一种解淀粉芽孢杆菌T-11及其菌剂制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)发酵优化及其在低产桃园改造和桃树根腐病生物防治上的应用，属于微生物技术领域。

背景技术

我国是桃的生产大国，长期以来，我国的桃种植面积和总产量均稳居世界第一。但是由于长期连作种植桃树，果园栽植种类单一，再加上管理技术相对落后、农药化肥的滥用，导致许多果园土传病害频繁发生，严重威胁到了果农的经济收入。在众多桃园土传病害中，桃树根腐病在某些地区尤其严重。造成桃树根腐病病害的病原菌是一些土壤习居菌，主要有腐皮镰刀菌、尖孢镰刀菌、弯角镰刀菌等。

目前国内对于桃树根腐病的防治措施，主要还是采用传统的化学农药防治并结合相关农艺措施的方法，在生物防治方面研究甚少，尤其对于桃树根腐病生防菌的研究则更是少之又少。

一直以来，化学防治由于其防效高、速度快、杀虫抗菌谱广、使用简单等特点，成为了我国防治农业病虫害的重要手段。但是，由于长期过度使用各种农药化肥，导致许多的病虫害都产生了抗药性。与此同时，也导致了土壤板结退化、环境污染、江河湖泊富营养化、温室气体大量排放等问题的出现。与传统的防治手段相比，生物防治具有不污染环境、对人和其它动物安全、防治作用持久等优点。特别是近年来随着人们环境保护意识的增强，绿色有机食品需求量的增加，以及对保护生物多样性与生态农业可持续发展的大力倡导，使得生物防治再次成为了世界农业的热点话题。

解淀粉芽孢杆菌是一种作物根际促生菌，可以通过多种机制促进植物生长；同时，解淀粉芽孢杆菌既可以通过自身表达改善植物外界环境，也可以通过调控植物本身代谢途径增强“植物系统抗性”，使植物能够在适当刺激下增强自身的防御能力，产生多种酶以及大量的二次代谢产物，通过体内合成途径产生芽孢霉素、风霉素、聚酮类药物和芽孢杆菌素、细菌素等抗菌物质，抗病效果显著。解淀粉芽孢杆菌在各个领域均有较好的应用前景，但在实际生产中仍然存在发酵菌数不能满足生产需求，功能菌与相关产品衔接不力尤其是专用产品缺乏，功能菌产品具体使用方式方法有待探索等关键技术问题亟需解决。

发明内容

本发明针对现有技术手段的不足，提供一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，可应用于低产桃园改造和桃树根腐病的生物防治。

一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)T-11，于2022年10月20日经形态学、BIOLOG生理生化、16SrRNA及看家基因系统鉴定，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2022年10月26日，保藏编号：CGMCC No.25968，分类命名：Bacillus amyloliquefaciens。

所述菌株解淀粉芽孢杆菌T-11从根际土壤中分离得到，简称T-11，主要生物学特性为：细胞革兰氏阳性，杆状，芽孢椭圆形，中生或端生，胞囊不膨大。菌落白色或浅黄色，中间有嵴状凸起，湿润无光泽，边缘不规则。适宜生长温度为20-50℃，适宜pH为4-7，10％盐浓度生长。能水解酪蛋白、明胶、淀粉、果胶，不水解纤维素、尿素。能利用纤维二糖、葡萄糖、甘油、麦芽糖、甘露糖、棉子糖、山梨醇、蔗糖和海藻糖等。过氧化氢酶反应、淀粉水解反应、硝酸还原反应、精氨酸双水解反应、葡糖糖发酵反应、蔗糖发酵反应、MR反应、V-P反应呈阳性；吲哚反应、硫化氢反应呈阴性。部分结果见表1。

表1T-11菌株的Biolog及生理生化鉴定部分结果

16S rRNA序列：

GGGGGTGCCTAATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAG

CGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGG

AAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGG

CTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGC

TCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTG

AGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGA

AAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGT

TGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAG

AAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGT

CCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCC

CCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAG

AGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCG

AAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACA

GGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTT

CCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCA

AGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTT

AATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAG

ATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGT

GTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAG

CATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGAT

GACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGAA

CAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGA

TCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCAT

GCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTT

GTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTTGGAGCCAGCCCGCCCCCGA

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)T-11的培养方法，步骤如下：

(1)将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)T-11划线接种于LB固体培养基平板上活化培养，制得活化菌株；

(2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于LB液体培养基中，进行种子培养，制得种子液；

(3)将步骤(2)制得的种子液按体积百分比3.7％的接种量接种到发酵培养基中，进行发酵培养，制得发酵液。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，活化条件为37℃活化培养24h。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，种子培养条件为37℃、180rpm振荡培养12h。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，发酵培养基每升组分如下：

