一株芽孢杆菌及其在石油污染治理修复中的应用

技术领域

本发明属于微生物和环保技术领域，具体涉及一株芽孢杆菌及其在石油污染治理修复中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

目前，石油污染分布广泛，石油污染是我国面临的主要污染问题之一，某些地区由于石油污染导致环境恶化甚至危害到人类的生命健康。石油烃组分非常复杂，且与水不互溶，严重限制了微生物处理过程中微生物与污染物石油的接触面积。

目前工业上采用的乳化剂多为化学合成，生物乳化剂相较于化学合成的乳化剂在使用过程中不产生二次污染，对原著微生物没有毒害和抑制作用，具有环保安全的特点。因此生物乳化剂的研究成为石油污染治理中的又一热点问题。而目前石油污染多会带来盐度、碱度及重金属污染的改变，筛选应对复杂环境的微生物成为解决微生物修复石油污染的又一难题。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供一株芽孢杆菌及其在石油污染治理修复中的应用，经试验证明，该芽孢杆菌产生的乳化剂可以减少分子的表面张力，增大微生物与污染物的接触面积，提高污染物降解效率，同时该菌株对盐碱、高低温、镉金属胁迫环境具有良好耐受性，从而可用于石油污染特别是复杂环境中石油污染的治理修复，因此具有良好的实际应用之价值。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明的第一个方面，提供一株芽孢杆菌，其命名为芽孢杆菌Bacillus sp.Z-13，该菌株已于2021年12月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号)，保藏编号为CCTCC NO：M 20211594。

本发明的第二个方面，提供一种菌剂，其包含上述第一方面所述的芽孢杆菌或其发酵物或其代谢产物。

本发明的第三个方面，提供上述芽孢杆菌或上述菌剂作为乳化剂特别是石油乳化剂中的应用。

本发明的第四个方面，提供上述芽孢杆菌或上述菌剂在如下任意一种或多种中的应用：

a)石油乳化；

b)石油降解；

c)石油污染治理；

d)石油污染修复。

更具体的，所述应用中，应用环境可以为盐碱、高低温和/或重金属污染环境。

本发明的第五个方面，提供一种石油污染环境的治理和/或修复方法，所述治理和/或修复方法包括向所述石油污染环境中施加上述芽孢杆菌或上述菌剂。

具体的，所述石油污染环境可以为石油污染水体和石油污染土壤。

上述一个或多个技术方案的有益效果：

上述技术方案提供一株芽孢杆菌，该菌株能够产生生物表面活性物质，有好的乳化效果，该菌对盐碱、高低温、镉金属胁迫具有良好的耐受性，具有耐盐碱、高低温、镉金属胁迫的广谱性，从而可用于石油污染的修复和治理，具有很好的应用前景。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为菌株Z-13的菌落平板培养照片。

图2为菌株Z-13系统发育树。

图3为菌株Z-13乳化照片。

图4为菌株Z-13在不同盐度下的生长曲线。

图5为菌株Z-13在不同盐度下的乳化能力。

图6为菌株Z-13在不同碱度下的生长曲线。

图7为菌株Z-13在不同碱度下的乳化能力。

图8为菌株Z-13在不同温度下的生长曲线。

图9为菌株Z-13在不同温度下的乳化能力。

图10为菌株Z-13在不同镉浓度下的生长曲线。

图11为菌株Z-13在不同镉浓度下的乳化能力。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

如前所述，目前石油污染多会带来盐度、重金属或者温度的改变，筛选应对复杂环境微生物成为解决微生物修复石油污染的又一难题。

有鉴于此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一株芽孢杆菌，其命名为芽孢杆菌Bacillus sp.Z-13，该菌株已于2021年12月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号)，保藏编号为CCTCC NO：M 20211594。

为了便于陈述，本发明所述芽孢杆菌Bacillus sp.Z-13在申请文件中也会简写为菌株Z-13或Z-13。

本发明的菌株Z-13可在LB培养基中培养，其形成湿润光滑橘黄色较不规则菌落，同时，其能够利用利用葡萄糖、无水乙酸钠和有机质作为碳源，最适温度为27℃，最适pH为7。

经试验证明，Z-13在盐度为0-8％范围下可生长，具有良好的耐盐性，盐度0-8％下均可产生表面活性物质，乳化指数可达55％；同时，其在pH为5.00-10.00的范围内可以生长，适应范围广，有较好的耐碱性；Z-13乳化指数可达50％；在pH6.00-9.00下可产生表面活性物质，且稳定性好；Z-13在温度为15℃-45℃范围下可生长，具有良好的耐高低温的能力，温度为15℃-45℃均可产生表面活性物质，乳化指数可达50％；Z-13在镉离子含量为10mg/L-20mg/L范围下可生长，具有良好的耐镉胁迫的能力，镉离子含量为10mg/L-20mg/L范围下均可产生表面活性物质，乳化指数可达55％。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种菌剂，其活性成分包含上述第一方面所述的芽孢杆菌或其发酵物或其代谢产物。

