一种青钱柳甜苷及其制备方法及其应用

技术领域

本发明属于天然产物技术领域，涉及一种青钱柳甜苷及其制备方法及其应用。

背景技术

甜味是人们最为喜爱的一种味道，其本质是一些化合物对味觉受体作用的结果。目前使用广泛的传统甜味剂几乎都属于糖类，被认为是高热量的类型。这种高热值糖的过量摄入，不仅仅会导致肥胖、龋齿，还可能会导致糖尿病、心血管系统疾病、神经功能障碍，以及加速衰老，产生各种影响身体健康的问题。在甜味剂广泛应用的今天，出于对健康和美味的追求，人们对所摄入食物内在质量的要求越来越高，开始纷纷追求低热值、口感好、安全性高的食品。在这类食品中，天然非糖类甜味剂，如甘草甜素、甜菊糖苷、罗汉果苷等，因其甜度高、热量低，受到人们的青睐。

在众多的甜味植物产品中，青钱柳茶作为一种古老茶饮，因其具有浓郁绵长的甘甜味，以及在降脂、降糖等方面的作用，被誉为“神茶”、“医学界的第三棵树”。目前，青钱柳叶还被国家列入新资源食品目录，具有巨大的开发潜力。

青钱柳Cyclocarya paliurus(Batal)Iljinskaja，又名青钱李、摇钱树、甜茶树等，系胡桃科青钱柳属落叶乔木，是中国特有的单种属植物，主要分布于长江以南各省区。据《中华本草》、《中国中药资源志要》等医药典籍记载，青钱柳的树叶、树皮、树根均可药用，具有清热消肿、止痛的功能，可用于治疗顽癣。长期以来，多地民间采其嫩叶制茶，茶汤甘甜滋润，被认为具有生津止渴、清热解暑、降压强心、延年益寿等作用，可有效防治糖尿病、冠心病、高血脂和神经衰弱等疾病。现代药理学研究表明，青钱柳叶具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗菌及提高免疫力等生理活性。对青钱柳叶化学成分的研究表明，其主要含黄酮、萜类、多糖、有机酸等成分。在这些化学成分中，目前已发现了十余种具有显著甜味的成分，如青钱柳苷I，其甜度约为蔗糖的250倍。从青钱柳叶分离得到的具有甜味成分的化学结构来看，主要具有达玛烷或2,3位裂环的达玛烷型三萜母核，通常含多个不饱和双键，并且连接一个或数个、以异鼠李糖和/或阿拉伯糖为主要类型的配糖基，见图1。通过文献调研，结合预试验分析，我们推测：除了目前已经发现的、具有甜味的化学成分，青钱柳叶中尚存在多种尚未发现的、具有甜味的化学成分；从结构上分析，这类甜味成分应当具有与已发现甜味成分结构类似的三萜达玛烷或裂达玛烷型糖苷；从类型上分析，这类甜味成分为低热值的天然非糖类化合物。基于上述分析，参考其他天然非糖类甜味剂品种如甜菊糖苷、罗汉果甜苷等，通过对青钱柳叶进行提取、浓缩、除杂、富集、纯化、脱色、干燥等工艺精制而成的、具有甜味的、甜味指标成分明确的、包含更多甜味指标成分结构类似化学成分的提取物，我们将其命名为青钱柳甜苷。

目前，对青钱柳化学成分提取工艺的研究报道较多，主要集中于青钱柳多糖、黄酮和三萜，专门针对青钱柳甜苷的研究尚属空白。虽然青钱柳甜苷在化学结构上仍属于三萜类，但与一般研究中提到的青钱柳总三萜，具有明显区别：(1)在原料上，一般研究中的青钱柳总三萜的原料为6-10月完全生长的叶片，而青钱柳叶在其3-5月尚未完全生长的嫩叶阶段，甜味显著，从中提取获得的青钱柳甜苷，其结构较青钱柳总三萜(以不具有甜味的齐墩果酸、阿江榄仁酸为代表)存在明显区别。(2)在制备工艺上，青钱柳总三萜提取工艺通常包括醇类溶剂提取、有机溶剂萃取和/或大孔吸附树脂富集纯化、活性炭或离子交换树脂精制，以及干燥等环节，系根据三萜类天然产物具有易溶于醇类溶剂、分子量适中、分子极性中等偏小等特性设计开发的提取方案；而青钱柳甜苷是一类具有甜味的、化学结构明显有别于青钱柳总三萜，尤其是受原料采摘时间的影响，在青钱柳叶由嫩叶向老叶的生长发育过程中，青钱柳甜苷及其共存的色素杂质将会发生重大变化。可以佐证的例子是茶树和香椿树的嫩叶与老叶具有巨大的化学组成差异。鉴于此，不难推测：不同采收期获得的青钱柳叶所含青钱柳甜苷以及共存杂质将有所不同，从而造成对青钱柳甜苷和青钱柳总三萜两者的提取以及除杂脱色等工艺操作的不同。(3)评价指标：青钱柳总三萜的制备工艺，多以齐墩果酸为标志性成分，以总三萜含量、纯度、得率等为指标；而青钱柳甜苷的制备工艺则以甜味强度为主要指标。由此可以理解，青钱柳甜苷的提取，筛选分离、纯化精制等工艺环节，无论从原料筛选还是工艺设计依据，将有别于青钱柳总三萜的提取工艺设计。

