一种偶联的CRISPR和毒素-抗毒素元件及其在消杀耐药细菌中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及消杀耐药细菌的基因元件和方法，更具体涉及偶联的CRISPR和毒素-抗毒素元件及其在消杀耐药细菌中的应用。

背景技术

抗生素的滥用导致耐药细菌的频繁产生，已经成为全球生命健康最严重的威胁之一。随着新型抗生素的研发速度进入瓶颈期，人类亟需开发新型的杀菌技术，尤其是针对耐药细菌的消杀技术,以控制耐药性的传播。CRISPR-Cas是细菌防御噬菌体侵染的特异性免疫系统，Cas蛋白在crRNA（CRISPR RNA）的指导下，基于其与噬菌体DNA之间的序列匹配识别并切割噬菌体DNA，从而实现特异性免疫。通过改造crRNA的碱基序列，人们可以重编程Cas蛋白的DNA切割靶向性，例如，使其特异地切割细菌基因组序列，可以实现对细菌的消杀，称为CRISPR杀菌技术（Robert J Citoriket al., Sequence-specificantimicrobialsusing efficiently delivered RNA-guided nucleases. Nat Biotechnol.2014 Nov;32(11):1141-5; David Bikard et al., Exploiting CRISPR-Cas nucleases to producesequence-specific antimicrobials. Nat Biotechnol. 2014 Nov;32(11):1146-50）。

CRISPR杀菌技术具有很高的特异性，比如，通过设计向导（guide）RNA（简称gRNA，即crRNA的人工类似物）使CRISPR靶向切割特定的耐药基因，可以实现对耐药菌的特异性消杀，而对不携带该耐药基因的菌株没有消杀作用。抗生素的滥用往往给菌群带来选择压力，愈发促进耐药细菌的产生和流行；而利用CRISPR杀菌技术可以特异地消杀菌群中的耐药细菌，从而促进非耐药细菌对生态位的“占据”，有效遏制耐药细菌的传播，因此，CRISPR杀菌技术为解决耐药问题提供了重要方案。然而，由于抗生素的滥用及其在土壤、医院等环境中的残留，耐药基因无疑给细菌带来了进化上的选择优势，加上CRISPR消杀本身带来的“适应性代价（fitnesscost）”，微生物往往倾向于丢失或破坏CRISPR-Cas元件，比如，利用各种活跃的转座因子破坏cas基因，或利用广泛存在的anti-CRISPR蛋白失活CRISPR-Cas复合物，这些因素造成了CRISPR-Cas元件的不稳定性，并大大降低CRISPR技术对耐药菌的消杀效率，因此，CRISPR-Cas元件的稳定性是限制CRISPR杀菌技术效果的关键因素（Ruben VUribeet al.,Bacterial resistance to CRISPR-Cas antimicrobials.Sci Rep. 2021Aug 26;11(1): 17267）。

如上所述，CRISPR-Cas元件的稳定性是限制CRISPR杀菌技术效率的重要因素。2015年，以色列科学家UdiQimron提出了联合利用CRISPR-Cas元件和烈性噬菌体的策略（见图7），即将gRNA的靶点序列（耐药基因的一段序列）插入到一个人工烈性噬菌体上，从而使gRNA在靶向耐药基因的同时靶向该噬菌体DNA，这样，在向菌群中递送CRISPR-Cas元件后再引入烈性噬菌体时，后者会侵染并杀死那些保留耐药基因而破坏CRISPR-Cas元件的细菌个体，从而为提高CRISPR-Cas元件在菌群中的稳定性提供了进化上的驱动力(Ido Yosefetal.,Temperate and lytic bacteriophages programmed to sensitize and killantibiotic-resistant bacteria.Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Jun 9; 112(23):7267–7272.)。然而，该技术在实际应用中存在诸多限制。

首先，需要针对要消杀的目标耐药菌株筛选到可用的烈性噬菌体，而由于噬菌体往往具有高度的宿主特异性，即对同一物种中不同菌株的侵染能力差异很大，这严重限制了该技术在复杂的自然菌群中的实际应用。

