一种德氏乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种德氏乳杆菌及其应用。

背景技术

随着现代人生活水平的提高，猪肉的需求量也随之增加，这不仅促进了养猪业的发展，也对养殖场的生产水平提出了更高的要求。对于生产者而言，提高猪场的生产水平即提高其年出栏量。然而，生产中常出现先天性低出生重猪，其成活率低、死亡率高，严重影响养猪业生产效益。因此，在生产中提高低出生重猪的成活率和出生后的生长性能，是减少经济损失的关键。

相关研究发现，与正常猪相比，低出生重猪存在诸多发育缺陷，如肠道屏障受损、肠道炎症水平提高、生理代谢过程异常以及消化能力低下等，这些缺陷还会影响断奶仔猪以及生长猪，最终影响猪的出栏体重，且这些缺陷均与其肠道微生物组成和结构改变存在显著相关。

抗生素大量使用导致畜产品安全和细菌耐药性等问题日益突出，因此仔猪生产中寻找高效的抗生素替代物以提高其生长性能是目前急迫的任务。目前，生产中常用的促生长手段主要针对健康、正常猪，而鲜有应用于低出生重猪的干预方式。而低出生重猪在生产中的发生率可达15～20％，为养猪业造成了巨大的经济损失。故从根本上提高哺乳期低出生重猪的成活率和生长性能、改善其生理健康状态，是提高养猪生产效益、减少经济损失的关键一环。生产中存在多种常用的促生长剂，如益生菌、益生元、植物提取物等。而如何从中选择有效改善仔猪生长性能和肠道健康的干预手段，成为本领域亟待解决的技术难题。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种德氏乳杆菌及其应用。

现有情况下，生产者更加追求母猪的高产性能，尤其是产仔数指标，从而获得更多的商品猪。然而，产仔数高伴随着低出生重个体数高，同时低出生重猪的生长性能低下、患病率和死亡率高，直接影响养猪业的经济效益。

目前研究人员发现低出生重猪的出现由多种因素影响，一方面，母猪妊娠期子宫内所能提供的营养物质有限，故胎猪数量越多时，每头胎猪所能分配到的宫内营养即会越少，更易发生胎猪发育不良的情况。因此，在生产中母猪窝产仔数提高的同时，低出生重猪的数量也会增加。另一方面，正常猪和低出生重猪相比较而言，二者存在多种关键差异微生物，且这些关键差异微生物与低出生重猪的肠道炎症、代谢紊乱之间存在显著相关关系。因此，从关键差异微生物入手，寻找促进低出生重猪生长性能和肠道健康的微生物，能够开发针对于低出生重猪的促生长饲料添加剂。

进一步而言，作为替抗的一种促生长添加剂，益生菌已广泛应用于养殖业中。目前在使用的益生菌有乳杆菌、芽孢杆菌和丁酸梭菌等，其在生产中主要应用于健康和发育正常的动物，而鲜有针对低出生重动物的案例。因此，开发针对于低出生重猪的潜在益生菌，具有极为广阔的发展前景和可能性。

本研究中发明了一种具有潜在益生功能的德氏乳杆菌Mafic1501，针对低初生重猪生长性能低下、肠道健康受损和患病率高的生理背景，其能显著提高哺乳期低出生重猪生长性能，提高仔猪的断奶体重，促进结肠屏障发育，降低结肠炎症水平和调节肠道微生物组成和结构，达到减少养猪业经济效益损失的预期，发展前景广阔。

第一方面，本发明提供一种德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)Mafic1501，所述德氏乳杆菌Mafic1501的保藏编号为CGMCC No.26198。

本发明从猪粪便中分离得到一种菌株，通过对其理化性质的验证，对其16S rRNA基因的检测，验证其和德氏乳杆菌相同，因此将其命名为德氏乳杆菌Mafic1501，并对其进行了生物保藏，具体保藏信息如下：

保藏编号：CGMCC No.26198；分类命名：德氏乳杆菌Lactobacillus delbrueckii；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101；保藏日期：2022年12月14日。

本发明进一步提供包括所述德氏乳杆菌Mafic1501或其发酵产物的菌剂。

进一步地，所述菌剂中德氏乳杆菌Mafic1501的总活菌数为1×10

第二方面，本发明提供所述的德氏乳杆菌Mafic1501，或所述的菌剂在提高动物的肠道健康中的应用。

本发明进一步提供所述的德氏乳杆菌Mafic1501，或所述的菌剂在制备用于提高动物的肠道健康的药物中的应用。

进一步地，所述提高动物的肠道健康包括：

改善动物的肠道中微生物的组成和结构、促进肠道屏障的发育或减缓肠道炎症水平中的一种或多种。

进一步地，以上所述改善动物的肠道中微生物的组成和结构包括：提升乳杆菌属和双歧杆菌属的丰度。

进一步地，以上所述促进肠道屏障的发育包括：提高Mucin-2蛋白和ZO-1蛋白的表达。

进一步地，以上所述减缓肠道炎症水平包括：降低促炎因子水平，所述促炎因子优选包括IFN-γ、IL-8以及IL-12。

本发明进一步提供所述的德氏乳杆菌Mafic1501，或所述的菌剂在提高动物的生长性能中的应用。

进一步地，所述动物为猪。

进一步地，所述动物为低出生重哺乳仔猪。

低出生重猪在生产中的发生率可达15～20％，为养猪业造成了巨大的经济损失，本发明提供的德氏乳杆菌Mafic1501可以有效针对低出生重哺乳仔猪存在例如肠道屏障受损、肠道炎症水平提高等诸多发育缺陷的问题，有效改善仔猪的肠道健康，显著提高其生长发育状态。

