小柴胡颗粒的检测方法

技术领域

本发明涉及中药质量控制领域，特别是涉及小柴胡颗粒的检测方法。

背景技术

本发明的小柴胡颗粒是以中药柴胡、黄芩、甘草、党参、生姜、姜半夏、大枣为原料制成的中药颗粒剂，具有解表散热，疏肝和胃的功效，用于外感病，邪犯少阳证。小柴胡颗粒近年来在防治非典、甲型流感、登革热、新冠肺炎等疫病中，作出了重要贡献，受到众多医生、患者的认可，口碑良好，市场前景广阔。

现行药典收载标准中，小柴胡颗粒薄层鉴别分别对黄芩苷、甘草对照药材和柴胡对照药材进行定性，含量测定指标为黄芩苷，不能全面准确的控制产品质量。

对中药复方制剂质量控制方法的深入研究是保证其稳定性和临床使用安全性的重要问题；公告号为CN105486771B的中国发明专利公开了小柴胡颗粒复方制剂的指纹图谱检测方法，该构建的指纹图谱分别指认了12个特征峰，分别为柴胡、黄芩、甘草、党参、生姜的专属特征峰。上述方法存在明显不足：(1)指纹图谱与含量测定分别采用不同方法进行检测；(2)指纹图谱采用非线性梯度进行测定，不易重现，重现性相对比较差；(3)采用甲醇、乙腈、0.2％磷酸三种溶液作为流动相，使用流动相通道多，耗有机试剂多，使检测方法繁琐复杂；(4)检测时间为105分钟，耗时比较长，效率不高。

发明内容

基于此，本发明的目的是提供一种能同时对小柴胡颗粒5味药材的15个成分进行定性和2味药材的2个成分进行定量的方法，操作简便，重复性高的小柴胡颗粒的指纹图谱构建方法和含量测定方法。

具体技术方案如下：

一种小柴胡颗粒指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：

混合对照品溶液的制备：取黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、汉黄芩苷、甘草酸铵、柴胡皂苷b

对照药材溶液的制备：取柴胡、黄芩、甘草、党参、大枣对照药材，加提取溶剂溶解，过滤，取续滤液作为对照药材溶液；

供试品溶液的制备：取小柴胡颗粒，加提取溶剂溶解，过滤，取续滤液为供试品溶液；

将所述混合对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液分别注入高效液相色谱仪进行测定，得到指纹图谱；

所述高效液相色谱仪采用的流动相为：有机相为乙腈，水相为0.15wt％～0.25wt％磷酸水溶液，进行线性梯度洗脱。

在其中一些实施例中，所述线性梯度洗脱的程序为：

0～70min，有机相(10～20)％→(55～65)％，水相(80～90)％→(35～45)％。

在其中一些实施例中，所述水相为0.18～0.22wt％磷酸水溶液；

所述线性梯度洗脱的程序为：

0～70min，有机相(13～17)％→(58～62)％，水相(83～87)％→(38～42)％。

在其中一些实施例中，所述液相色谱的柱温为22～28℃，优选为24～26℃。

在其中一些实施例中，所述提取溶剂为乙醇水溶液，优选为体积浓度为60～80％的乙醇水溶液。

在其中一些实施例中，所述溶剂为甲醇。

在其中一些实施例中，所述混合对照品溶液中，黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、汉黄芩苷、甘草酸铵、柴胡皂苷b

