一种肺癌类器官的培养基及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种肺癌类器官的培养基及其应用。

背景技术

肺癌是一种发病率较高的恶性肿瘤，晚期肺癌的果仍然欠佳。目前肺癌的治疗药物较多，化疗和靶向治疗发展的比较健全。对于肺癌病人，通常采取先基因检测，再选择药物的方式。但是，据统计仅有百分之50左右的病人能够在此种方式中获得合适的药物。肿瘤类器官（tumor organoid）是目前的前沿技术，不仅能够保留原发肿瘤的特点，保持不同病人肿瘤之间的差异性，而且能够保持同一个病人原发肿瘤内肿瘤细胞的异质性。肿瘤类器官还能准确地预测原发肿瘤的药物敏感性，是未来肿瘤病人个体化治疗的潜在工具。已有研究发现，利用肺癌类器官给病人筛选药物，准确率达到90%。然而，肺癌类器官培养液的成分复杂，技术门槛高，价格昂贵，限制了肺癌类器官在实验室研究中的普及。

发明内容

为了弥补目前肿瘤类器官培养技术门槛高、成功率低的不足，本发明对目前的肺癌类器官培养基进行了改进，提供一种新的培养液配方，可以降低成本并提高类器官的活性。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：

一种肺癌类器官的培养基，在肺癌类器官培养基中加入特丁基对苯二酚Tert-Butylhydroquinone，培养液的最终成分为：特丁基对苯二酚、纤维母细胞生长因子-10、头蛋白、A83-01、DMEM/F12培养基、Rspo-1条件培养基、烟酰胺、N-乙酰半胱氨酸、GlutaMax。

作为优选的方案，培养基中含有的特丁基对苯二酚浓度为0.01-100 µmol/L。

本发明还提供所述的肺癌类器官的培养基在类器官培养中的应用。

进一步的，所述的类器官培养包括人肺癌类器官培养和小鼠肺癌类器官培养。

有益效果：

1、本发明在传统的类器官培养液中添加的特丁基对苯二酚价格低廉，不会显著增加类器官培养的成本。

2、本发明的类器官培养液在肺癌类器官的培养中，细胞增殖速率高于不含特丁基对苯二酚的传统肺癌类器官培养液。

附图说明

图1：收取肺癌病人的肿瘤组织标本后，分成两份，建立肺癌类器官，培养3天后的电镜图像；图中1A为其中一份肺癌类器官用不含特丁基对苯二酚的传统培养液培养，图中1B为另一份肺癌类器官用含特丁基对苯二酚的传统培养液培养。

图2：建立肺癌类器官后，用CellTiter Glo检测培养3天后肺癌类器官的活性图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

制备含特丁基对苯二酚的肺癌类器官培养基：

在肺癌类器官培养基中加入特丁基对苯二酚Tert-Butylhydroquinone，培养基的最终成分为：特丁基对苯二酚、纤维母细胞生长因子-10、头蛋白、A83-01、DMEM/F12培养基、Rspo-1条件培养基、烟酰胺、N-乙酰半胱氨酸、GlutaMax。

其中，培养基中含有的特丁基对苯二酚浓度为0.01-100 µmol/L。

实施例2

肺癌肿瘤组织的建立：

1．将手术切除的肺癌肿瘤组织放入含有10ml DMEM培养液的15ml离心管中，运送到实验室；用镊子将标本从样本运送管中取出，放入空的10cm培养皿中，用一次性无菌手术刀切成碎片，每块均小于0.5X0.5X0.5mm。

2．将切碎后的肿瘤组织转移到15ml离心管中，加入3ml 胶原酶，放入摇床中37℃震荡10分钟。

3．取出离心管，在超净台内室温竖直放置30s，此时肿瘤组织已沉降到管子底部；用1ml移液器吸出全部上清，转移到新的15ml离心管中，将新的离心管放在冰上；在沉降的肿瘤组织中再加入3ml的胶原酶。再次放入摇床中37℃震荡10分钟。

4．重复步骤3一次；其中，将后一次吸出的上清液直接加入到前一次的上清液中。

5. 400 g离心10分钟后，弃上清。

6.在细胞沉淀中加入5ml红细胞裂解液，轻轻吹打后，立即400 g离心10分钟。

7.弃上清后，用5ml DMEM培养液重悬细胞，轻轻吹打混匀后，400 g离心10分钟。

8.弃上清后，每管加入300微升的Matrigel重悬细胞，并分别接种到24孔板中，每孔50微升；之后立即放入37℃培养箱中10分钟。

实施例3

培养基培养肿瘤组织并测定活性：

1.收取6例肺癌病人的肿瘤组织标本后，每例分成两份，为试验组和对照组，按实施例2的步骤分别建立肺癌肿瘤组织；在Matrigel固化后，每例共建立6个孔的类器官，其中3个孔采用传统培养基，为对照组，另外3个孔采用含有特丁基对苯二酚的培养基，为试验组；在Matrigel固化后，对照组每个孔加入2ml的不含有特丁基对苯二酚的传统培养液，试验组每个孔加入2ml的实施例1制备的含特丁基对苯二酚的培养液。

2.培养3天后，观察肺癌类器官的生长情况，相比于不含特丁基对苯二酚的培养液（图1A），含有特丁基对苯二酚的培养液能够显著促进肺癌类器官的生长（图1B）。

3.用CellTiter Glo检测了培养3天后肺癌类器官的活性；结果显示，特丁基对苯二酚能够显著提高肺癌类器官的活性（图2）。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。