其次，需要对烈性噬菌体进行人工改造（插入耐药基因的部分序列作为gRNA靶点），使其能够被靶向耐药基因的gRNA同时靶向，这就需要针对不同耐药基因设计不同的联用噬菌体，缺乏通用性(Ido Yosefet al.,Temperate and lytic bacteriophagesprogrammed to sensitize and kill antibiotic-resistant bacteria. Proc NatlAcad Sci U S A. 2015 Jun 9; 112(23): 7267–7272.)。

再次，需要在制备CRISPR-Cas元件递送载体（慢性噬菌体或结合质粒等）的同时制备联用的烈性噬菌体，操作流程繁琐，而且噬菌体之间往往存在竞争关系，用于递送CRISPR-Cas元件的慢性噬菌体可能会影响烈性噬菌体的侵染效率。

因此，联用烈性噬菌体的CRISPR消杀策略通用性差，分子设计和操作繁琐。

发明内容

本发明人研究发现，许多I型的CRISPR-Cas系统附近存在护卫RNA元件——CreTA，即一对毒素（creT）和抗毒素（creA）基因，后者产生一个crRNA类似物（称为CreA RNA）,可以指导CRISPR效应物结合在creT毒素基因的启动子DNA处（但不发生DNA切割），从而抑制毒素基因的转录。因此，CRISPR效应物一旦被破坏，creT毒素基因就会表达并杀死细菌，从而使细菌对CRISPR-Cas元件“成瘾”，提高其在菌群中的稳定性。CRISPR护卫RNA的发现被认为定义了一种全新的毒素-抗毒素（toxin-antitoxin，简称TA）类型，被命名为VIII型。重要的是，CreTA往往是两个非编码小RNA，基因序列非常短（共约200-300 bp），非常便于合成设计。

在此基础上，本发明提出了联用CRISPR和这一新型TA元件，提高CRISPR-Cas元件在菌群中的稳定性，实现CRISPR杀菌和TA杀菌双重效应的新策略，并以临床中耐药问题最为严重的鲍曼不动杆菌为例，进行了实施例验证。相比烈性噬菌体联用策略，该策略仅需在递送的CRISPR-Cas元件中内置小巧的CreTA元件即可显著提高其稳定性，无需针对消杀的目标菌株筛选和改造烈性噬菌体等繁琐流程；且CreTA介导的“成瘾”回路不依赖于gRNA及其靶标基因，因此适用于针对多种耐药基因的CRISPR消杀设计。综上，本发明提供的联用CRISPR和毒素-抗毒素精准高效消杀耐药细菌的方法，具有更高的可操作性和通用性。

pCRETA质粒携带编码Cas蛋白的cas3-csy操纵子，一个双spacer的mini-CRISPR结构，和一个毒素基因（creT）。mini-CRISPR的一个spacer序列为creA的ψS序列，与creT的启动子匹配，产生的crRNA指引Csy复合物抑制creT毒素基因的表达；另一个spacer序列靶向临床耐药菌株基因组上的耐药基因（antibiotic-resistantgene，简称AR）。该质粒以转化、接合或纳米颗粒等方式导入耐药菌后，如果Csy复合物正常发挥功能，将在Cas3的协助下产生CRISPR杀菌效应——切割AR基因，导致细菌死亡或（经DNA修复过程后）AR基因丢失；如果Csy复合物被转座子或anti-CRISPR蛋白等破坏失活，将释放毒素基因表达，产生TA杀菌效应。

本发明提供一种由毒素元件和抗毒素元件组合构成的偶联元件,其中两者直接连接在一起，或并不连接在一起而组合构成所述元件。其中毒素元件含有启动子序列(例如启动子可以是常用的tac启动子或者J23119启动子序列，优选为PcreT启动子)，SD序列及mini-ORF毒素序列元件，用于表达毒素；抗毒素元件含有PcreA启动子序列(例如启动子可以是常用的tac启动子或者J23119启动子序列，优选为PcreA启动子)和类mini-CRISPR结构（如图2d所示第一个repeat序列可以不保守但有保守的茎环结构,第二个repeat序列和结构都非常保守），可以经转录加工产生CreA RNA。

其中，启动子序列是可以替换的，只要其creA 对应的ψS序列也相应替换以便能够具有启动子功能即可。

具体地，所述毒素元件和抗毒素元件直接连接，或者分别在同一载体的不同位置，或者分别在不同载体上偶联构成所述元件。其中，毒素元件也可以任意的毒素元件，其只要能表达出毒素即可，例如可以是其它蛋白类毒素或者RNA毒素，如常用的MazF，ccdB蛋白，优选为