除此之外，虽然目前有少数对青钱柳甜味成分的研究报道，但主要是采用常规的植物化学分离手段，获得成分单体并鉴定结构，最后测试其甜度。基于从青钱柳嫩叶中提取获得青钱柳甜苷，开展系统的甜味成分的发现与分离的研究报道尚属空白。建立基于具有甜味指标成分的青钱柳甜苷的质量控制体系尚属空白。青钱柳甜苷在食品、医药工业的应用更是尚属空白。

发明内容

为解决上述技术问题，提供一种青钱柳甜苷及其制备方法及其应用，通过系统研究，筛选出青钱柳叶具有甜味的粗提物，进一步以甜度为指标，通过分离、纯化、精制和干燥，获得了青钱柳甜苷；随后从青钱柳甜苷中分离获得具有显著甜味的指标性成分，并建立其HPLC特征图谱，进一步考察其降脂作用，为尝试将其应用于食品、饮料和医药行业产品的生产加工奠定基础。

本发明的技术方案是：

一种青钱柳甜苷，青钱柳甜苷为青钱柳叶通过水或醇提，过大孔吸附树脂，水、乙醇溶液依次洗脱得到。

优选地，所述青钱柳甜苷中包括碟卡苷A或其他三萜皂苷。

所述的青钱柳甜苷的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

S1：青钱柳叶适量，加入水或乙醇，加热回流提取，合并提取液，减压浓缩得到浓缩液；

S2：浓缩液通过大孔吸附树脂柱，分别用水、15-25％乙醇溶液、75-85％乙醇溶液依次洗脱；

S3：75-85％乙醇洗脱部位减压浓缩至无醇味，加水混悬，用乙酸乙酯萃取，回收溶剂，得到青钱柳叶甜味部位；

S4：青钱柳叶甜味部位进行脱色处理；

S5：干燥得到青钱柳甜苷。

优选地，所述步骤S1加入15-30倍量的水或70％乙醇，加热回流提取3-4次，单次提取时间1.5-2.5h。

优选地，所述步骤S2浓缩液通过大孔吸附树脂柱，所装填的材料为非极性或弱极性的大孔吸附树脂，分别用5-15倍量柱体积的水、15-25％乙醇溶液、75-85％乙醇溶液依次洗脱。

进一步优选地，所述步骤S2浓缩液通过大孔吸附树脂柱，所装填的材料为非极性或弱极性的大孔吸附树脂，例如X-5型大孔吸附树脂，分别用10倍量柱体积的水、20％乙醇溶液、80％乙醇溶液依次洗脱。

优选地，所述步骤S4脱色处理方法为青钱柳叶甜味部位加水制备得到青钱柳甜味部位待脱色的原液，加入脱色剂进行脱色，所述脱色剂为氧化镁或凹凸棒土或聚酰胺或氧化铝或活性炭或其组合，添加量为0.03-6％。

优选地，所述步骤S4脱色处理方法包括以下步骤：

S4.1复配脱色剂的制备：氧化镁和活性炭剂进行复配，混匀即得复配脱色剂；

S4.2青钱柳甜味部位待脱色的原液加入复配脱色剂，恒温脱色，振摇，过滤，收集滤液得到脱色后的青钱柳甜味部位。

进一步优选地，所述步骤S4.1氧化镁和活性炭剂按(75-85):1进行复配；S4.2青钱柳甜味部位待脱色的原液加入2-5％复配脱色剂，在55-75℃下恒温脱色0.5-2h。

进一步优选地，所述青钱柳叶进行步骤S1前还经过预处理，其预处理方法为：取青钱柳叶，加入石灰水，室温浸泡0.5-1.5h，过滤，弃去滤液，叶片用水快洗2-3次，测试显中性，晾干备用。

所述的青钱柳甜苷或所述方法制备的青钱柳甜苷可用于制备具有降脂功能的药物中的剂型特征属于口服液、胶囊、片剂、丸剂、滴丸剂、粉剂、注射液中的任何一种，或作为食品添加剂应用于各类酒、饮料、食品的加工生产，或作为药物辅料应用于药物制剂的生产。

本发明有益效果：

1、青钱柳甜苷是一类从青钱柳叶(尤其是嫩叶)分离得到的具有甜味的、不含或少含色素等杂质的提取物，其甜味指标成分是以碟卡苷A(Pterocaryosides A)为代表的具有达玛烷或2,3位裂环的达玛烷型三萜类化合物，通常含多个不饱和双键，并且连接一个或数个、以异鼠李糖和/或阿拉伯糖为主要类型的配糖基。

2、青钱柳甜苷是以甜度作为主要指标，经由提取、纯化、脱色、干燥等步骤获得的一种提取物，其外观呈浅棕黄至类白色细粉状，具有强烈且绵长的甜味。

3、基于青钱柳甜苷化学组成的结构特点，青钱柳甜苷的制备适宜采用含较高浓度醇类溶液作为提取溶媒进行提取，纯化和脱色等中间过程中，应当避免长时间高温处理；最后干燥适宜采用温度较低的冷冻干燥或减压真空干燥等方式。

