竹荪发酵液及其制备方法、用途和化妆品

技术领域

本申请属于化妆品技术领域，尤其涉及一种竹荪发酵液及其制备方法、用途和化妆品。

背景技术

竹荪，也叫长裙竹荪(Dictyophora indusiata)为竹荪属模式种，属担子菌亚门，鬼笔菌目，鬼笔菌科，竹荪属。长裙竹荪营养物质丰富，竹荪中含有丰富的蛋白质、粗脂肪和多糖、凝集素、多酚氧化酶。具有抗氧化，延缓衰老，调节免疫功能等作用。

现有技术中采用有机溶剂提取竹荪中的活性成分，不仅会造成环境污染，而且试验操作具有一定的危险性，中试条件严格，不利于产业化。且采用有机溶剂对活性成分进行提取的成本高，其提取物中可能会残留有机溶剂，不利于用作化妆品原料。此外，现有技术中针对单一成分的提取效率低，资源浪费严重。

发明内容

本申请实施例提供一种竹荪发酵液及其制备方法，利用微生物对竹荪进行发酵，能够降低对环境造成的污染，还可以减少竹荪中活性成分的流失，将竹荪充分利用，减少资源的浪费。

第一方面，本申请提供一种竹荪发酵液的制备方法，方法包括：

制备发酵原料液，包括将竹荪粉料与去离子水混合，得到发酵原料液；

制备初始发酵体系，包括将发酵原料液进行灭菌处理，得到初始发酵体系；

发酵培养，包括向初始发酵体系中加入发酵菌进行培养发酵，以得到竹荪发酵液；其中，以初始发酵体系中去离子水的体积为基准，初始发酵体系中发酵菌的活菌数为10

在本申请可选的一些实施例中，制备发酵原料液，包括将竹荪粉料与去离子水以1:10～300的质量比混合。

在本申请可选的一些实施例中，将竹荪粉料与去离子水混合，包括将平均粒径为50目～150目的竹荪粉料与去离子水混合。

在本申请可选的一些实施例中，制备初始发酵体系的步骤包括将发酵原料液进行高温灭菌处理，进行高温灭菌处理的条件为：将发酵原料液置于灭菌温度为110℃～125℃的高压灭菌锅中灭菌15分钟～35分钟；

将灭菌后的发酵原料液冷却至室温，以得到初始发酵体系。

在本申请可选的一些实施例中，发酵培养步骤包括向初始发酵体系接种保藏编号为CICC No.22696的植物乳植物杆菌(Lactobacillus plantarum)和/或保藏编号为CICCNo.22709的类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)的发酵菌。

