一株重组毕赤酵母及其在高效制备14α-羟基孕酮中的应用

技术领域

本发明涉及发酵工程技术领域，具体涉及一种重组毕赤酵母及其构建方法和其在高效制备14α-羟基孕酮中的应用。

背景技术

甾体类药物是一类具有广泛药理和生理活性的药物，常被应用于临床治疗。在抗病毒、抗炎、抗肿瘤、抗癌细胞活性、免疫调节和生育控制等方面具有极其重要的作用。甾体化合物的结构复杂，其生理及药理活性取决于甾体母核特定位点的取代基。

14α-羟基甾体化合物具有抗癌生物活性和特殊的促性腺激素作用。例如孕酮的14α-羟基衍生物14α-羟基-孕甾-4-烯-3，20-二酮可以作为替代化学合成途径的药物前体，生成一种广泛应用于兽用避孕及治疗的高活性抗促性腺激素药物普罗孕酮的前体；雄烯二酮(AD)的14α-羟基衍生物14α-羟基-4-烯-3，17-二酮，可以作为合成14α-羟基-4-烯-3，6，17-三酮的前体，且14α-羟基-4-烯-3，6，17- 三酮被证明能够抑制人体胎盘和子宫肿瘤的芳香酶活性和雌激素的合成，并可用于乳腺癌或雌激素依赖性子宫肿瘤的化疗。除了用于抗炎及避孕外，其中几种 14α-羟基甾体化合物还表现出抗肿瘤活性。除此之外，14α-羟基构型可以转化为有心脏活性类固醇结构特征的14β-构型，14β-羟基甾体化合物的衍生物是重要的心肌收缩增强剂。据报道，14-OH-5β，14β-孕甾烷的C-3糖苷衍生物已被证明与心肌的糖苷受体会产生强烈的相互作用。

目前主要利用新月弯孢霉甾体羟化酶的酶促反应，在孕酮的C14α位引入羟基，但它无法进一步积累14α-羟基孕酮，并且使用新月弯孢霉存在一些潜在的应用缺陷。一方面，新月弯孢霉生长缓慢，产孢量较弱，液体培养时很难控制其形态同质性。另一方面，新月弯曲霉构成了潜在的安全风险，因为据报道，这种真菌可能会在人类中引起几种类型的感染，如角膜炎和皮肤病。相比之下，酵母以其自然优势而闻名，如快速生长、成熟的基因操作和使用安全。而在使用酿酒酵母进行甾体转化时，投料量较低，且酿酒酵母本身能够代谢大多数甾体底物，而产生更多副产物，不适用于构建甾体羟化酶工程菌。并且甾体底物大多数都难溶于水，需要使用有机溶剂助溶，但有机溶剂对细胞有一定的毒性。对于毕赤酵母而言，它能够达到高密度发酵，可以提高底物投料量，并且它能够在以甲醇为唯一碳源的培养基上生长，因此用毕赤酵母作为羟化酶的工程菌，甲醇既作为碳源，又可作为助溶剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组毕赤酵母及利用重组毕赤酵母高效制备 14α-羟基孕酮的方法，本发明解决了以孕酮为底物生产14α-羟基孕酮产量低、特异性差(甾体孕酮羟化产物特异性不高)的技术问题，实现了14α-羟基孕酮的高效生产。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种重组毕赤酵母，所述重组毕赤酵母是在毕赤酵母基因组中插入新月弯孢霉甾体C14α羟化酶突变体基因CYP5103B5-Y10；