4、青钱柳甜苷的制备，是采用大孔吸附树脂和/或有机溶剂萃取法进行富集和纯化。由于经过提取和纯化之后得到的、具有显著甜味的青钱柳甜味部位等中间产物，尚存大量色素杂质，因而需要对青钱柳甜苷制备过程中的中间产物进行脱色精制处理。

5、青钱柳甜苷的制备，预先采用饱和或近饱和在石灰水浸泡处理，可有效去除一部分色素杂质。

6、为了有效去除与青钱柳甜苷共存的色素杂质，尝试了多种脱色处理手段，优选出氧化镁、凹凸棒土、聚酰胺、氧化铝、活性炭等脱色剂，具有较好的脱色效果。更进一步地，优选出一种复合脱色剂，系以氧化镁和活性炭以80:1的重量比例进行复配，可获得更好的脱色效果。利用优选出的氧化镁和活性炭复合脱色剂进行脱色处理，通过试验确定了较好的工艺参数：复合脱色剂用量1％-5％，较优的用量为3％；脱色时间为0.5h-3h，较优的脱色时间为1.5h；脱色温度为40℃-80℃，较优的脱色温度为60℃。

7、利用本发明的提取、纯化、脱色、干燥等步骤所得青钱柳甜苷提取物，具有良好的降脂活性；且由于其来源青钱柳叶被国家列入新资源食品目录，同时其制备过程所采用的乙醇、乙酸乙酯、氧化镁、活性炭等具有良好生物安全性，因而该青钱柳甜苷提取物具有良好的应用安全性。

附图说明

图1青钱柳叶中甜味成分的典型化学结构(来源：CN108235686A“新型三萜苷作为甜味剂或甜味增强剂”)；

图2青钱柳样品(S14：嫩叶；S15：老叶)典型HPLC色谱图；

图3青钱柳甜味部位制备流程；

图4各脱色剂的脱色效果；

图5组合脱色剂的脱色效果与甜度变化；

图6青钱柳甜苷外观；

图7碟卡苷A(Pterocaryosides A，D-1-2-1)的化学结构；

图8青钱柳甜苷样品(以S6为原料)的HPLC特征图谱；

图9不同原料(S14：嫩叶；S15：老叶)青钱柳甜苷样品的HPLC特征图谱对比；

图10 3T3-L1细胞经青钱柳甜苷处理7天后用油红O染色的典型图片；

图11青钱柳甜苷对3T3-L1细胞中Nrf2易位和HO-1表达的影响。

具体实施方式

下面结合实施例来进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。

我们首先对不同时期采集的青钱柳叶进行了化学组成的HPLC分析。将青钱柳叶分别粉碎，精密称取样品粉末适量，放入锥形瓶，加70％甲醇溶液，称定质量，超声处理1h，放冷至室温后称定质量，滴加70％甲醇溶液，补足减失的质量，经微孔滤膜(0.45μm)过滤后，取续滤液，注入HPLC仪进行分析。采用的色谱条件为：Dionex UltiMate 3000 HPLC系统；Ultimate XB-C

实施例1

一种青钱柳甜苷，青钱柳甜苷为青钱柳叶通过水或醇提，过大孔吸附树脂，水、乙醇溶液依次洗脱得到。

优选地，所述青钱柳甜苷中包括碟卡苷A或其他三萜皂苷。

所述的青钱柳甜苷的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

S1：青钱柳叶适量，加入水或乙醇，加热回流提取，合并提取液，减压浓缩得到浓缩液；

S2：浓缩液通过大孔吸附树脂柱，分别用水、15-25％乙醇溶液、75-85％乙醇溶液依次洗脱；

S3：75-85％乙醇洗脱部位减压浓缩至无醇味，加水混悬，用乙酸乙酯萃取，回收溶剂，得到青钱柳叶甜味部位；

S4：青钱柳叶甜味部位进行脱色处理；

S5：干燥得到青钱柳甜苷。

优选地，所述步骤S1加入15-30倍量的水或70％乙醇，加热回流提取3-4次，单次提取时间1.5-2.5h。

优选地，所述步骤S2浓缩液通过X-5型非极性大孔吸附树脂柱，分别用10倍量柱体积的水、20％乙醇溶液、80％乙醇溶液依次洗脱。

优选地，所述步骤S4脱色处理方法为青钱柳叶甜味部位加水制备得到青钱柳甜味部位待脱色的原液，加入脱色剂进行脱色，所述脱色剂为氧化镁或凹凸棒土或聚酰胺或氧化铝或活性炭或其组合，添加量为0.03-6％。

优选地，所述步骤S4脱色处理方法包括以下步骤：

S4.1复配脱色剂的制备：氧化镁和活性炭剂进行复配，混匀即得复配脱色剂；

S4.2青钱柳甜味部位待脱色的原液加入复配脱色剂，恒温脱色，振摇，过滤，收集滤液得到脱色后的青钱柳甜味部位。

进一步优选地，所述步骤S4.1氧化镁和活性炭剂按(75-85):1进行复配；S4.2青钱柳甜味部位待脱色的原液加入2-5％复配脱色剂，在55-75℃下恒温脱色0.5-2h。