在本申请可选的一些实施例中，发酵培养步骤包括：

将植物乳植物杆菌和/或类干酪乳杆菌菌粉分别溶解于无菌去离子水中，获得活菌数均为10

将植物乳植物杆菌和/或类干酪乳杆菌的接种菌液加入初始发酵体系进行培养发酵。

在本申请可选的一些实施例中，发酵培养步骤包括：

向初始发酵体系中加入包括植物乳植物杆菌和/或类干酪乳杆菌的接种菌液的发酵菌，得到初始发酵混合液；其中，发酵菌的活菌数为10

将初始发酵混合液在30℃～45℃的恒温培养箱中静置培养发酵，以得到竹荪发酵液。

在本申请可选的一些实施例中，竹荪发酵液的制备方法还包括：

将竹荪发酵液进行发酵菌灭菌处理，以得到发酵菌灭菌的竹荪发酵液；

将发酵菌灭菌的竹荪发酵液冷却至室温进行离心处理，以得到竹荪发酵液的上清液；

将竹荪发酵液的上清液进行二次灭菌，以得到竹荪发酵液。

在本申请可选的一些实施例中，将竹荪发酵液的上清液进行二次灭菌包括：

将竹荪发酵液的上清液进行二次灭菌的工艺参数需要满足：

灭菌温度为110℃～125℃、灭菌压强为0.1MPa～0.13MPa、灭菌时间20分钟～40分钟。

在本申请可选的一些实施例中，竹荪发酵液的制备方法还包括：

向竹荪发酵液或二次灭菌后的竹荪发酵液中加入占竹荪发酵液总质量0.5w.t％～2wt.％的防腐剂，以得到竹荪发酵液。

在本申请可选的一些实施例中，向二次灭菌后的竹荪发酵液中加入防腐剂包括：

使二次灭菌后的竹荪发酵液的温度为50℃～80℃，然后向竹荪发酵液中加入防腐剂分散均匀，得到竹荪发酵液。

在本申请可选的一些实施例中，防腐剂选自对羟基苯乙酮、1,2-己二醇或其组合。

第二方面，本申请提供了一种竹荪发酵液，根据上述的竹荪发酵液的制备方法制备得到。

第三方面，本申请提供了一种竹荪发酵液用于制备化妆品的用途。

第四方面，本申请提供了一种化妆品，以质量百分数计，包括1wt.％～100wt.％上述的竹荪发酵液。

在本申请另一些可选的实施例中，化妆品中竹荪发酵液的含量为5wt.％～99.0wt.％，还包括化妆品选自载剂、乳化剂、保湿剂、粘度调节剂、美白组分、舒缓组分、防腐剂、香味剂或其组合的助剂。

在本申请另一些可选的实施例中，助剂的含量为1wt.％～95wt.％。

本申请实施例的竹荪发酵液的制备方法，利用微生物发酵菌对竹荪进行发酵提取，不再使用有机溶剂进行提取，不仅能够使提取的竹荪发酵液中不再残留有机溶剂，可以安全的用作化妆品原料，还能够避免对环境造成污染，使提取过程具有更高的安全性；此外，采用微生物发酵提取操作步骤简便，能够提高活性成分的提取效率，将竹荪充分利用，减少竹荪活性成分的流失和浪费。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本申请一个实施例提供的竹荪发酵液的制备方法的流程示意图；

图2是本申请实施例1-4和对比例1-3提供的竹荪发酵液的细胞存活率对比图；

图3是本申请实施例1-4和对比例1-3提供的竹荪发酵液的DPPH自由基清除率对比图：

图4是本申请实施例1-4和对比例1-3提供的竹荪发酵液的羟自由基清除率对比图；

图5是本申请实施例1-4和对比例1-3提供的竹荪发酵液的总抗氧能力对比图。

具体实施方式

下面将详细描述本申请的各个方面的特征和示例性实施例，为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施例，对本申请进行进一步详细描述。应理解，此处所描述的具体实施例仅意在解释本申请，而不是限定本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以在不需要这些具体细节中的一些细节的情况下实施。下面对实施例的描述仅仅是为了通过示出本申请的示例来提供对本申请更好的理解。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

随着科技的飞速发展，人类物质生活条件改善，人口老龄化不断加剧，积极探索和开发抗氧化、抗衰老的产品对社会人口老龄化具有重要意义。在大量试验证据的基础上，现代衰老学说中自由基学说最受重视。该学说指出，机体细胞在正常代谢过程中产生较多的活性氧自由基。自由基在人体内处于不断产生和不断清除的动态平衡之中，当人体受到外源性因素以及内源性因素的影响时，自由基产生过多或者清除过少都有可能造成组织细胞的损伤，进而引起机体的衰老以及其他的疾病。

本申请的发明人在对现有技术进行改进的过程中，发现通过微生物发酵的方式可以对竹荪中的活性成分进行提取，不仅可以减少活性成分的流失，还可以更好的发挥其护肤效果。本申请制备的竹荪发酵液即可以作化妆品直接使用，也可以作为添加剂加入化妆品基础配方中使用，具有较好的抗氧化、抗衰老、滋养肌肤的效果。