优选地，所述毒素元件的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：

TACTTAGTAATGATAAGTCTTTTTATTTTACATAGAAATAGCTTGTGGAATAAAAGAAAAATCTGTATTTTACTTGTTATGGTTACTTTTAGTTTGAATTAAAGTAACTAGGTTTAATATTTAAATAAAGATTAACCATCGATCTGGCAGGATCACACATCACCCGATAGGGTAAGGGGGAAATAATGTTTAGCACGCATTTAATCAGAAGGGTCTGA；

其中，所述PcreT启动子的序列如下：

TACTTAGTAATGATAAGTCTTTTTATTTTACATAGAAATAGCTTGTGGAATAAAAGAAAAATCTGTATTTTACTTGTTATGGTTACTTTTAGTTTGAATTAAAGTAACTAGGTTTAATATTTAAATAAAGATTAACCATCGATCTGGCAGGATCACACATCACCCGATAGGG

所述SD序列及mini-ORF毒素序列元件的序列如下：

TAAGGGGGAAATAATGTTTAGCACGCATTTAATCAGAAGGGTCTGA

所述抗毒素元件的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：

ATACAGATTTTTCTTTTATTCCACAAGCTATTTCTATGTAAAATAAAAAGACTTATCATTACTAAGTAAGGCACTACCATAAAGGTAGCTTAGAAATAGTTCCTTTTATTCAATCTGTTCATGGCGGCATACGCCATTTAGAAA。

其中，所述PcreA启动子的序列如下:

ATACAGATTTTTCTTTTATTCCACAAGCTATTTCTATGTAAAATAAAAAGACTTATCATTACTAAGTA；

所述类mini-CRISPR结构的序列如下：

AGGCACTACCATAAAGGTAGCTTAGAAATAGTTCCTTTTATTCAATCTGTTCATGGCGGCATACGCCATTTAGAAA。

本发明还提供一种偶联的CRISPR-Cas和毒素-抗毒素组合元件，包括来自鲍曼不动杆菌AYE菌株的

具体地，所述含有靶向耐药基因spacer的mini-CRISPR结构元件可以如SEQ IDNO：6所示可以单独表达靶向耐药基因的crRNA，或者与抗毒素元件融合形成双功能的含有双spacer的mini-CRISPR结构。

优选地，所述双功能的含有双spacer的mini-CRISPR结构是在抗毒素元件后连接靶向耐药基因的spacer及重复序列，融合形成例如如SEQ ID NO：4所示双spacer的mini-CRISPR结构，前面的spacer为creA的ψS序列，以产生CreARNA；后一个spacer即为所述靶向耐药基因的spacer，以产生靶向耐药基因的crRNA。所述ψS序列为相应的启动子序列中CC后面的20bp序列，或者GG前面20bp的反向互补序列。

优选地，所述重复序列为GTTCATGGCGGCATACGCCATTTAGAAA；

所述ψS序列为TAGTTCCTTTTATTCAATCT；

所述靶向耐药基因的spacer要求是耐药基因中CC后面的32-34bp长度序列,优选地所述耐药基因是碳青霉烯类药物的耐药性基因，具体是多重耐药的临床鲍曼菌株

更优选地，所述

本发明进一步提供一种含有所述的偶联的CRISPR和毒素-抗毒素组合元件的衍生质粒。

优选地，为大肠杆菌或不动杆菌的穿梭质粒，优选地如pMo130TFR作为出发质粒，更优选地，完整的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

本发明还提供含有所述的偶联的CRISPR和毒素-抗毒素组合元件，或所述衍生质粒的重组细菌，优选为大肠杆菌或不动杆菌。

本发明也提供含有基因组上整合有如所述的偶联的CRISPR和毒素-抗毒素元件的重组噬菌体，优选地，为溶原性或烈性噬菌体，更优选为不动杆菌噬菌体。

本发明进一步提供所述的衍生质粒，或所述的重组噬菌体在耐药基因的消杀中的应用，优选地将所述CRISPR-Cas元件递送到多重耐药细菌中，更具体地，通过接合转移、噬菌体侵染，纳米颗粒包埋方式递送到多重耐药细菌中，进行序列特异性消杀。