所述新月弯孢霉甾体C14α羟化酶突变体基因CYP5103B5-Y10插入毕赤酵母基因组His4位点；

所述新月弯孢霉甾体C14α羟化酶突变体基因CYP5103B5-Y10的核苷酸序列如SEQID NO.1所示；

本发明还提供了上述方案所述重组毕赤酵母的构建方法，包括以下步骤：

S1.将新月弯孢霉甾体C14α羟化酶突变体基因CYP5103B5-Y10插入到 pPIC3.5K中，得到重组质粒；

S2.将所述重组质粒经限制性内切酶Sal I线性化后，电击转化至毕赤酵母，得到重组毕赤酵母。

优选的，所述新月弯孢霉甾体C14α羟化酶突变体基因CYP5103B5-Y10在 pPIC3.5K中的插入位点为EcoR I和Not I。

优选的，步骤S2中所述毕赤酵母包括GS115。

本发明还提供了上述方案重组毕赤酵母在高效制备14α-羟基孕酮中的应用，包括以下步骤：

(1)将所述重组毕赤酵母接种于种子培养基，30℃，200r/min振荡培养16-18 h，OD

(2)将所述种子液接种至发酵培养基，于30℃且溶氧量高于20％条件下进行发酵培养，至发酵体系中甘油耗尽；

(3)在所述发酵体系中甘油耗尽后，流加200mL 50％甘油微量元素水溶液，调节流加速度，当DO低于20％时停止流加，当甘油流加150-160mL时停止流加，使菌体保持饥饿状态1h。

(4)在所述菌体保持饥饿状态1h后，将孕酮与甲醇按照比例配制混合溶液，每升甲醇中事先添加12mL微量元素母液，溶有孕酮的甲醇溶液采用流加的方式进行补料。DO维持15％以上，当DO低于15％时，停止流加。底物转化若干小时直至发酵结束。

有益效果：

本发明提供了一种重组毕赤酵母，所述重组毕赤酵母是在毕赤酵母基因组中插入新月弯孢霉甾体C14α羟化酶突变体基因CYP5103B5-Y10。本发明的重组毕赤酵母能够高特异性转化孕酮，进而高效制备14α-羟基孕酮。

本发明还提供了上述方案所述重组毕赤酵母在高效制备14α-羟基孕酮中的应用，包括以下步骤：重组毕赤酵母种子培养、菌体生长、菌体补料生长、诱导产酶和孕酮转化；本发明采用毕赤酵母全细胞边诱导边催化的方式，实现孕酮转化高投料量，以及14α-羟基孕酮的高效制备。

附图说明

图1为重组质粒pPIC3.5K-CYP5103B5-Y10结构示意图；

图2为重组质粒pPIC3.5K-CYP5103B5-Y10转化毕赤酵母GS115基因组示意图；

图3为重组质粒pPIC3.5K-CYP5103B5-Y10转化毕赤酵母GS115基因组PCR 鉴定图；

图4为重组毕赤酵母转化孕酮HPLC图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例中涉及到的培养基配方如下：

LB培养基：5g酵母粉，10g蛋白胨，10g氯化钠，1L去离子水溶解。

YPD培养基：10g酵母粉，20g蛋白胨，20g葡萄糖，1L去离子水溶解。

YPG培养基：10g酵母粉，20g蛋白胨，20g甘油，1L去离子水溶解。

MD培养基：20g葡萄糖，18g琼脂粉，900mL去离子水溶解，115℃高温高压灭菌20min，冷却至60℃后加入13.4％YNB，0.02％生物素。

发酵培养基：85％磷酸、0.93mL/L CaSO

本发明中涉及菌株：毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)，天津科技大学微生物菌种保藏中心。

实施例1：重组质粒pPIC3.5K-CYP5103B5-Y10的构建

1.目的基因扩增

以质粒pYES2-CYP5103B5-Y10为模板，设计带有EcoR I、Not I酶切位点的上下游引物，进行PCR扩增，引物由北京华大基因公司进行合成。

F：GAATTCATGGATCCCCAGACCGTC

R：GCGGCCGCCTACACAACAACCCTCTTG

(1)PCR反应体系(25μL)：

(2)PCR反应条件：

2.PCR产物的纯化和酶切

50μL PCR产物经Dpn I酶(0.5μL)放置于37℃恒温培养箱内消化模板3h 后，在70℃的金属浴中放置20min(灭酶活)，利用小量DNA纯化试剂盒对 PCR扩增片段进行纯化回收，再经Not I和EcoR I酶进行双酶切3h后，对其产物进行纯化回收。

3.与载体骨架的连接

带有相同的Not I、EcoR I酶切位点的上述PCR纯化片段和pPIC3.5K片段进行体外连接。载体pPIC3.5K-CYP5103B5-Y10构建如图1。

将上述混合物置于金属浴22℃，连接3h，之后化转至Ecoli JM109，涂布于含Amp

4.验证转化子

待平板上长出单菌落后，挑选3个大小均匀适中的单菌落密集划线，继续 37℃恒温倒置培养8～12h。提质粒后经Not I、EcoR I双酶切验证正确后，即得到重组质粒pPIC3.5K-CYP5103B5-Y10。