进一步优选地，所述青钱柳叶进行步骤S1前还经过预处理，其预处理方法为：取青钱柳叶，加入石灰水，室温浸泡0.5-1.5h，过滤，弃去滤液，叶片用水快洗2-3次，测试显中性，晾干备用。

所述的青钱柳甜苷或所述方法制备的青钱柳甜苷可用于制备具有降脂功能的药物中的剂型特征属于口服液、胶囊、片剂、丸剂、滴丸剂、粉剂、注射液中的任何一种，或作为食品添加剂应用于各类酒、饮料、食品的加工生产，或作为药物辅料应用于药物制剂的生产。

详细研发过程如下：

1、药物来源

通过文献研究和实地调研，考察青钱柳资源主要分布和栽培区域，采集新鲜植物材料；同时从各地市场购买不同产地、不同批次的青钱柳叶茶。所有青钱柳植物材料经鉴定为青钱柳Cyclocarya paliurus(Batal.)lljinskaja的叶，见表1。所有实验材料均用于本发明中青钱柳甜苷的制备。作为研究用材料，主要选择广西全州产青钱柳嫩叶S6作为研究对象。

表1青钱柳材料一览

2、甜味测试方法

所有试验溶液均用蒸馏水配制，水温为25±5℃。品尝小组由5名男士和5名女士组成，其对感官评定有兴趣，身体健康，具有良好的表达能力，具有较好的感官分辨能力，能客观对待每份待测样品。品尝两个样品之间用温水漱口数次，直到感觉不到余味。每次品尝试验只评价一份样品。

试验方法根据文献[A.T.Cameron.The ralative sweeteners of variouscompounds and of their mixtures.Can J Res,1945,23:Sec.E.139-166]报道的方法进行，稍有调整。在测试之前要求品尝成员比较三种随机放置的不同浓度的蔗糖溶液的甜度，并排序，约有90％的成员能够按正确的顺序排列。然后，分给每位成员一定浓度的试验溶液及六个随机放置的不同浓度蔗糖溶液，要求品尝人员找出与测试样品甜度相当的蔗糖溶液，即为等甜蔗糖浓度(ES)。

样品的品尝结果以相对甜度(RS)描述。RS表示某试验样品在某一等甜蔗糖浓度(ES)时，其甜度为蔗糖甜度(＝1)的倍数：

相对甜度(RS)＝等甜蔗糖浓度(％)/试样溶液浓度(％)。

3、青钱柳茶汤的制备及甜味测试结果

取表1中的青钱柳叶，经减压真空干燥后，粉碎成粗粉。取0.5g青钱柳叶粗粉，装入玉米纤维茶袋中，封口。各取一包青钱柳茶包，冲入100ml开水，浸泡10分钟，滤出茶汤。待茶汤温度降至室温，口尝，评价其甜味并作记录。进行甜味测试时，配制系列浓度的蔗糖溶液分别为10％、5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％(m/m)，试样溶液浓度均为0.5％(m/m)。样品ES值的判定允许取各浓度蔗糖溶液的中间值，例如品尝某份样品茶汤的甜感，较1％蔗糖溶液的甜感稍强，而弱于2.5％蔗糖溶液的甜感，则由品尝成员判定该试样溶液的ES值处于1％和2.5％之间。

甜味测试结果表明，表1中的青钱柳叶，除了S1、S9、S16、S19四份青钱柳老叶的茶汤无明显甜味外，其余均有甜味，RS值变化范围为0.4～8。其中以S6(广西全州)、S7(贵州雷山)茶汤的甜度最高，RS值分别为6和8。随后的研究，选择以存量较充足的广西全州产青钱柳嫩叶S6作为研究材料。

4、青钱柳叶甜味部位的筛选与提取

参照青钱柳茶以热水冲泡饮用的方式，称取S6青钱柳叶粗粉适量，加入20倍量的饮用纯净水，加热回流提取3次，单次提取时间2h，合并提取液，减压浓缩。取适量浓缩液，以二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，经回收溶剂，冷冻干燥后，分别获得二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位以及萃余水部位。另取适量浓缩液，通过预处理好的X-5型大孔吸附树脂，分别用10倍量柱体积的水、20％乙醇溶液、40％乙醇溶液、60％乙醇溶、80％乙醇溶液和95％乙醇依次洗脱。各洗脱液经回收溶剂，冷冻干燥后，分别获得水洗部位、20％乙醇洗脱部位、40％乙醇洗脱部位、60％乙醇洗脱部位、80％乙醇洗脱部位以及95％乙醇洗脱部位。