在其中一些实施例中，所述色谱条件还包括：流速为0.7～0.9ml/min，检测波长为250～255nm，进样量为8～12μL，色谱柱为C

在其中一些实施例中，所述溶解的方法为超声处理。

本发明的另一目的是提供一种小柴胡颗粒的含量测定方法，包括以下步骤：

混合对照品溶液的制备：取黄芩苷、甘草酸铵对照品，加提取溶剂稀释，作为混合对照品溶液；

供试品溶液的制备：取小柴胡颗粒，加提取溶剂溶解，过滤，取续滤液为供试品溶液；

将所述混合对照品溶液和供试品溶液分别注入高效液相色谱仪进行测定，测定小柴胡颗粒中黄芩苷、甘草酸的含量；

所述高效液相色谱仪采用的流动相为：有机相为乙腈，水相为0.15wt％～0.25wt％磷酸水溶液，进行线性梯度洗脱。

在其中一些实施例中，所述线性梯度洗脱的程序为：

0～70min，有机相(10～20)％→(55～65)％，水相(80～90)％→(35～45)％。

在其中一些实施例中，所述水相为0.18～0.22wt％磷酸水溶液；

所述线性梯度洗脱的程序为：

0～70min，有机相(13～17)％→(58～62)％，水相(83～87)％→(38～42)％。

在其中一些实施例中，所述液相色谱的柱温为22～28℃，优选为24～26℃。

在其中一些实施例中，所述提取溶剂为乙醇水溶液，优选为体积浓度为60～80％的乙醇水溶液。

在其中一些实施例中，所述混合对照品溶液中黄芩苷的浓度为0.25～0.27mg/mL，甘草酸的浓度为38～42μg/mL。

在其中一些实施例中，所述色谱条件还包括：流速为0.7～0.9ml/min，检测波长为250～255nm(用于甘草酸的含量测定)和313～317nm(用于黄芩苷的含量测定)的双波长，进样量为8～12μL，色谱柱为C

在其中一些实施例中，所述溶解的方法包括超声处理。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种可以同时实现小柴胡颗粒的指纹图谱构建以及黄芩苷、甘草酸含量测定的方法。本发明的发明人发现，在小柴胡颗粒的指纹图谱构建以及黄芩苷、甘草酸含量测定时，磷酸水溶液的浓度对检测体系的洗脱程序影响较大，通过使用流动相水相为特定浓度的0.15～0.25wt％磷酸水溶液，有机相为乙腈时，能够实现操作简便、普适性好的线性梯度洗脱程序。而且，发明人意外发现，将特定浓度的0.15～0.25wt％磷酸水溶液与线性梯度洗脱程序结合后，所得色谱图峰型很好，能同时检测出15个成分，各色谱峰分离度高，重复性高。

本发明所述柴胡颗粒的指纹图谱构建以及黄芩苷、甘草酸含量测定方法，能够达到具有很好的精密度和稳定性，有利于用于全面地提升小柴胡颗粒质量控制水平，保障产品的安全性、有效性、稳定均一性。

此外，本发明采用柴胡皂苷b

附图说明

图1是本发明实施例1的10批小柴胡颗粒的高效液相色谱图叠加图(A)和小柴胡颗粒的对照指纹图谱(B，图中从左到右分别是特征峰1至15)；

图2是小柴胡颗粒、柴胡药材对照色谱图(图中S1：小柴胡颗粒，S2：柴胡，图中数字所指为小柴胡颗粒中归属于柴胡的色谱峰的峰号)；

图3是小柴胡颗粒、黄芩药材对照色谱图(图中S1：小柴胡颗粒，S2：黄芩，图中数字所指为小柴胡颗粒中归属于黄芩的色谱峰的峰号)；

图4是小柴胡颗粒、甘草药材对照色谱图(图中S1：小柴胡颗粒，S2：甘草，图中数字所指为小柴胡颗粒中归属于甘草的色谱峰的峰号)；

图5是小柴胡颗粒、党参药材对照色谱图(图中S1：小柴胡颗粒，S2：党参，图中数字所指为小柴胡颗粒中归属于党参的色谱峰的峰号)；

图6是小柴胡颗粒、大枣药材对照色谱图(图中S1：小柴胡颗粒，S2：大枣，图中数字所指为小柴胡颗粒中归属于大枣的色谱峰的峰号)；

图7是小柴胡颗粒成品与标准指纹图谱相似度示意图(图中从左到右分别是特征峰1至15；R：对照指纹图谱；S1～S10：批号：K00226、K00227、K00228、K00229、K00230、K00231、K00232、K00233、K00234、K00235的指纹图谱)；

图8为水相为水时的色谱图；

图9为水相为0.1wt％磷酸水溶液时的色谱图；

图10为水相为0.2wt％磷酸水溶液时的色谱图；

图11为三种不同厂家的C

图12为不同柱温的色谱峰(A：25℃；B：20℃；C：30℃)。

具体实施方式

本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

现有的小柴胡颗粒指纹图谱建立存在以下技术问题：(1)小柴胡颗粒中物质种类复杂，并且多种有效成分之间会发生转换，例如柴胡药材中的柴胡皂苷a与柴胡皂苷d受热容易转化成柴胡皂苷b

基于上述现有方法存在的缺陷，本发明最终提供了一种能够解决上述技术问题的指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：

混合对照品溶液的制备：取黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、汉黄芩苷、甘草酸铵、柴胡皂苷b

对照药材溶液的制备：取柴胡、黄芩、甘草、党参、大枣对照药材，加提取溶剂溶解，过滤，取续滤液作为对照药材溶液；

供试品溶液的制备：取小柴胡颗粒，加提取溶剂溶解，过滤，取续滤液为供试品溶液；

将所述混合对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液分别注入高效液相色谱仪进行测定，得到指纹图谱；