术语“发酵物”用于指代发酵产品。相应的发酵物可以是从发酵培养芽孢杆菌Z-13细菌的过程获得的液体，因此，也可称为发酵液；液体可以含有细菌(菌体)，但并不必然需要含有细菌。液体优选的含有由本发明的菌株Z-13产生的代谢物。

以及，在本发明的实施方式中，包含菌体的发酵液或培养液经离心、过滤、沉降或所属领域中已知的其他手段将在发酵液或培养液中生长的菌体细胞与液体分离，去除菌体细胞时所剩余的液体为“上清液”，并且在本发明中，上清液内含有菌株Z-13的胞外代谢产物。在本发明的实施方式中，所述菌剂也可以包含该上清液。

以及，在本发明的实施方式中，包含菌体的发酵液或培养液经离心、过滤、沉降或所属领域中已知的其他手段将在发酵液或培养液中生长的菌体细胞与液体分离获取菌体，菌体可进行破碎获取菌体破碎物，破碎方式可以为超声(比如冰浴超声破碎细胞)或者本领域已知的其他手段，或者，更进一步的，对该菌体破碎物离心收集上清液，该上清液记为无细胞提取物，并且在本发明中，该菌体破碎物或无细胞提取物内含有菌株Z-13的胞内代谢产物。在本发明的实施方式中，所述菌剂也可以包含该菌体破碎物或无细胞提取物。

以及，在本发明的实施方式中，所述菌剂，其制备方法如下：将菌株Z-13接种至LB培养基中进行培养即得。

其中，所述LB培养基溶剂为水，溶质及其浓度分别为：10g/L氯化钠、10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母粉，pH7。

所述菌剂中，除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为菌剂领域常用的且在生物学上是惰性的载体。

所述载体可为固体载体或液体载体；

所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇或/和聚二醇；

所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷或/和十二烷。

所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

根据需要，所述菌剂中还可添加粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)等，在此不做具体限定。

在本发明的一个具体实施方式中，上述芽孢杆菌或上述菌剂可作为乳化剂特别是石油乳化剂使用。

在本发明的一个具体实施方式中，提供上述芽孢杆菌或上述菌剂在如下任意一种或多种中的应用：

a)石油乳化；

b)石油降解；

c)石油污染治理；

d)石油污染修复。

在本发明的一个具体实施方式中，所述应用中，应用环境可以为盐碱、高低温和/或重金属污染环境。

其中，所述盐碱环境具体可以为盐度在不高于8％，pH不高于10(进一步不高于9)的盐碱环境；

所述高低温环境温度可以为15-45℃；

所述重金属污染环境可以为镉污染环境，其中镉离子浓度可以为不高于20mg/L，包括10mg/L-20mg/L。

在本发明的一个具体实施方式中，提供一种石油污染环境的治理和/或修复方法，所述治理和/或修复方法包括向所述石油污染环境中施加上述芽孢杆菌或上述菌剂。

所述石油污染环境可以为复杂环境，包括但不限于盐碱、高低温和/或重金属污染环境；其中，所述盐碱环境具体可以为盐度在不高于8％，pH不高于10(进一步不高于9)的盐碱环境；

所述高低温环境温度可以为15-45℃；

所述重金属污染环境可以为镉污染环境，其中镉离子浓度可以为不高于20mg/L，包括10mg/L-20mg/L。

在本发明的一个具体实施方式中，所述石油污染环境可以为石油污染水体和石油污染土壤。

实施例1、产表面活性剂菌株的分离、鉴定及保藏

一、产表面活性剂菌株的分离

按照常规的菌株筛选方法，称取山东省东营市胜利油田获得的石油污染土10g土于三角瓶中，加入90mL的生理盐水，振荡半小时，取上清液0.9mL于10mL离心管中逐级稀释成10

在本实施例中，通过初步筛选，发现能够很好乳化的菌株，经过上述培养，分离出一株产表面活性剂的菌株，命名为Z-13。

本实施例的菌株Z-13可以采用如下保藏方法：

(1)短期保存：将上述菌株于斜面培养基上划线，经27℃，48h培养后，4℃保藏。

(2)长期保存：采用甘油冷冻保存法：取在LB液体培养中活化后的菌液0.5mL转入到已装有1mL30％灭菌甘油甘油中，-80℃冷冻保存。本实施例所筛选到的芽孢杆菌Z-13于2021年12月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮编430072)。