分别称取上述各部位适量，加入热水充分振摇，配制成5mg·ml

上述溶剂萃取法中的二氯甲烷和乙酸乙酯，大孔吸附树脂法中以40％乙醇溶液、60％乙醇溶液和80％乙醇溶液洗脱，均可以达到富集青钱柳叶中甜味成分的目的。由于二氯甲烷和乙酸乙酯均属于中低极性有机溶剂，乙酸乙酯的极性稍强于二氯甲烷，两者富集青钱柳叶中甜味成分的原理是采用相似相溶的原理，因而可以考虑乙酸乙酯一步萃取的方式富集青钱柳叶中甜味成分。大孔吸附树脂法富集青钱柳叶中甜味成分，主要是根据甜味成分被大孔树脂吸附和不同浓度乙醇溶液的解吸附作用的原理来实现，醇溶液的浓度越高，解吸附能力越强，因而可以考虑采用水、20％乙醇溶液和80％乙醇溶液分步洗脱，直接收集80％乙醇洗脱部位，即能有效富集青钱柳叶中几乎全部的甜味成分。进一步考虑溶剂萃取法和大孔吸附树脂法工作原理的不同，两者去除杂质的种类和能力有所不同，为获得杂质更少的青钱柳叶甜味部位，设计溶剂萃取法和大孔吸附树脂法联用的方式，提取青钱柳叶的甜味部位。通过反复试验，确定以下提取工艺方法：

称取青钱柳叶适量，加入20倍量的饮用纯净水，加热回流提取3次，单次提取时间2h，合并提取液，减压浓缩。浓缩液通过预处理好的X-5型大孔吸附树脂，分别用10倍量柱体积的水、20％乙醇溶液、80％乙醇溶液依次洗脱。80％乙醇洗脱部位减压浓缩至无醇味，加适量水混悬，用乙酸乙酯萃取，回收溶剂，冷冻干燥，即为青钱柳叶甜味部位。提取流程见图3。

取青钱柳叶甜味部位适量，加入热水充分振摇，配制成5mg·ml

5、脱色剂的筛选

通过上述“4”的研究，获得的青钱柳叶甜味部位具有强烈且持久的甜感，但同时发现，该部位性状呈棕褐色至黄绿色半固体状，表明其共存大量色素等杂质。为此，需要采用合适的脱色剂对其进行脱色处理。目前除色素方法主要包括活性炭等吸附法，双氧水等化学方法，以及离子交换树脂、大孔树脂吸附法等。本试验以活性炭、活性白土、聚酰胺、凹凸棒土、氧化镁、氧化铝、阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、硅胶、硅藻土这10类脱色材料对青钱柳甜味部位进行脱色处理，以脱色率和甜味变化为考察指标，筛选出最佳的脱色剂，用于后续脱色工艺研究。

5.1青钱柳甜味部位的制备采用上述“4”的工艺条件，制备得到浓度为0.1g/ml的青钱柳甜味部位待脱色的原液，备用。

5.2甜度评价方法采用上述“2”中甜味评价方法。在此，由于试样溶液浓度较高(10％，m/m)，在此浓度下，口尝试样溶液的甜感极为强烈，呈现出明显后苦味，同时甜味维续时间超过20分钟，极大影响了甜味测试的效率。因此，为了更直观比较各种脱色剂处理前后甜味的变化，对每一份样品，多次重复品尝，通过记录原液和脱色处理后溶液之间的甜味变化，将溶液甜味进行量化评分，分值越高，甜度越高，与原液越接近。其中与原液甜度一致为5分，略微减弱为4分，明显减弱为2分，仅微弱甜味为1分，无明显甜味为0分。

5.3青钱柳甜味部位脱色率的测定在波长200-800nm范围内进行全波长扫描吸收曲线，结果显示青钱柳甜味部位原液在紫外末端有慢慢增强的吸收，却没有明显的高波长吸收。参照相关文献，选取420、520、620nm作为青钱柳甜味部位脱色率测定的波长。按以下公式计算脱色率：

脱色率＝[(A

5.4脱色剂的选择

5.4.1脱色剂最大适用量的确定取若干份原液10mL，分别加入适量的活性碳、活性白土、聚酰胺、凹凸棒土、氧化镁、氧化铝、阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、硅胶、硅藻土10种脱色剂，60℃保温，振摇2h脱色，过滤除掉脱色剂，收集滤液。以脱色液甜味保持与原液基本一致(＞4分)作为判定依据，选择各脱色剂合适的最大用量。结果显示，各脱色剂合适的最大用量：活性碳0.05％；活性白土0.2％；聚酰胺5％；凹凸棒土5％；氧化镁4％；氧化铝2％；阳离子交换树脂2g；硅胶5％；硅藻土5％。其中阴离子交换树脂在最小剂量(2g)时，甜味已明显减弱(小于2分)，不用于脱色工艺研究。

5.4.2各脱色剂的脱色效果原液经活性炭、活性白土、聚酰胺、凹凸棒土、氧化镁、氧化铝、阳离子交换树脂、硅胶、硅藻土在最大适用量脱色后，计算脱色率，平行比较脱色效果。结果如图4所示。原液经各脱色剂在各自最大适用量脱色后，脱色效果由好到差依次为：氧化镁>凹凸棒土>聚酰胺>氧化铝>活性炭>>阳离子交换树脂>硅胶>硅藻土>活性白土；其中氧化镁、凹凸棒土、聚酰胺、氧化铝、活性炭脱色效果较好。