所述高效液相色谱仪采用的流动相为：有机相为乙腈，水相为0.15wt％～0.25wt％磷酸水溶液，进行线性梯度洗脱。

本发明采用特定的流动相与特定的线性梯度相结合，可以同时实现指纹图谱构建和特征物质含量测定的小柴胡颗粒质量控制方法，耗时短，重现性高，并且本发明采用柴胡皂苷b

在其中一些实施方式中，本发明中的线性洗脱梯度为：0～70min，有机相(10～20)％→(55～65)％，水相(80～90)％→(35～45)％。进一步优选地，所述水相为0.18～0.22wt％磷酸水溶液；所述线性梯度洗脱的程序为：0～70min，有机相(13～17)％→(58～62)％，水相(83～87)％→(38～42)％。本发明在研究过程中发现，能否通过线性梯度洗脱程序来实现小柴胡颗粒很好的检测效果，流动相的选择十分重要，只有使用0.18～0.22wt％磷酸水溶液与乙腈配合，才能得到峰型和分离度都很好的色谱峰，用其他的水相例如水，或者其他浓度的磷酸水溶液，分离效果均很不理想。

进一步地，在上述方法的基础上，本发明选择所述液相色谱的柱温为22～28℃，优选为24～26℃。其所得色谱峰综合最佳。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

仪器与试药

仪器：日本SHIMADZU公司超快速高效液相质谱仪(LC-20AD-XR二元泵，SIL-20AD-XR自动进样器，CTO-20A柱温箱，SPD-M10A-PDA检测器)；Agilent1260高效液相色谱仪(德国Agilent公司，G1311B单四元泵、G1329B自动进样器、G1316A柱温箱、G1315D检测器、OPENLABCDS ChemStation Edition数据处理软件)；Dionex Ultimate 3000DGLC高效液相色谱仪(DGP-3600SD双三元泵、SRD-3600脱气机、WPS-3000SL自动进样器、TCC3000-RS柱温箱、DAD检测器)；色谱柱：Phecda-C18(4.6×250mm，5μm)。

试药：10批成品由广州白云山光华制药股份有限公司提供(K00226、K00227、K00228、K00229、K00230、K00231、K00232、K00233、K00234、K00235)。实验中液相色谱所用试剂乙腈及磷酸均为色谱级，其余所用试剂均为分析纯，水为超纯水。

对照品、对照药材均购自中国食品药品检定研究院，见表1：

表1所用对照品

实施例1指纹图谱的构建

(1)供试品溶液的制备：取本品小柴胡颗粒，研细，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇10ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液，即得。

(2)混合对照品溶液的制备：分别称取黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、汉黄芩苷、甘草酸铵、柴胡皂苷b

(3)对照药材溶液的制备：分别称取柴胡、黄芩、甘草、党参、大枣对照药材，研细，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇10ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液，即得。

(4)高效液相色谱法分析：精密吸取供试品溶液10μl，进样：色谱条件：色谱柱为Phecda-C

梯度洗脱方式

(5)共有峰确定：

分别取批号：K00226、K00227、K00228、K00229、K00230、K00231、K00232、K00233、K00234、K00235小柴胡颗粒，按照上述方法制备供试品溶液并进行测定，得到10批小柴胡颗粒的高效液相色谱图叠加图，具体如图1(A)所示，再将上述得到的10批小柴胡颗粒的高效液相色谱指纹图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)进行比较，确定15个共有特征峰并获得共有模式(对照指纹图谱)；图1(B)是本发明的小柴胡颗粒对照指纹图谱，图1中从左到右分别是特征峰1至15。