优选地，通过将含有所述衍生质粒的重组细菌施用到目标环境中利用自然接合转移方式导入耐药细菌中进行消杀；或者将所述重组噬菌体施用到目标环境中利用噬菌体的自然侵染方式导入耐药细菌中进行消杀；或者通过制备成纳米颗粒施用到目标环境中通过纳米颗粒导入耐药细菌中进行消杀。

本发明提供的通过联用CRISPR及其偶联的毒素-抗毒素（TA）元件，即CRISPR护卫RNA CreTA，对耐药细菌实现精准高效消杀的新型杀菌方法。该方法通过向用于细菌消杀的CRISPR-Cas元件中引入CreTA元件（该元件具有受CRISPR-Cas系统抑制的细胞毒性），可以产生CRISPR杀菌和TA杀菌双重效应：当CRISPR-Cas元件正常发挥功能时，其对细菌基因组上靶标DNA序列的切割效应可导致细菌死亡，产生CRISPR杀菌效应；而当CRISPR-Cas元件被活跃的转座因子或anti-CRISPR蛋白等破坏时，CreTA的毒素基因（creT）的表达被释放，产生TA杀菌效应。这一联用技术大大提高了CRISPR-Cas杀菌元件的稳定性和杀菌效率。由于CreTA元件的基因序列非常精简（约200-300 bp），易于合成和整合设计，且其偶联CRISPR-Cas元件的基因回路不依赖于CRISPR消杀的靶标基因和烈性噬菌体等因素，因此，与目前国际上最先进的联用烈性噬菌体的CRISPR杀菌技术（Ido Yosefet al.,Temperate andlytic bacteriophages programmed to sensitize and kill antibiotic-resistantbacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Jun 9; 112(23): 7267–7272.）相比，具有更高的通用性和可操作性。

因此，本发明创新性地利用CRISPR的护卫RNA元件（CreTA）提高CRISPR-Cas元件在消杀耐药菌过程中的稳定性，实现CRISPR和TA双重杀菌效应，从而有效提高CRISPR杀菌技术在实际应用中的效率。

附图说明

图1 联用CRISPR和CreTA进行双重杀菌的原理示意。

图2 不同杆菌中creTA元件的生信分析。

图3 不动杆菌WCHA45的creTA元件经过repeat替换后适配于鲍曼不动杆菌AYECRISPR-Cas系统。

图4 CreT毒素在鲍曼不动杆菌模式菌株AYE（a）和临床菌株（b）中的诱导表达。

图5 利用creTA提高CRISPR元件对鲍曼不动杆菌模式菌株的杀菌效率。

图6 联用CreTA元件提升CRISPR对临床菌株的消杀效率。

图7 色列科学家UdiQimron提出r 联合利用CRISPR-Cas元件和烈性噬菌体的策略。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例一不动杆菌中creTA元件的预测

从NCBI数据库中下载所有不动杆菌现有基因组序列，并筛选出有基因间区的I-F型cas操纵子。从中分析发现在不动杆菌WCHA45、LoGeW2-3和ANC3789三个菌株的cas操纵子内部（cas3和csy1基因之间）有一段较为保守的序列，其内部含有两个CRISPR repeat-like序列，即ψR1和ψR2（图2中a和图2中b）。其中ψR2序列非常保守，拥有和CRISPR repeat几乎完全一致的回文序列“CTGCCNNNNNGGCAG”，表明它们在RNA水平上有保守的二级茎环结构（图2中c）。虽然ψR1序列差异较大，但其最后8个碱基（相当于crRNA的5’-handle）非常保守并与CRISPR repeat基本一致（5’-CTTAGAAA-3’），而且各自携带一对回文序列，在RNA水平上可形成与ψR2、CRISPR repeat完全相同的茎环结构（图2中d）。上述序列信息表明，ψR1、ψR2以及两者之间的ψS序列是一个高度退化的mini-CRISPR结构，符合creA基因的序列特征。进一步分析表明，三个菌株各自的ψS序列在creA基因上游均有相应的靶点序列，即在PAM（protospacer adjacent motif，I-F型CRISPR系统的PAM为5’-CC-3’）旁侧存在与ψS高度相似的约20bp序列（图2中b中下划线标注）。上述序列信息符合creTA毒素-抗毒素元件的特征。因此，我们猜测creA基因的上游序列（creA与csy1之间）可能蕴藏某类未知的creT毒素基因，且creA可基于其ψS与靶点处的碱基匹配指导Csy复合物抑制creT基因的转录。