5.4.3脱色剂联用考虑每种材料脱色原理不同，其脱除色素杂质的种类有异，为获得最佳的脱色效果，进一步采用复合脱色的方法，即对筛选出脱色效果较好的五种脱色剂：氧化镁(A)、凹凸棒土(B)、聚酰胺(C)、氧化铝(D)、活性炭(E)，通过两两配比组合，使用剂量为脱色剂最大适用量，考察组合脱色效果，结果见图5。不同组合脱色剂对甜味部位原液的脱色效果排序：AE>AD>AC>AB>DE>>CE>BD>BE>BC>CD，其中AE组合(氧化镁+活性炭)对原液脱色效果最好，脱色率可达82.71％，并且对甜味保留率相对较高，甜味分值为4.5(较原液基本没有减弱)。将氧化镁和活性炭复合使用，脱色操作方便，快捷，价格便宜，脱色效果优良，因此选择氧化镁和活性炭联用作为青钱柳甜味部位溶液的脱色剂。

6、青钱柳叶甜味部位的脱色工艺优化

6.1复配脱色剂的制备根据上述“5”筛选出氧化镁和活性炭组合作为青钱柳甜味部位的脱色剂，设计系列配比，通过试验确定氧化镁和活性炭剂量配比为80:1进行复配，混匀即得。

6.2脱色剂用量的确定分别取10mL原液于锥形瓶中，分别加入1％、2％、3％、4％、5％复配脱色剂，在60℃下恒温脱色1.5h，时时振摇，过滤，收集滤液，在420、520、620nm波长下测定溶液的吸光度，计算脱色率，并评价甜味。结果表明，加入的复配脱色剂越大，脱色效果越好；但是，随着复配脱色剂用量的加大，供试样品的甜味明显降低。综合考虑脱色效果及甜味变化，复配脱色剂用量选择3％较适宜。

6.3脱色时间的确定分别取10mL原液于锥形瓶中，分别加入3％复配脱色剂，在60℃下恒温脱色0.5h、1h、1.5h、2h、3h，时时振摇，过滤，收集滤液，计算脱色率，并评价甜味。结果表明，脱色时间的延长有利于色素分子与复配脱色剂的接触吸附，脱色时间在1.5h之后，脱色率基本维持恒定；在1.5h之后，溶液的甜味稍有降低。因此，脱色时间选取1.5h为宜。

6.4脱色温度的确定分别取10mL原液于锥形瓶中，分别加入3％复配脱色剂，在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下恒温脱色1.5h，时时振摇，过滤，收集滤液，计算脱色率，并评价甜味。结果表明，温度对原液脱色有显著影响，提高温度有利于脱色；但温度升至60℃以上时，脱色率趋于平缓，溶液的甜味开始降低。综合考虑，选择脱色温度60℃为宜。

6.5小结通过上述试验，基本明确青钱柳甜味部位合适的脱色工艺条件：采用氧化镁、活性炭等单一或复合脱色剂，较优的脱色剂是采用两种以上脱色材料进行组合，更优的脱色剂是将氧化镁和活性炭以80:1的重量比例进行组合所获得的复配脱色剂，该脱色剂用量1％-5％，较优的用量为3％；脱色时间为0.5h-3h，较优的脱色时间为1.5h；脱色温度为40℃-80℃，较优的脱色温度为60℃。在此工艺参数条件下，青钱柳甜味部位的脱色效果较好，且对甜味的影响较小。

7、青钱柳甜苷的制备

通过前述“4”-“6”的试验，基本明确了青钱柳甜味部位的富集、纯化、脱色等工艺方法，但是从青钱柳叶中制备青钱柳甜苷，尚需考虑生产效率等工艺合理性，以及操作适用性等问题。随后的实验研究发现，采用水煎煮的提取方式，第4次乃至第5次的青钱柳叶提取液仍然有明显甜味，表明以水作为溶媒，对青钱柳甜苷的提取效率较低；同时还发现，将青钱柳叶提取液长时间(＞3h)加热(近100℃)煎煮浓缩，其甜味有明显损失，提示该过程对青钱柳甜苷成分可能有破坏。进一步通过对比研究发现，采用饱和或近饱和石灰水(pH10～13)在室温下浸泡青钱柳叶，可有效去除部分色素杂质，同时对其甜度影响较小。为此，从青钱柳叶中提取青钱柳甜苷的工艺条件，可以考虑采用饱和或近饱和石灰水对青钱柳叶进行预处理，去除部分色素杂质；同时考察选择更加有效和安全的提取溶剂，以及避免将富含青钱柳甜苷的溶液进行长时间高温处理。通过反复试验，最终确定青钱柳甜苷合适的制备工艺方法：取青钱柳叶适量，加入饱和或近饱和的石灰水(pH值约为13)适量，室温浸泡1h，过滤，弃去滤液，叶片用清水快洗3次，pH试纸测试显中性，晾干水份，加入料液比1:20的70％乙醇溶液加热回流提取2h，过滤，收集滤液。反复提取4次后，叶片无甜味。合并提取液，减压回收乙醇，适当浓缩，经离心和/或过滤后，得到青钱柳叶浓缩液。该浓缩液通过预处理好的X-5大孔吸附树脂柱，依次用水、20％乙醇、80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，减压回收乙醇，得到青钱柳叶80％乙醇洗脱部位。再将该部位加适量水分散后，以乙酸乙酯萃取，回收溶剂后，得到青钱柳叶甜味部位。随后，采用“6.5”项下方法进行脱色处理，最后经冷冻干燥，得到青钱柳甜苷。