通过与对照药材溶液对比，得到峰归属如下：

归属于柴胡的特征峰为2、13、14号峰；图2是小柴胡颗粒、柴胡对照药材对照色谱图。

归属于黄芩的特征峰为3、4、6、7、8、9、10、11、15号峰；图3是小柴胡颗粒、黄芩对照药材对照色谱图。

归属于甘草的特征峰为12号峰；图4是小柴胡颗粒、甘草对照药材对照色谱图。

归属于党参的特征峰为1号峰；图5是小柴胡颗粒、党参对照药材对照色谱图。

归属于大枣的特征峰为5号峰；图6是小柴胡颗粒、大枣对照药材对照色谱图。

图7为小柴胡颗粒成品与标准指纹图谱相似度示意图。

利用DAD检测器和UFLC-TRIPLE TOF-DAD-MS/MS技术手段对主要峰进行色谱峰归属及峰纯度检测；质谱工作参数：ESI电喷雾离子源，离子喷雾电压正模式5500V，负模式-4500V；辅助气1：60PSI；辅助气2：50PSI；离子源温度：500℃；气帘气40PSI；扫描范围m/z50～1000，分别采用正、负离子模式进行检测；高效液相色谱条件：以C18(2.1×100mm，1.8μm)为色谱柱，柱温：40℃，以乙腈为流动相A，0.1％甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，0min→15min：5％→30％A，15min→30min：30％→95％A，30min→32min：95％A，32min→32.1min：95％→5％A，32.1min→35min：5％→0％A，流速：0.25ml/分钟；进样量：1μl。

通过UV吸收曲线比较，结合质谱的分子离子峰、裂解碎片信息鉴定：1号峰为党参碱、2号峰为山奈酚-葡萄糖基-鼠李糖苷、3号峰为野黄芩苷、4号峰为6-阿拉伯糖基-8-葡萄糖基-5,7-二羟基黄酮、5号峰为槲皮素、6号峰为黄芩苷、7号峰为二氢木蝴蝶素A、8号峰为黄芩苷异构体、9号峰木犀草素、10号峰为汉黄芩苷、11号峰为黄芩素、12号峰为甘草酸、13号峰为柴胡皂苷b2、14号峰为柴胡皂苷b1、15号峰为汉黄芩素。

以6号峰黄芩苷为参照物峰，小柴胡颗粒指纹图谱共有峰的相对保留值列表具体如下：

(6)方法学研究

6.1精密度试验：精密称取同一小柴胡颗粒供试品溶液于高效液相色谱仪上连续进样6次，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)进行评价，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均为1.00，结果表明仪器的精密度良好，结果见表2。

表2小柴胡颗粒精密度试验相似度结果

6.2稳定性试验：精密称取同一小柴胡颗粒供试品溶液，分别在0、2、4、6、12、24、48小时进样，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)进行评价，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均为1.00，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均为1.00，结果表明供试品溶液放置48小时内稳定，结果见表3。

表3小柴胡颗粒稳定性试验相似度结果

6.3重复性试验：精密称取同一批小柴胡颗粒6份，按供试品溶液制备项下方法操作，分别进样，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)进行评价，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均为1.00，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均为1.00，结果表明方法的重复性良好，结果见表4。

表4小柴胡颗粒重复性试验相似度结果

6.4中间精密度：精密称取同一批小柴胡颗粒，分别在不同日期、不同分析人员、不同仪器等变动因素条件下，依法测定，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)进行评价。结果表明该方法中间精密度好，小柴胡颗粒HPLC指纹图谱质量控制方法可行，结果见5～7。

(1)不同分析时间：取同一批号的小柴胡颗粒，分别于不同日期按“供试品溶液的制备”项下方法操作，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)进行评价，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均为1.00。

表5小柴胡颗粒不同分析时间试验相似度结果

(2)不同分析人员：取同一批号的小柴胡颗粒，不同人员分别按“供试品溶液的制备”项下方法操作，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)进行评价，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均为1.00。

表6小柴胡颗粒不同分析人员试验相似度结果

(3)不同仪器：取同一批号的小柴胡颗粒，按“供试品溶液的制备”项下方法操作，分别在不同的仪器依法测定，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)进行评价，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均为1.00。

表7小柴胡颗粒不同分析仪器试验相似度结果

综上，通过方法学研究，本发明的指纹图谱检测方法重复性、稳定性、精密度均良好，能检测出5味药材的15个成分，更全面地把控小柴胡颗粒的质量。

实施例2小柴胡颗粒指标成分含量测定

1.供试品溶液的制备：取本品小柴胡颗粒，研细，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇10ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液，即得。

2.混合对照品溶液的制备：分别称取黄芩苷、甘草酸铵对照品适量，置于同一容量瓶，加70％乙醇制成每ml含黄芩苷0.26mg、含甘草酸40μg的混合对照品溶液。(甘草酸＝甘草酸铵/1.0207)。

3.高效液相色谱条件：精密吸取样品10μl，进样：色谱条件：色谱柱为Phecda-C18(4.6×250mm，5μm)；以乙腈为流动相A，0.2wt％磷酸溶液为流动相B，采用以下梯度洗脱方式：