实施例二不动杆菌WCHA45的creTA元件功能测试与优化

为验证上述猜测，基于WCHA45的creTA序列合成了四个DNA片段（图3中a），分别用限制性内切酶酶切后连接到pMo130TFR载体上。

a) 片段1含有WCHA45 creTA的原始DNA序列（即cas3与csy1的基因间区序列），相应重组质粒命名为p45TA；

b) 片段2与片段1相比缺失了creA的ψR1-ψS-ψR2序列，相应重组质粒命名为p45T。

根据最近未发表研究成果，替换repeat序列可以提高异源CreTA与CRISPR-Cas的适配性。因此，为了提高WCHA45来源的creTA与AYE菌株中Csy复合物的功能匹配性，我们还构建了片段3和片段4：

c)片段3与片段1相比，ψR1替换为鲍曼不动杆菌AYE菌株的CRISPRrepeat序列，相应重组质粒命名为p45TAR1；

d)片段4与片段1相比，ψR2替换为鲍曼不动杆菌AYE菌株的CRISPRrepeat序列，相应重组质粒命名为p45TAR2。

将pMo130TFR空载体和携带上述片段的载体分别电转到鲍曼AYE菌株中，通过转化效率评价其细胞毒性（图3中b）。

a) pMo130TFR空载体电转AYE菌株的三次重复实验中，转化效率分别为113840，60714，81696 CFU/μg；

b) p45T转化AYE菌株的三次重复实验中，转化效率分别为0，0，0 CFU/μg，与空载体相比降低5个数量级，表明预测的WCHA45 creT基因确实产生了细胞毒性；

c) p45TA转化AYE菌株的三次重复实验中，转化效率分别为0，0，0 CFU/μg，说明未经改造的WCHA45

d) p45TAR1转化AYE菌株的三次重复实验中，转化效率分别为491，424，366 CFU/μg，与空载体相比降低2-3个数量级，但与p45T和p45TA相比提高了2-3个数量级，说明ψR1替换为鲍曼不动杆菌AYE菌株的CRISPRrepeat序列后，WCHA45 creA基因可以部分抑制相应

e)p45TAR2转化AYE菌株的三次重复实验中，转化效率分别为44642，81696，57589CFU/μg，与空载体的转化效率基本相当；说明ψR2替换为鲍曼不动杆菌AYE菌株的CRISPRrepeat序列后，WCHA45 creA基因可以完全抑制相应

根据本发明人在西班牙盐盒菌中的creTA研究（Ming Liet al.,Toxin-antitoxinRNA pairs safeguard CRISPR-Cas systems.Science.2021 Apr 30;372(6541):eabe5601.），猜测WCHA45 creA指导CRISPR效应物（即Csy复合物）通过抑制creT基因的转录而抑制其毒性。为验证这一猜测，将p45T和p45TAR2分别用来电转AYE的csy复合物缺失突变株（缺失csy1-4四个基因,命名为Δcsy）。

pMo130TFR空载体电转Δcsy菌株的三次重复实验中，转化效率分别为81748，53532，109294 CFU/μg；

p45T转化Δcsy菌株的三次重复实验中，转化效率分别为0，0，0 CFU/μg，与空载体相比降低5个数量级；

p45TAR2转化Δcsy菌株的三次重复实验中，转化效率分别为0，0，0，与空载体相比降低5个数量级，表明WCHA45 creA对其相应毒素基因的抑制需要AYE的Csy复合物参与。

综上，通过将ψR2替换为鲍曼不动杆菌AYE菌株的CRISPRrepeat序列，WCHA45

实施例三 CreT毒素对鲍曼不动杆菌普遍具有杀菌效应

基于对不动杆菌WCHA45、LoGeW2-3和ANC3789三个菌株中creTA序列的分析（图2中b），发现可能的毒素基因creT具有一个保守的开放阅读框（openreadingframe，简称ORF）。这一ORF非常短，只有11个密码子（含起始密码子和终止密码子），且其上游有一个嘌呤富含的SD（Shine-Dalgarno）序列（图2中b中指示了其互补链上的嘧啶富含序列）。因此猜测这一mini-ORF和SD序列是其creT毒素的核心元件。