实施例2：重组毕赤酵母14α-羟化酶工程菌的构建

将重组质粒pPIC3.5K-CYP5103B5-Y10经限制性内切酶Sal I线性化，电转至毕赤酵母GS115感受态细胞中，按照常规方法培养，遗传霉素G418抗性筛选高拷贝菌株，获得重组毕赤酵母14α-羟化酶工程菌。图2是重组毕赤酵母构建图，图3是最终获得毕赤酵母14α-羟化酶工程菌基因组PCR鉴定图。

实施例3：重组毕赤酵母14α-羟化酶工程菌株5L发酵系统转化孕酮高投料工艺的建立

1.种子悬液培养：

将重组毕赤酵母菌株接种在含有抗性筛选标记的YPD平板上，30℃培养2-3 天，挑取单菌落接种于YPG液体培养基中，30℃，200r/min振荡培养24h，此时菌液为一级种子。从一级种子液中分别吸取适量菌液，接种于两瓶100mL YPG 液体培养基中，使得初始菌密度为0.2，30℃，200r/min振荡培养16-18h，至 OD

2.发酵罐准备：

(1)空消：在培养一级种子液时，期间先对发酵罐进行空消，除去上次罐中残留的菌液，并且对各种补料瓶进行灭菌，121℃，20min。取出降至室温后，对罐体的气密性进行检查，对溶氧电极和pH电极进行活化，并对补料泵和检泵进行流速校对。

(2)实消：按照2.5L初始装液量先配制2.1L无机盐(BSA)培养基，溶解均匀后倒入发酵罐中，并对pH电极利用标准液4.0和6.86进行校准，校准后将pH电极插入罐体中，检查各部分安装，121℃，灭菌30min进行实消，灭菌后取出，开始连接进气阀检查罐体的气密性并利用自来水进行降温，待温度降至 30℃，气密性无误后连接pH电极线，并对溶氧(DO)电极进行校准，利用氨水和磷酸调控pH至5.0左右，罐体温度通过连接水龙头和发热套将温度自控在 30℃左右，空气流速维持在3NI/min，初始转速控制在250rpm。

(3)上罐接种：取200mL OD

(4)菌体生长阶段：温度自控在30℃左右，pH通过氨水和磷酸维持5.0左右，DO通过与转速关联，当DO低于50％时，即增加转速维持DO 50％以上。等罐中碳源(甘油)耗尽后，DO快速上升，进入补料生长阶段。

(5)补料生长阶段：流加200mL 50％甘油，调节流加速度，DO维持20％以上，将DO与补料泵相关联，当DO低于20％时，停止流加。当甘油流加150-160 mL时停止流加，此时DO快速上升，使菌体保持饥饿状态使甘油再次耗尽，1h 后进入诱导产酶阶段。

(6)诱导产酶及孕酮转化阶段：按照10g/L孕酮与甲醇溶解比例配制混合溶液(称量好的孕酮事先于超净台中紫外灭菌15min)，每升甲醇中事先添加 12mL微量元素母液，溶有孕酮的甲醇溶液采用流加的方式进行补料。此阶段仍然将DO与补料相关联，DO维持15％以上，当DO低于15％时，停止流加。初始流加速率为9mL/h，2h后，流加速率提高至18mL/h，2h后，流加速率提高至27mL/h后不再变化，底物转化若干小时直至发酵结束。

实施例4：底物转化分析

将上述发酵转化产物进行HPLC高效液相色谱检测，用300μL乙酸乙酯萃取1mL发酵液，吸取100μL上清液至干净的EP管中通风橱晾干，后加200μL 流动相液体于晾干的EP管中，混合均匀后制备液相样品，进行HPLC检测，结果如图4所示，HPLC结果进一步表明该菌株的高转化率，14α-羟基孕酮的得率约为7.8g/L。

液相条件如下：

流动相A：流动相B＝甲醇∶水＝70％∶30％；

温度：25℃；

流速：1.0mL/min；

进样量：10μL；

检测波长：254nm；

进样时间：22.5min。

上述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，但其并非用以限定本发明。应当指出的是，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，上述各实施方式还可以做出若干改进。因此，本专利的保护范围应以权利要求书所限定的内容为准。