为了解决现有技术中存在的问题，本申请实施例提供了一种竹荪发酵液的制备方法。下面首先对本申请实施例所提供的竹荪发酵液的制备方法进行介绍。

图1示出了本申请一个实施例提供的竹荪发酵液的制备方法的流程示意图。如图1所示，竹荪发酵液的制备方法，包括：

S1、制备发酵原料液，包括将竹荪粉料与去离子水混合，得到发酵原料液；

S2、制备初始发酵体系，包括将发酵原料液进行灭菌处理，得到初始发酵体系；

S3、发酵培养，包括向初始发酵体系中加入发酵菌进行培养发酵，以得到竹荪发酵液；其中，以初始发酵体系中去离子水的体积为基准，初始发酵体系中发酵菌的活菌数为10

本申请实施例竹荪发酵液的制备方法，利用微生物发酵菌对竹荪进行发酵提取，不再使用有机溶剂进行提取，不仅能够使提取的竹荪发酵液中不再残留有机溶剂，可以安全的用作化妆品原料，还能够避免对环境造成污染，使提取过程具有更高的安全性；此外，采用微生物发酵提取操作步骤简便，能够提高活性成分的提取效率，将竹荪充分利用，减少竹荪活性成分的流失和浪费。

在本申请可选的一些实施例中，竹荪粉料是将市售的干燥竹荪进行粉碎过筛制得。

在本申请可选的一些实施例中，竹荪粉料的平均粒径为50目～150目。即竹荪粉料呈粉末状，粉末状的竹荪与去离子水混合后可以更加充分的进行发酵。

在本申请可选的一些实施例中，制备发酵原料液包括将竹荪粉料与去离子水以1:10～300的质量比混合。可选的，竹荪粉料与去离子水的质量比为1:20～150，更可选的为1:100。

在本申请可选的一些实施例中，制备发酵原料液包括将平均粒径为50目～150目的竹荪粉料与去离子水混合。

在本申请可选的一些实施例中，制备初始发酵体系的步骤包括将发酵原料液进行高温灭菌处理，进行高温灭菌处理的条件为：将发酵原料液置于灭菌温度为110℃～125℃、灭菌压强为0.1Mpa～0.14Mpa的高压灭菌锅中灭菌15分钟～35分钟；

将灭菌后的发酵原料液冷却至室温，以得到初始发酵体系。

在本申请可选的一些实施例中，将发酵原料液置于灭菌温度可选的为115℃～121℃、灭菌压强可选的为0.1Mpa～0.13Mpa的高温灭菌锅中进行灭菌，灭菌时间可选的为15min～25min。更可选的为121℃、0.12Mpa、20min。对初始发酵体系进行灭菌避免后续发酵过程中不受其他杂菌的影响。

对本申请的初始发酵体系在灭菌完成后，将初始发酵体系静置冷却至室温，在初始发酵体系中接种发酵菌种，所述发酵菌种为植物乳植物杆菌和类干酪乳杆菌，并以菌液的形式接种。

在本申请可选的一些实施例中，发酵培养步骤包括向初始发酵体系接种保藏编号为CICC No.22696的植物乳植物杆菌(Lactobacillus plantarum)和/或保藏编号为CICCNo.22709的类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)的发酵菌。

在本申请可选的一些实施例中，发酵培养步骤包括：

将植物乳植物杆菌和/或类干酪乳杆菌菌粉分别溶解于无菌去离子水中，分别获得活菌数为10

将植物乳植物杆菌和/或类干酪乳杆菌的接种菌液加入初始发酵体系进行培养发酵。即在本申请的一些实施例中，上述的植物乳植物杆菌和类干酪乳杆菌可以各自单独的作为发酵菌，也可以混合后一同作为发酵菌。