二、Z-13菌株的鉴定

1、Z-13菌株的鉴定形态鉴定

Z-13菌株的鉴定形态鉴定：在LB固体平板上为湿润光滑橘黄色较不规则菌落如图1。

2、Z-13菌株的生理生化鉴定

Z-13菌株的生理生化特征：能够利用葡萄糖、无水乙酸钠和有机质作为碳源，最适温度为27℃，最适pH为7。

3、Z-13菌株的分子鉴定

将活化的Z-13菌株接种在LB液体培养基中，27℃、180rpm震荡培养24h.取1mL新鲜培养菌液4℃、8000rpm离心5min，收集菌体于2mL离心管中，采用DNA提取试剂盒提取DNA。电泳检测后，分别采用16S rDNA基因通用引物7F/1540R进行PCR扩增。PCR产物电泳检测后，测定16S rDNA基因序列，16S rDNA基因具体序列如SEQ D NO.1所示。

16S rDNA基因序列经过对比后属于Bacillus菌属，基于16S rDNA基因使用软件MEGA构建的系统发育树如图2所示。综合上述，鉴定其为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)。

三、Z-13菌株的保藏

Z-13菌株的分类命名为芽孢杆菌Bacillus sp.，该菌株已于2021年12月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮编430072)，保藏编号为CCTCC M 20211594。

实施例2、Z-13菌株的乳化

1、将活化后的Z-13接种至LB培养基中，27℃，180rpm培养24h，得到Z-13菌液。

2、取30mL菌液于50mL离心管中在4℃，4000rpm下离心5min,得到上清液，取5mL上清液于10mL离心管，加入等体积的煤油，涡旋2min，静置24h，测定乳化指数。

实施例3、Z-13菌株的耐盐性

1、将活化后的Z-13接种至盐度为0-11％的培养基中，按1％的比例接种菌液，27℃，180rpm培养24h，得到Z-13菌液，测定其OD

2、取30mL菌液于50mL离心管中在4℃，4000rpm下离心5min，得到上清液，取5mL上清液于10mL离心管，加入等体积的煤油，涡旋2min，静置24h，测定乳化指数。

测定其生长曲线和不同盐度的乳化能力如下图4、5所示。

Z-13在盐度为0-8％范围下可生长，具有良好的耐盐性，盐度0-8％下均可产生表面活性物质，乳化指数可达55％。

实施例4、Z-13菌株的耐碱性

1、将活化后的Z-13接种至pH为5-10的培养基中，按1％的比例接种菌液，27℃，180rpm培养24h，得到Z-13菌液，测定其OD

2、取30mL菌液于50mL离心管中在4℃，4000rpm下离心5min，得到上清液，取5mL上清液于10mL离心管，加入等体积的煤油，涡旋2min，静置24h，测定乳化指数。

测定其生长曲线和不同碱度的乳化能力如图6、7所示。

Z-13在pH为5.00-10.00的范围内可以生长，适应范围广，有较好的耐碱性；Z-13乳化指数可达50％。Z-13在pH6.00-9.00下可产生表面活性物质，且稳定性好。

实施例5、Z-13菌株的耐温能力

1、将活化后的Z-13接种培养基中，按1％的比例接种菌液，分别在15℃、25℃、35℃、45℃下，180rpm培养24h，得到Z-13菌液，测定其OD

2、取30mL菌液于50mL离心管中在4℃，4000rpm下离心5min，得到上清液，取5mL上清液于10mL离心管，加入等体积的煤油，涡旋2min，静置24h，测定乳化指数。

测定其生长曲线和不同温度的乳化能力如下图8、9所示。

Z-13在温度为15℃-45℃范围下可生长，具有良好的耐高低温能力，均可产生表面活性物质，乳化指数可达50％。

实施例6、Z-13菌株的耐镉胁迫能力

1、将活化后的Z-13接种至镉离子浓度为10mg/L和20mg/L的培养基中，按1％的比例接种菌液，27℃，180rpm培养24h，得到Z-13菌液，测定其OD

2、取30mL菌液于50mL离心管中在4℃，4000rpm下离心5min，得到上清液，取5mL上清液于10mL离心管，加入等体积的煤油，涡旋2min，静置24h，测定乳化指数。

测定其生长曲线和不同镉离子浓度下的乳化能力如下图10、11所示。

Z-13在10mg/L和20mg/L的镉离子浓度下可生长，具有良好的耐镉胁迫能力，均可产生表面活性物质，乳化指数可达55％。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。