为了验证这一猜测，本发明人基于pMo130TFR构建了两个衍生质粒pLac和pLacT（图4a）。pLac携带由lacI

将两质粒分别转入鲍曼不动杆菌AYE菌株后，将转化子接种到新鲜的液体LB培养基（添加亚硫酸钾为质粒提供选择性压力）中，一直培养至稳定期，然后添加IPTG诱导毒素CreT表达。诱导开始0，0.5，1，2，4，6小时后依次收集菌液，经梯度稀释后分别吸取0.5 μL在含有IPTG和不含IPTG的LB平板（含亚硫酸钾）上点圈。

在含有IPTG的LB平板上，携带pLac质粒的AYE菌株正常生长，而携带pLacT的AYE菌株无法生长（图4中a），说明在诱导条件下，tac启动子控制下的creT核心元件确实产生了细胞毒性。

在不含IPTG的LB平板上，携带pLac质粒的AYE菌株正常生长，而与之相比，携带pLacT质粒的AYE菌株克隆形成单位（CFU）随着IPTG诱导后的取样时间依次递减（图4中a），在IPTG诱导6小时后，CFU降低约5个数量级，说明液体培养基中携带pLacT的AYE菌体大量死亡，表明来源于WCHA45的CreT是一种杀菌毒素。

随后，将pLacT质粒转化到23株多重耐药的临床鲍曼不动杆菌中（图4中b），结果发现它们的转化子都能在不含IPTG的LB平板（添加亚硫酸钾为质粒提供选择性压力）上生长，但却不能在含有IPTG的LB平板（同时添加了亚硫酸钾为质粒提供选择性压力）上生长，说明WCHA45的CreT毒素在临床鲍曼菌株中普遍能够产生细胞毒性。

实施例四 creTA元件提升模式耐药菌的CRISPR消杀效率

接下来,在多重耐药的鲍曼不动杆菌模式菌株AYE中测试了creTA元件对CRISPR杀菌效率的影响。首先,在AYE菌株的cas3和csy1之间插入改造的WCHA45creTA元件（ψR2被替换为AYE菌株的CRISPR repeat序列），构建的菌株称为AYE-TA（图5中a）。随后，合成了一段mini-CRISPR DNA序列（如SEQ ID NO：6所示），含有两个CRISPR repeat（黑体标注）和1个靶向耐药基因

在只含有亚硫酸钾的LB平板上，pMo130TFR空质粒三次转化野生型AYE菌株的效率分别为323200，362000，175200 CFU/μg，三次转化AYE-TA菌株的效率分别为284800，217200，297600 CFU/μg，两者的log值无显著性差异（P值为0.89）。

在只含有亚硫酸钾的LB平板上，pACC3三次转化野生型AYE菌株的效率分别为85600，74400，54400 CFU/μg，三次转化AYE-TA菌株的效率分别为10400，19600，26400 CFU/μg，两者的log值存在显著性差异（P值为0.01），说明对AYE-TA菌株有更高的杀菌效率。

在同时含有亚硫酸钾和庆大霉素的LB平板上，pMo130TFR空质粒三次转化野生型AYE菌株的效率分别为264800，180800，172400 CFU/μg，三次转化AYE-TA菌株的效率分别为272800，228000，300800 CFU/μg，两者的log值无显著性差异（P值为0.15）。

在同时含有亚硫酸钾和庆大霉素的LB平板上，pACC3三次转化野生型AYE菌株的效率分别为608，416，288 CFU/μg，三次转化AYE-TA菌株的效率分别为76，60，64 CFU/μg，两者的log值存在极显著差异（P值为0.001），说明CreTA的存在显著降低了CRISPR消杀过程中庆大霉素抗性克隆的产生几率。