在本申请可选的一些实施例中，植物乳植物杆菌的接种菌液的活菌数可选的为10

在本申请可选的一些实施例中，发酵培养步骤包括：

向初始发酵体系中加入包括植物乳植物杆菌和/或类干酪乳杆菌的接种菌液的发酵菌，得到初始发酵混合液；其中，发酵菌的活菌数为10

将初始发酵混合液在30℃～45℃的恒温培养箱中静置培养发酵，以得到竹荪发酵液。

在本申请可选的一些实施例中，以初始发酵体系中去离子水的质量为基准，发酵菌的活菌数为10

在本申请可选的一些实施例中，初始发酵混合液在恒温培养箱中进行静置培养，发酵温度为30℃～45℃，发酵时间为12h～36h；可选的，发酵温度为35℃～40℃，发酵时间为12h～24h。

本申请实施例竹荪发酵液的制备方法选用植物乳酸杆菌和类干酪乳杆菌的混合菌种或单独的一种发酵菌对竹荪进行发酵，发酵所需条件温和，有效的提高了竹荪的生物活性。发酵周期短，生产成本低，有利于规模化生产。

本申请采用植物乳植物杆菌和/或类干酪乳杆菌作为微生物发酵菌对竹荪进行发酵，减少了竹荪中活性成分的损失，制备得到的竹荪发酵液具有较好的肤感、抗氧化以及滋养皮肤的效果。

本申请在制备发酵液的过程中不添加任何化学成分，对肌肤零负担，具有较好的安全性，属于纯天然植物原料，在化妆品领域具有很好的应用前景。

在本申请可选的一些实施例中，竹荪发酵液的制备方法还包括：

将竹荪发酵液进行发酵菌灭菌处理，以得到发酵菌灭菌的竹荪发酵液；

将发酵菌灭菌的竹荪发酵液冷却至室温进行离心处理，以得到竹荪发酵液的上清液；

将竹荪发酵液的上清液进行二次灭菌，以得到竹荪发酵液。

在本申请可选的一些实施例中，将竹荪发酵液进行发酵菌灭菌处理包括：

将竹荪发酵液的发酵菌进行高温灭菌，以终止发酵；其中，高温灭菌的温度为110℃～125℃、灭菌压强为0.1Mpa～0.14Mpa，灭菌时间为15分钟～35分钟。可选的，灭菌温度可选的为115℃～121℃、灭菌压强可选的为0.1Mpa～0.13Mpa，灭菌时间可选的为15min～25min；更可选的为121℃、20min。

灭菌完成后，将竹荪发酵液冷却至室温进行离心，取竹荪发酵液的上清液，作为竹荪发酵原液；其中，离心转速为3000r/min～9000r/min，离心半径为8cm～15cm，离心时间为10min～40min。可选的离心转速为4000r/min～6000r/min；进一步优选为5000r/min；可选的离心时间为20min～40min，更可选的为30min。