检测波长：252nm(用于甘草酸含量测定)、315nm(用于黄芩苷含量测定)；流速：0.8ml/min；柱温：25℃。

4.方法学研究

4.11线性关系考察：分别取黄芩苷对照品浓度：0.0001mg/ml、0.0256mg/ml、0.0512mg/ml、0.1024mg/ml、0.2049mg/ml、0.4098mg/ml，按上述色谱条件进样，以对照品的浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线，回归方程：y＝342.34x-0.3355，r＝1，结果表明在浓度范围：0.0001～0.4098mg/ml内黄芩苷与峰面积的线性关系良好。

分别取甘草酸铵对照品浓度：0.0004mg/ml、0.0036mg/ml、0.0073mg/ml、0.0146mg/ml、0.0291mg/ml、0.0582mg/ml，按上述色谱条件进样，以对照品的浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线，回归方程：y＝123.79x-0.0139，r＝1，结果表明在浓度范围：0.0004～0.0582mg/ml内与峰面积的线性关系良好。

4.12定量下限：

取黄芩苷对照品溶液(浓度：0.0001mg/ml)适量，进样10μl，依上述方法法测定。信噪比约为10:1时，连续进样5次，峰面积RSD为5.38％(见下表)，故本含量测定方法的定量下限为0.0001mg/ml。

黄芩苷定量下限

取甘草酸对照品溶液(浓度：0.0004mg/ml)适量，进样10μl，依法测定。信噪比约为10:1时，连续进样5次，峰面积RSD为3.13％(见下表)，故本含量测定方法的定量下限为0.0004mg/ml。

甘草酸定量下限

4.2精密度试验：取黄芩苷、甘草酸对照品溶液，按照上述方法，连续进样6次，记录色谱图，计算得到黄芩苷、甘草酸的峰面积精密度的RSD分别为0.10％、0.11％，表明本发明的仪器精密度良好。

4.3重复性试验：取同一批小柴胡颗粒6份，每份约1.0g,精密称定，按供试品溶液制备方法制备，按上述色谱条件进样测定，计算得到黄芩苷、甘草酸含量的RSD分别为0.57％、0.65％，表明该方法重复性良好，具体如下表所示。

小柴胡颗粒的黄芩苷含量测定重复性试验

小柴胡颗粒的甘草酸含量测定重复性试验

4.4稳定性试验：取小柴胡颗粒约1.0g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备，按上述色谱条件分别于0、2、4、6、12、24、48小时进样测定，计算得到黄芩苷、甘草酸峰面积的RSD分别为0.08％、0.48％，表明本发明的供试品溶液在48小时内稳定性良好。

4.5加样回收率试验：取小柴胡颗粒9份，每份约0.5g，精密称定，分别加入适量各对照品，按供试品溶液制备方法制备，按上述色谱条件进样测定，计算得到黄芩苷、甘草酸的平均加样回收率分别为98.88％、98.55％，RSD分别为1.13％、1.34％，表明该方法准确度良好。

4.6小柴胡颗粒含量测定结果及含量限度

取10批小柴胡颗粒，按供试品溶液制备方法制备，按上述色谱条件进样测定，计算样品中黄芩苷和甘草酸两种成分的含量；根据平均值下调20％，得到小柴胡颗粒黄芩苷含量限度为25.0mg/袋，甘草酸含量限度为2.5mg/袋。

表8 10批小柴胡颗粒中两种成分的含量测定结果(mg/袋)

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于，流动相的水相选自以下(1)～(3)其中一组：

(1)超纯水；

(2)0.1wt％磷酸；

(3)0.2wt％磷酸(实施例1)。

色谱图如图8-10所示，从色谱图的分离度，以及峰型的对称度等数据显示实施例1选择浓度为0.2wt％的磷酸水溶液作为流动相的水相与本发明的线性洗脱梯度配合，才能实现图10所述的很好的色谱峰，其各峰的分离度和对称度都很好，并同时具有操作简便，重复性高的有点。而使用纯水或者浓度为0.1wt％的磷酸水溶液作为流动相的水相与线性洗脱梯度结合后，图8和图9发现整体峰形较差，检测效果不好。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于，色谱柱选自以下(1)～(3)其中一组：

(1)Phecda C

(2)Feinigen RedClassical II C

(3)Welch Ultimate XB-C

结果如图11所示(A：Feinigen；B：Welch；C：Phecda)，三种不同厂家的C

实施例5

本实施例与实施例1的区别在于，分别选用20℃、25℃、30℃作为柱温。

结果如图12所示(A：25℃；B：20℃；C：30℃)，20℃时8、9号峰与11、12号峰的分离度不好，30℃时15号峰的分离度不好，所以25℃柱温下的色谱图峰型最佳。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。