在同时含有亚硫酸钾和卡那霉素的LB平板上，pMo130TFR空质粒三次转化野生型AYE菌株的效率分别为289600，272400，179200 CFU/μg，三次转化AYE-TA菌株的效率分别为216000，244400，286800 CFU/μg，两者的log值无显著性差异（P值为0.9）。

在同时含有亚硫酸钾和卡那霉素的LB平板上，pACC3三次转化野生型AYE菌株的效率分别为1268，1236，1072 CFU/μg，三次转化AYE-TA菌株的效率分别为256，416，468 CFU/μg，两者的log值存在极显著差异（P值为0.004），说明CreTA的存在显著降低了CRISPR消杀过程中卡那霉素抗性克隆的产生几率。

pACC3对野生型AYE菌株的杀菌效率为75.08%（即1-（85600+74400+54400）/（323200+362000+175200））（图5中c）；

pACC3对AYE-TA菌株的杀菌效率为92.95%（即1-（10400+19600+26400）/（284800+217200+297600））；

因此，CreTA的存在大大提高了pACC3质粒携带的CRISPR对AYE菌株的杀菌效率。

在存活的野生型AYE中，仍保留庆大霉素抗性的克隆比例为0.61%（即（608+410+288）/（85600+74400+54400））；

在存活的AYE-TA菌体中，仍保留庆大霉素抗性的克隆比例为0.35%（即（76+60+64）/（10400+19600+26400））；

因此，在联用CRISPR和CreTA时，显著降低抗性克隆的产生几率。

实施例五联用CreTA元件提升CRISPR对临床菌株的消杀效率

由于CreT在鲍曼不动杆菌中普遍具有杀菌毒性（图4），我们进一步测试联用CRISPR和CreTA对多重耐药临床菌株的消杀效率。

首先，将AYE菌株的cas3基因和四个csy基因（这五个基因是CRISPR消杀所必需的cas基因）整合到pMo130TFR质粒上（图6中a），然后构建了一个双spacer的mini-CRISPR结构（序列如SEQ ID NO：4所示），其中前面一个spacer即为creA的ψS序列（直线下划线序列），可以产生CreA RNA；后面一个spacer（波浪下划线）靶向多重耐药的临床鲍曼菌株中常见的

a)在只含有亚硫酸钾的LB平板上：

pMo130TFR空质粒三次转化临床菌株AB14的效率分别为3120000，4800000，3640000 CFU/μg；

pOXA23三次转化临床菌株AB14的效率分别为28400，32800，31200 CFU/μg，与空质粒相比存在极显著差异（P值为3.47E-06），说明AYE菌株的CRISPR-Cas系统对临床鲍曼菌株产生了明显的杀菌效应，杀菌效率为99.2%（即1-（28400+32800+31200）/（3120000+4800000+3640000））；

pOXA23-TA三次转化临床菌株AB14的效率分别为500，650，500 CFU/μg，与pOXA23相比存在极显著差异（P值为1.08E-05），说明CreTA极显著地提高了CRISPR杀菌效率，约为99.94%（即1-（500+650+500）/（3120000+4800000+3640000））。

b)在同时含有亚硫酸钾和美罗培南的LB平板上：

pMo130TFR空质粒三次转化临床菌株AB14的效率分别为2720000，3560000，2840000 CFU/μg，与只含有亚硫酸钾的LB平板上转化效率无显著性差异（P值为0.21）。

pOXA23三次转化临床菌株AB14的效率分别为332，296，344 CFU/μg，而pOXA23-TA三次转化临床菌株AB14的效率分别为8，20，8 CFU/μg，两者存在极显著差异（P值为3.89E-04），表明CreTA的联用显著降低了CRISPR杀菌过程中美罗培南抗性克隆的产生几率。

c)在同时含有亚硫酸钾和亚胺培南的LB平板上：

pMo130TFR空质粒三次转化临床菌株AB14的效率分别为2836000，3320000，3560000 CFU/μg，与只含有亚硫酸钾的LB平板上转化效率无显著性差异（P值为0.32）。

pOXA23三次转化临床菌株AB14的效率分别为388，372，296 CFU/μg，而pOXA23-TA三次转化临床菌株AB14的效率分别为4，0，8 CFU/μg，两者存在极显著差异（P值为1.59E-03），表明CreTA的联用显著降低了CRISPR杀菌过程中亚胺培南抗性克隆的产生几率。