在本申请可选的一些实施例中，将竹荪发酵液的上清液进行二次灭菌包括：

将竹荪发酵液的上清液进行二次灭菌的工艺参数需要满足：

灭菌温度为110℃～125℃、灭菌压强为0.1MPa～0.14MPa、灭菌时间20分钟～40分钟。

在本申请可选的一些实施例中，二次灭菌的灭菌温度可选的为115℃～121℃、灭菌压强可选的为0.1MPa～0.13MPa、灭菌时间为25分钟～35分钟。

灭菌完成后，需在竹荪发酵液中添加防腐剂。

在本申请可选的一些实施例中，竹荪发酵液的制备方法还包括：

向二次灭菌后的竹荪发酵液中加入占竹荪发酵液总质量0.5w.t％～2wt.％的防腐剂，以得到竹荪发酵液。

在本申请可选的一些实施例中，向二次灭菌后的竹荪发酵液中加入防腐剂包括：

使二次灭菌后的竹荪发酵液的温度为50℃～80℃，然后向竹荪发酵液中加入防腐剂分散均匀，得到竹荪发酵液。

在本申请可选的一些实施例中，二次灭菌后的竹荪发酵液与防腐剂混合的过程中二次灭菌后的竹荪发酵液的温度可选的为70℃～80℃。

在本申请可选的一些实施例中，防腐剂选自对羟基苯乙酮、1,2-己二醇或其组合。

在本申请可选的一些实施例中，防腐剂包括对羟基苯乙酮、1,2-己二醇，对羟基苯乙酮和1,2-己二醇占二次灭菌后竹荪发酵液质量的0.5wt.％～2wt.％。

在本申请可选的一些实施例中，对羟基苯乙酮、1,2-己二醇分别占二次灭菌后竹荪发酵液质量的0.5wt.％。

第二方面，本申请提供了一种竹荪发酵液，根据上述的竹荪发酵液的制备方法制备得到。

本申请实施例的竹荪发酵液主要应用于化妆品领域，可以应用于不同种类的化妆品。

本申请实施例的竹荪发酵液，既可以作为化妆品直接使用，也可以添加到化妆品基础配方中使用。

第三方面，本申请提供了一种竹荪发酵液用于制备化妆品的用途。

本申请实施例的化妆品可作为皮肤外用剂涂敷于皮肤上，即以竹荪发酵液作为功能组分。

第四方面，本申请提供了一种化妆品，以质量百分数计，包括1wt.％～100wt.％上述的竹荪发酵液。竹荪发酵液的含量为100wt.％，即将制备的竹荪发酵液直接作为化妆品使用。

在本申请的另一些实施例中，化妆品中竹荪发酵液的含量为5wt.％～99wt.％。可选地，竹荪发酵液在化妆品中的含量为60％～99wt.％。即本申请实施例制备的竹发酵液在化妆品中作为主要的功能组分。

在本申请的另一些实施例中，化妆品中还可包括选自载剂、乳化剂、保湿剂、粘度调节剂、美白组分、舒缓组分、防腐剂、香味剂或其组合的助剂。助剂的含量为1wt.％～95wt.％，即化妆品除竹荪发酵液含量之外的余量。

在本申请的另一些实施例中，载剂选自去离子水、纯化水、乙醇；乳化剂选自吐温28、吐温60、脂肪醇聚氧乙烯醚、聚乙二醇脂肪酸酯、海藻酸或其组合；保湿剂选自聚乙二醇、水解胶原蛋白、粘多糖、聚谷氨酸钠、赖氨酸、角鲨烷、果酸、吡咯烷酮羧酸钠、透明质酸、透明质酸钠或其组合，其中聚乙二醇分子量小于500；粘度调节剂选自PEG300-600、明胶、阿拉伯胶、环糊精；美白组分选自胆固醇衍生物、月见草油、小麦胚芽油、ACP植物肌素或其组合；舒缓组分选自肌肽、硫辛酸、人参皂苷、槲皮素或其组合；防腐剂选自苯氧乙醇、羟基苯甲酯、1,2-己二醇、迷迭香、乙二醇；香味剂选自薄荷醇、香兰素、水仙花精油、栀子花精油、玫瑰花精油、铃兰花精油、茉莉花精油。

测试部分

实施例1

制备竹荪发酵液，包括：

S1、制备发酵原料液，包括取300mL去离子水和3g竹荪粉料混合均匀，得到发酵原料液；其中，竹荪粉料是将干燥的竹荪进行粉碎过筛后，获得的粉末粒径目数为100目的竹荪粉料；

S2、制备初始发酵体系，包括将发酵原料液于121℃高压灭菌锅中灭菌20min，灭菌后冷却至室温(25℃)，得到初始发酵体系；

S3、发酵培养，包括向初始发酵体系中加入发酵菌进行培养发酵，以得到竹荪发酵液；发酵菌包括保藏编号为CICC No.22696的植物乳植物杆菌和保藏编号为CICC No.22709的类干酪乳杆菌，均以接种菌液的形式作为发酵菌添加到初始发酵体系中，其中植物乳植物杆菌的接种菌液和类干酪乳杆菌的接种菌液的活菌数均为10