青钱柳甜苷提取物的外观(图6)呈浅棕黄至类白色细粉状，略吸湿。在冷水中溶解度较小，在热水及乙醇、甲醇等有机溶剂较易溶解。其水溶液的甜味强烈且绵长，略带苦涩。采用上述“2”项下甜味测试方法，青钱柳甜苷提取物的RS值为50～70。

8、青钱柳甜苷中标志性成分的分离和鉴定

取青钱柳甜苷样品0.5g，甲醇溶解，过滤，滤液通过Sephadex LH-20凝胶柱层析，以60％甲醇溶液洗脱，每8-10mL收集洗脱液，经HPLC和TLC方法检查后，合并具有相似组分的洗脱液，得到馏分A～F。馏分D经半制备高效液相色谱处理，得到亚馏分D-1。该D-1再次通过Sephadex LH-20凝胶柱层析，最后经半制备高效液相色谱制备，获得单体化合物D-1-2-1(40mg)。

取该D-1-2-1适量，以氘代甲醇(CD

9、青钱柳甜苷HPLC特征图谱分析

9.1供试品溶液的制备取青钱柳甜苷样品适量，加甲醇超声处理10min，使其充分溶解，经微孔滤膜(0.45μm)过滤，取续滤液，即得。

9.2对照品溶液的制备精密称取自制碟卡苷A对照品适量，加入甲醇溶解，制成对照品储备液。吸取该储备液适量，加入甲醇适当稀释，摇匀，即得。

9.3色谱条件

色谱条件：Dionex UltiMate 3000 HPLC系统。Ultimate XB-C

9.4结果图谱采集时间为80min。保留时间(Rt)在前40分钟以内，除Rt 4-6min出现较明显的色谱峰，其余色谱峰较小。这些较小的色谱峰，经紫外光谱分析，具有黄酮类成分的光谱特征，表明青钱柳甜苷样品中可能尚存有少量色素及黄酮类成分；在Rt 40-65min范围内，出现明显的色谱峰，经紫外光谱分析，这些色谱峰均显示为紫外末端最大吸收，同时根据反相色谱分离的原理，在该范围内出现的色谱峰，对应的化学成分的分子极性为中低极性，因而推测该范围内色谱峰对应的成分可能为三萜类成分。通过自制碟卡苷A对照品进行标定，Rt 51min色谱峰对应成分即为碟卡苷A。碟卡苷A是一种分子量为636.8562、中等偏弱极性的、具有强烈甜味的裂达玛烷型三萜皂苷。由此进一步证明在Rt 40-65min范围内色谱峰主要是以碟卡苷A为代表的裂达玛烷型三萜糖苷，即青钱柳甜苷类化合物。上述结果见图8。

此外，以青钱柳嫩叶为原料，经提取、精制而成的青钱柳甜苷提取物，甜味强烈且绵长，略带苦涩；而从青钱柳老叶中提取、精制而成的青钱柳甜苷提取物，甜味稍淡，同时苦涩味明显。HPLC分析表明，两都均含碟卡苷A指标成分，但以老叶为原料所得提取物中该成分含量明显较少，同时在保留时间8～30min范围内，存在明显的杂质峰；而以嫩叶为原料所得提取物中，碟卡苷A含量较高，并且与碟卡苷A指标成分相近保留时间范围(42-64min)内，色谱峰较丰富，可作为青钱柳甜苷化学组成的重要特征。上述结果见图9。

10、青钱柳甜苷的降脂活性研究

10.1前脂肪细胞培养与分化3T3-L1细胞贴壁后(Day 0)，将它转移至含分化液(MDI)[配方为：0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1μM地塞米松和5μg/mL胰岛素]的培养基中培养2天(Day 2)，随后单用含5μg/mL INS的DMEM高糖培养液培养2天(Day 4)，最后用DMEM高糖培养液培养5天(从Day 4到Day 9)。受试药物青钱柳甜苷提取物进行干预的时间为7天(从Day2到Day 9)；用未经促进分化处理的3T3-L1细胞作为对照组。

10.2对3T3-L1细胞活性的影响3T3-L1细胞在青钱柳甜苷提取物培养5天和7天后，细胞活力较同时间点的对照组降低了7.49和11.95％，在0.1～100μg/mL的浓度范围内对细胞没有表现出任何毒性。因此，青钱柳甜苷提取物的实验剂量是在低于100μg/mL的无毒浓度范围内进行。

10.3对3T3-L1细胞分化过程中脂质积累和TG含量的影响用青钱柳甜苷提取物(50和100μg/mL)和吡咯列酮(100μM)处理3T3-L1细胞2、5或7天后，可见3T3-L1胞内脂质积聚、TG含量明显降低，与同时间点模型组比较具有显著性差异，其中以处理7天效果最为明显。见表2和图10。