麸皮14.9g；豆粕30g；硫酸锌2.1g；硫酸铵2g；硫酸镁0.2g；氯化钙0.01g；硫酸亚铁0.005g；氯化锰0.002g；磷酸氢二钾10.5g；磷酸二氢钾4.5g；pH6。

上述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)T-11或微生物菌剂用于低产桃园改造桃树根腐病生物防治。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

1.本发明涉及的T-11菌株经培养基优化和发酵条件等的系统优化，摇瓶发酵液中T-11菌株的菌液浓度达到1.0×10

2.本发明涉及的T-11菌株对多种土传植物病原菌均有拮抗作用，尤其是对镰刀菌属和链霉菌属致病菌拮抗效果明显，桃树根腐病温室盆栽试验防效稳定在70％以上，桃园试验防效稳定在60％以上。

3.本发明涉及的T-11菌株具有明显的促生效果，与对照相比，鲜重、干重、株高、茎粗、根长、叶绿素含量均明显提高，且差异显著。低产桃园增产明显，桃子甜度明显提升。

附图说明

图1为本发明解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)T-11菌株的菌落图片(左)和显微图片(右)；

图2为本发明解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)T-11菌株的BIOLOG微孔板鉴定图片；

图3为本发明解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)T-11菌株的16SrRNA系统发育树；

图4为本发明解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)T-11菌株的生长曲线；

图5为本发明麸皮与ZnSO

图6为本发明麸皮与接种量交互作用对T-11菌株发酵液菌体量影响的响应面和等高线图；

图7为本发明ZnSO

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)T-11菌株对病原菌拮抗作用的验证

用平板对峙法测定T-11菌株对多种病原菌的抑制作用。经多次试验反复印证，T-11菌株对多种病原真菌及病原链霉菌的拮抗效果良好，体现了较为广谱的抗病性。T-11菌株拮抗桃树根腐病病原菌效果显著。

实施例2T-11菌剂的制备

(1)将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)T-11划线接种于LB固体培养基平板上37℃活化培养24h，制得活化菌株；

(2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于LB液体培养基中，进行种子培养，37℃、180rpm振荡培养12h制得种子液；

(3)将步骤(2)制得的种子液按体积百分比3.7％的接种量接种到发酵培养基中，进行发酵培养，制得发酵液。发酵培养基每升组分如下：

麸皮14.9g；豆粕30g；硫酸锌2.1g；硫酸铵2g；硫酸镁0.2g；氯化钙0.01g；硫酸亚铁0.005g；氯化锰0.002g；磷酸氢二钾10.5g；磷酸二氢钾4.5g；pH6

经检测，摇瓶发酵液中T-11菌株的菌液浓度达到了1.3×10

表2生防菌T-11菌株发酵优化验证试验

实施例3T-11菌剂温室盆栽试验

实验共4个处理，设置如下：

(1)CK

(2)病原菌：每株施加10mL病原菌发酵液(10

(3)生防菌；每株施加100m L生防菌发酵液(10

(4)病原菌+生防菌：每株施加100m L生防菌发酵液(10

T-11处理组与CK进行比较时，两组幼苗在干重、根总长与叶绿素三个方面呈极显著差异，鲜重、株高、茎粗三个性状呈显著差异，表明了该生防菌株明显的促生性能。

在病原菌+生防菌的混合处理组中，幼苗的干重较比CK提高，具有极显著的差异，鲜重、株高、茎粗、根总长和叶绿素含量均表现出显著的差异，证明T-11菌株在盆栽试验中明显的拮抗病原菌的能力，温室盆栽试验对桃树根腐病的生物防治效果稳定在70％左右。

实施例4桃树专用T-11功能菌生物有机肥生产及桃园施用技术方法

一种桃树专用T-11功能菌生物有机肥，将40-50L含上述T-11菌剂与1吨的机肥混合均匀(或进行造粒)，有机肥料具体可为江苏泗洪瑞龙农业科技有限公司生产的生物有机肥。有效活菌数≥1.1×10

桃园施用技术方法：

(1)施用时间

桃树主要依靠上一年储存在树体内的营养完成第二年开花坐果结实，同时桃树根系在秋季存在第二次生长高峰期，桃树专用功能型生物有机肥建议秋施，9月底到11月初，宜早不宜晚。

(2)施肥方法

采用条状平行沟施或平铺撒施。

A条状平行沟施肥

在树冠两侧顺行向开2条平行条状沟。开沟位置在树冠正投影边缘内侧，沟宽40cm左右，沟深40cm左右。肥土混合后施入沟中。

B平铺撒施肥

树冠投影下均匀撒施，平铺地表。

(3)施用量

土壤有机质不足10g/kg的果园，每667m

(4)施肥后灌溉

桃树专用功能型生物有机肥施后及时灌溉，灌溉水质标准参照GB 5084的标准执行，灌溉数量参考DB13/T 1479标准每667m