S4、灭菌、提纯，在发酵结束后，将得到的竹荪发酵液在高压蒸汽灭菌锅中以121℃、0.13Mpa的灭菌条件灭菌20min，以终止发酵；

灭菌完成后，将竹荪发酵液冷却至室温(25℃)进行离心，离心转速4800r/min，离心时间为30min，离心结束后，得到竹荪发酵液的上清液；

将竹荪发酵液的上清液进行二次灭菌，以得到竹荪发酵液；二次灭菌的条件是121℃、压强为0.12Mpa灭菌30min；

灭菌结束后向竹荪发酵液中添加防腐剂，竹荪发酵液与防腐剂混合的过程中，所述混合的温度为75℃；以竹荪发酵液的质量为基准，加入0.5wt.％对羟基苯乙酮和0.5wt.％的1,2-己二醇，以起到防腐作用，混合均匀得到竹荪发酵液。

实施例2

竹荪发酵液的制备方法同实施例1，不同之处在于只接种保藏编号为CICCNo.22696的植物乳植物杆菌，菌液总添加量不变，其他条件参数同实施例1。

实施例3

竹荪发酵液的制备方法同实施例1，不同之处在于只接种保藏编号为CICCNo.22709的类干酪乳杆菌，菌液总添加量不变，其他条件参数同实施例1。

实施例4

竹荪发酵液的制备方法同实施例1，不同之处在于加入5g竹荪粉料。

对比例1

竹荪发酵液的制备方法同实施例1，不同之处在于不接种发酵菌液。

对比例2

竹荪发酵液的制备方法同对比例1，不同之处在于只接种酿酒酵母菌，菌种菌量不变，发酵温度为28℃，摇床转速为180r/min，发酵时间为48h。酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.17452，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年3月27日。将酿酒酵母菌接种于YPD液体培养基中，28℃培养48h，得到酿酒酵母菌菌液，其他条件参数同实施例1。

对比例3

竹荪发酵液的制备方法同实施例1，不同之处在于发酵时间为48小时。

下面对实施例1-4和对比例1-3制备的发酵液分别进行性能测试，性能测试包括以下项目：

一、细胞毒性实验

本实验采用来自中国科学细胞库的人体成纤维皮肤细胞验证上述实施例1-4和对比例1-3制得的竹荪发酵液产品的细胞毒性。

以下表格中是本实验中部分试剂、原料和设备的型号/牌号及可获得的来源：

表1部分试剂、原料、设备可获得的来源表

实验步骤：

1、分别将上述实施例1-4和对比例1-3制备的竹荪发酵液的产品用无血清的DMEM培养基配置成体积百分数为1％的实验组待测液；

2、将人体皮肤成纤维细胞培养于含10％胎牛血清以及1％双抗的DMEM培养基中，在37℃、5％ CO

3、将96孔板上完成用PBS磷酸缓冲液清洗的细胞分为实验组、对照组、空白对照组，其中空白对照组不含人体皮肤成纤维细胞；

然后向含有人体皮肤成纤维细胞的实验组中每孔加入100μL上述制备的已过滤除菌的不同浓度的实验组待测液，每个待测液做6个复孔；

向含有人体皮肤成纤维细胞的对照组加入无血清的DMEM培养基；

向无细胞的空白对照组加入100μL的PBS；

再将上述各组于37℃、5％ CO

细胞存活率(％)＝(A实验组-A空白对照组)/(A对照组-A空白对照组)×100％。

测试结果如下表2，并测试结果绘制成柱形图2：

表2实施例1-4和对比例1-3的竹荪发酵液的细胞存活率对比表

从表2和图2可以得出：对比例1-3制备的竹荪发酵液的细胞存活率均在84％以上，而本申请的实施例1-4制备的竹荪发酵液的细胞存活率高达86％以上，采用植物乳植物杆菌和/或类干酪乳杆菌制备的竹荪发酵液的细胞存活率均相对较高，特别是实施例1制备的竹荪发酵液的细胞存活率更是高达106％以上，说明本申请实施例通过两种发酵菌制备的竹荪发酵液的细胞存活率更高，证明竹荪发酵液对于人皮肤纤维成形细胞不具有细胞毒性。