表2青钱柳甜苷对3T3-L1细胞分化过程中脂积累和TG含量的影响(Mean±SD,n＝5)

注：与同时间点的模型组比较

10.4对调控3T3-L1细胞分化PPARγ/CEBPα信号通路相关基因表达用青钱柳甜苷提取物(50和100μg/mL)和吡咯列酮(100μM)处理3T3-L1细胞后PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c、aP2、adiponectin mRNA明显降低；胞核中Nrf2和细胞中HO-1蛋白表达明显升高，胞浆中Nrf2蛋白明显降低。见表3、图11。

表3青钱柳甜苷对调控3T3-L1细胞分化的PPARγ/CEBPα信号通路相关基因表达的影响(Mean±SD,n＝5)

注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01

10.5通过干预HO-1表达对3T3-L1细胞分化过程中脂质、TG含量的影响用青钱柳甜苷提取物处理后细胞内脂质和TG含量明显降低，单用HO-1抑制剂ZnPP及与青钱柳甜苷提取物共同处理后，降低的细胞内脂质和TG的含量被明显逆转，结果见表4。此外，用青钱柳甜苷提取物处理后细胞内PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c、aP2、adiponectin mRNA表达明显降低，单用HO-1抑制剂ZnPP及与青钱柳甜苷萜提取物联用后，上述mRNA表达被明显逆转，结果见表5。

表4青钱柳甜苷通过干预HO-1表达对3T3-L1细胞分化过程中脂质、TG含量的影响(Mean±SD,n＝5)

注：与模型组比较

表5青钱柳甜苷通过干预HO-1表达对3T3-L1细胞分化过程中PPARγ/CEBPα信号通路相关基因的影响(Mean±SD,n＝5)

注：与模型组比较

10.6青钱柳甜苷降脂活性研究小结青钱柳甜苷提取物对3T3-L1前脂肪细胞的分化和脂肪的生成具有显著的抑制作用；其作用机制可能与其激活Nrf2/HO-1信号通路基因表达有关；与抑制PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c、aP2、adiponectin等脂肪生成转录因子的表达有关。

经过上述“4”-“10”的实验研究，证明了青钱柳甜苷确实是一种从青钱柳叶中提取、精制后得到的具有强烈甜味的提取物；该提取物的指标成分正是被报道具有强烈甜味的化学成分碟卡苷A；以碟卡苷A为典型成分的结构特点是：具有2,3位裂环的达玛烷型三萜母核，含2个不饱和双键，并且连接一个异鼠李糖配糖基，而该结构特征与背景技术中定义的青钱柳甜苷所含主要成分的特征相一致。此外，该青钱柳甜苷具有确切的降脂活性。

对比青钱柳总黄酮、总三萜以及其他中药及天然产物提取物的研究，本发明中提及的青钱柳甜苷，是以甜度作为工艺指标，通过工艺筛选和优化后得到。脱离了甜度这项工艺指标，通常的提取、分离和精制等工艺操作，由于会造成甜味成分的损失，所以可能并不适用于青钱柳甜苷的制备。在获得青钱柳的甜味部位以后，虽然其甜味强烈，但苦涩味亦明显，并且该部位性状呈棕褐色至黄绿色半固体状，表明其共存大量色素等杂质，因而尚需进一步脱色精制。以甜度和脱色率作为工艺指标的脱色工艺研究表明，与青钱柳甜苷共存的色素类型复杂，常规的活性炭、硅胶、大孔吸附树脂、离子交换树脂等脱色剂，均无法在保证有效保留青钱柳甜味成分的前堤下，取得良好的脱色效果。通过筛选对比研究，氧化镁作为脱色剂，能够在较大程度保留青钱柳甜味成分的前堤下，取得较好的脱色效果；进一步研究发现，虽然活性炭单用时脱色效果一般，但与氧化镁联合，可以大大增强脱色效果，但需要控制两者的用量以及配比，否则可能造成脱色程度一般或者青钱柳甜味成分损失严重。最终，确定氧化镁和活性炭剂量配比为80:1作为复合剂，在合适的工艺参数条件下，所得青钱柳甜苷的品质较好、得率较高。

虽然青钱柳甜苷含有碟卡苷A等三萜皂苷，但其不同于一般意义中的、以齐墩果酸为代表的青钱柳总三萜，更加区别于青钱柳总黄酮、青钱柳总多糖等提取物。对青钱柳甜苷的提取，需要从原料以及对原料的处理入手，尽量保留甜味成分、防止甜味成分破坏，以及最大程度去除色素杂质，从而提高青钱柳甜苷的品质。具体而言，青钱柳嫩叶是优选的原料，并且提取之前采用石灰水预处理，可有效去除部分杂质，特别有利于后续的富集、纯化、脱色等工艺操作；由于以碟卡苷A为代表的甜味成分，含有多个不饱和键，具有化学不稳定性和热不稳定性，由此决定了对青钱柳甜苷的提取、精制等操作需要注意控制工艺参数，并随时关注物料甜度的变化。

上述具体实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。