.保温15~25℃反应1~3 h，直至原料检测≤1%area。

4.控温15~25℃，使用5 L饱和氯化钠水溶液（10 V）搅洗两次，分液。

5.使用分子筛进行干燥有机相，直至KF≤1%。

6.将有机相控温T≤45℃，浓缩至1~2V。

7.进行反向制备，产品体系冻干即得到516.13 g白色固体产品，HPLC纯度为100%，内标含量为97%。

终产物的核磁膦谱检测结果：

终产物的核磁检测结果：

终产物的色谱检测图见图3。

上述检测结果表明本发明成功的合成了各中间产物及终产物。

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：

应用本发明的技术方案，使用moffatt氧化（二环己基碳二亚胺和二甲亚砜氧化）

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。