二、DPPH自由基清除实验

DPPH是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氢能力，它在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，而且在517nm处有一个特征吸收峰，当遇到自由基清除剂时，DPPH的孤电子对被配对而使其褪色，也就是在最大吸收波长处的吸光度值变小。因此，可通过测定吸光值的变化来评价样品对DPPH自由基的清除效果。

DPPH自由基清除实验的具体实验步骤为：

(1)取等体积(1ml)的待测液与2×10

(2)取等体积(1mL)的无水乙醇作为待测物溶剂与2×10

(3)取等体积(1mL)的无水乙醇与待测液混匀(A

(4)避光反应30min后，在517nm下测A

其中，本实验对实施例1～4和对比例1～3制备的竹荪发酵液的样品稀释2倍后作为待测液进行DPPH自由基清除实验的测试，将测试结果记录于下表3中，并绘制成柱形图3：

表3实施例1-4和对比例1-3的竹荪发酵液对DPPH自由基清除率的测试结果表

如表3和图3所示，实施例1的竹荪发酵液对DPPH自由基清除率最高，为63.62±1.22％，说明本申请实施例1采用双发酵菌种植物乳植物杆菌和类干酪乳杆菌作为发酵菌在发酵时间为15小时的竹荪发酵液对DPPH自由基的清除率较高；且随着竹荪含量的增加，竹荪发酵液对DPPH自由基的清除率不会再增加，相反还会降低，如实例4的竹荪发酵液对DPPH自由基清除率为55.12±2.46％；而发酵时间达到48小时会使DPPH自由基的清除率降低，如对比例3的竹荪发酵液对DPPH自由基清除率为48.21±1.56％；而与对比例1-3的测试结果相比表明：相比于同时含有两种发酵菌的制备的竹荪发酵液，当仅含有的一种发酵菌制备的竹荪发酵液，对DPPH自由基的清除率明显下降；当不含有发酵菌时，制备的竹荪发酵液对DPPH自由基的清除率进一步下降，达到对比例1的49.24±0.97％；当对比例2的发酵菌更换为酿酒酵母菌，制备的竹荪发酵液对DPPH自由基的清除率更进一步下降至44.8±1.57％。可见本申请实施例1-4采用两种发酵菌混合发酵15小时左右制备的竹荪发酵液对DPPH自由基的清除率相对较好。

三、羟自由基清除实验

利用Fenton反应产生羟自由基(·OH)，向反应体系中加入水杨酸，·OH与水杨酸反应生成的有色化合物2,3-二羟基苯甲酸在510nm处有特征吸收峰。采用固定反应时间法，在510nm处测定含被测物反应液的吸光度，并与空白液比较，测定被测物对·OH的清除作用。按下表4向试管中添加试剂，依次加入9mmol/L FeSO

清除率＝(A

表4各组添加试剂用量(单位：ml)

本实验对实施例1～4和对比例1～3的样品稀释10倍后作为待测液进行羟自由基清除实验的测试，将测试结果记录于下表5中，并绘制成柱形图4：

表5、实施例1-4和对比例1-3的竹荪发酵液对羟自由基清除率的测试结果表

从表5及图4可以得出，实施例1采用两种发酵菌混合进行发酵制备的竹荪发酵液对羟自由基的清除率最高，达到71.11±1.18％；而实施例2和3分别仅采用一种发酵菌制备得到的竹荪发酵液对羟自由基的清除率则分别降低至64.98±1.46％和64.81±2.46％；实施4加入5g(相比实施例1的竹荪粉料含量增加)的竹荪粉料制备的竹荪发酵液对羟自由基的清除率降低至61.6±1.25％；对比例3发酵时间增加至48小时则会进一步降低竹荪发酵液对羟自由基的清除率，至50.62±1.97％。对比例1不接种发酵菌的竹荪发酵液对羟自由基的清除率进一步降低为50.79±1.69％；而对比例2接种酿酒酵母菌制备的竹荪发酵液对羟自由基的清除率更进一步降低为44.26±3.26％。上述测试结果表明，本申请实施例接种两种和分别接种其中一种发酵菌发酵适宜时间制备的竹荪发酵液的羟自由基清除率相对较好。四、总抗氧能力测定(ABTS法)

将总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS法)中自带的ABTS工作液和氧化剂溶液按照1:1的体积比进行配制得到ABTS工作母液，ABTS工作母液配制后，室温避光存放12小时至16小时后方可使用。配制的ABTS工作母液室温避光存放，在2-3天内稳定。在使用前，把ABTS工作母液用PBS稀释成ABTS工作液，要求ABTS工作液的吸光度减去相应的PBS空白对照后，A734为0.7±0.05，对应的A405在1.4左右。当待检测样品为水溶性样品时，用PBS稀释，此时ABTS工作母液的稀释倍数约为30-50倍。

用PBS配制样品溶液及稀释标准品：将实施例1-4和对比例1-3制备得到的竹荪发酵液分别作为样品直接进行测试；

将标准品(10mM Trolox标准溶液)选择PBS来稀释，把10mM Trolox标准溶液使用PBS分别稀释成0.15mM、0.3mM、0.6mM、0.9mM、1.2mM和1.5mM的标准溶液。

总抗氧能力测定步骤：

a.向96孔板的每个检测孔中加入200微升ABTS工作液；

b.向空白对照孔中加入10μL蒸馏水或PBS等适当溶液；向标准曲线检测孔内对应加入10微升稀释后的各浓度的Trolox标准溶液；向样品检测孔内加入10微升各种浓度的待测样品溶液；并分别轻轻混匀；

c.室温孵育2-6分钟后测定A734。

d.根据标准曲线计算出各测试样品的总抗氧化能力，将测试结果记录于下表6中，并绘制成柱形图5。上述过程使用的PBS购自北京百瑞极生物科技有限公司。

表6实施例1-4和对比例1-3制备得到的竹荪发酵液的总抗氧化能力测试结果表

从表6和图5可以得出，实施例1接种两种发酵菌发酵15小时制备的竹荪发酵液的总抗氧化能力最高，为0.258±0.009mM；而实施例2和实施例3仅接种一种发酵菌制备的竹荪发酵液，总抗氧化能力分别降至0.239±0.008mM和0.242±0.008mM，可见仅接种一种发酵菌会使得制备的竹荪发酵液的总抗氧化能力下降；实施例4加入5g竹荪粉料制备的竹荪发酵液的总抗氧化能力相对降低，为0.213±0.008mM；对比例3接种两种发酵菌发酵48小时制备的竹荪发酵液的总抗氧化能力进一步降低，为0.151±0.016mM。对比例1不接种发酵菌制备的竹荪发酵液的总抗氧化能力进一步下降至0.148±0.005mM，对比例2接种酿酒酵母菌制备的竹荪发酵液的总抗氧化能力进一步下降至0.117±0.012mM。上述测试结果表明：采用两种和分别采用其中一种发酵菌发酵适当时间能够有效的获得总抗氧化能力相对较高的竹荪发酵液。

实施例5

本实施例提供一种化妆品，包括质量分数为100wt.％的实施例1制备的竹荪发酵液，即将实施例1制备的竹荪发酵液原液直接作为化妆品使用。

以上所述，仅为本申请的具体实施方式，所属领域的技术人员可以清楚地了解到，为了描述的方便和简洁，上述描述的具体工作过程，可以参考前述方法实施例中的对应过程，在此不再赘述。应理解，本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本申请的保护范围之内。