本发明具备如下有益效果：

本发明从猪粪便中分离得到了一种德氏乳杆菌Mafic1501，其具备优异的改善低出生重猪生长和肠道健康的效果，使用该菌株饲喂新生仔猪，可以有效改善仔猪肠道的微生物组成与结构，促进仔猪肠道屏障发育，降低仔猪肠道炎症水平，进而改善低出生重猪的健康水平，这对于改善养猪业的生产水平，提高经济效益具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1提供的德氏乳杆菌Mafic1501的菌落示意图。

图2是本发明实施例1提供的德氏乳杆菌Mafic1501的形态学观察示意图。

图3是本发明实施例2提供的德氏乳杆菌Mafic1501的生长情况示意图。

图4是本发明实施例2提供的德氏乳杆菌Mafic1501的糖发酵试验结果示意图。

图5是本发明实施例3提供的各组仔猪的生长性能对比示意图。

图6是本发明实施例3提供的各组仔猪的免疫球蛋白水平对比示意图。

图7是本发明实施例3提供的各组仔猪肠道中乳杆菌属和德氏乳杆菌的定量结果示意图；其中左上为回肠中乳杆菌属的定量结果，左下为结肠中乳杆菌属的定量结果，右上为回肠中德氏乳杆菌的定量结果，右下为结肠中德氏乳杆菌的定量结果。

图8是本发明实施例3提供的各组仔猪肠道中微生物的组成与结构示意图。

图9是本发明实施例3提供的各组仔猪Mucin-2和ZO-1的表达情况示意图；其中，左图为Mucin-2的表达情况，右图为ZO-1的表达情况。

图10是本发明实施例3提供的各组仔猪肠道各促炎因子的水平示意图；其中左图为IFN-γ、中图为IL-8、右图为IL-12。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)Mafic1501的分离与鉴定流程，具体如下：

一、德氏乳杆菌Mafic1501的分离

德氏乳杆菌Mafic1501分离自杜×长×大三元杂交断奶仔猪粪便，仔猪饲养在河北省承德市丰宁满族自治县汤河乡大草坪村农业农村部饲料工业中心动物试验基地。具体分离方法如下：

1、平板涂布划线：取三元杂交断奶仔猪粪便2g，用无菌PBS缓冲液进行梯度稀释，选取10

2、液培与保种：挑取纯化后的单菌落，接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h后，采用50％无菌甘油进行保种。

3、16S rRNA基因测序鉴定：取德氏乳杆菌Mafic1501菌液，经DNA提取及PCR扩增后，使用细菌通用引物(27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT)进行16S rRNA基因测序鉴定。

在NCBI上将菌株德氏乳杆菌Mafic1501的16S rRNA基因序列与数据库中所有已测定细菌的16S rRNA基因序列进行比对，菌株德氏乳杆菌Mafic1501与Lactobacillusdelbrueckii subsp.Bulgaricus B37的16S rRNA基因序列的同源相似性最高，为99.86％，确定菌种类别为德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)。

本实施例进一步对该菌株进行了生物保藏，保藏信息如下：

保藏编号：CGMCC No.26198；分类命名：德氏乳杆菌Lactobacillus delbrueckii；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101；保藏日期：2022年12月14日。

二、菌株的形态学和生理生化特征

本实施例进一步对上述分离得到的德氏乳杆菌Mafic1501进行形态学和生理生化鉴定。

1、菌落形态学观察：如图1所示，德氏乳杆菌Mafic1501单菌落直径约1mm，颜色呈白色，不透明，菌落表面微凸，边缘规则。

2、菌体形态学观察：如图2所示，经革兰氏染色和光学显微镜观察，德氏乳杆菌Mafic1501为革兰氏阳性菌，呈细长杆状，无鞭毛，不运动。

实施例2

本实施例提供德氏乳杆菌Mafic1501的特性评估流程：

种子液活化：将菌株德氏乳杆菌Mafic1501接种到灭菌MRS液体培养基中，37℃厌氧培养12h后取出备用。

1、生长曲线测定

按2％接种量从种子液中吸取定量的菌液接种到MRS液体培养基中，37℃厌氧培养。每隔2h使用酶标仪测定培养液在OD

2、耐酸性检测

按2％接种量将德氏乳杆菌Mafic1501的种子培养液接种到pH为3的MRS培养基中，分别在0h、3h进行活菌计数，计算细菌存活率。结果如表1所示，在酸性环境下3h，德氏乳杆菌Mafic1501的存活率为77.5％，说明德氏乳杆菌Mafic1501具有较为良好的耐酸性，能在pH 3的环境中存活3小时。

表1德氏乳杆菌Mafic1501耐酸性检测

3、胆盐耐受性检测

按2％接种量将德氏乳杆菌Mafic1501的种子培养液接种到0.3％胆盐添加量的MRS培养基中，测定培养3h后OD

表2德氏乳杆菌Mafic1501胆盐耐受性检测

4、糖发酵试验

将德氏乳杆菌Mafic1501接种到生化鉴定管中，接种完成后37℃厌氧培养24小时。结果如图4所示，德氏乳杆菌Mafic1501能够利用乳糖、山梨醇、菊糖、棉子糖、蔗糖、纤维二糖、水杨苷、甘露醇和麦芽糖作为发酵底物。

实施例3

本实施例提供德氏乳杆菌Mafic1501对低出生重猪生长性能和肠道健康的影响，具体如下：

1、试验设计

选取1.4kg左右的新生仔猪12头，设为对照(CON)组，出生第1-7天灌服无菌生理盐水；选取1.0kg左右的新生仔猪24头，随机分为两组(IUGR组为低出生重组，出生第1-7天灌服无菌生理盐水；L.del组为德氏乳杆菌组，出生第1-7天灌服浓度为2×10

2、样品采集与指标检测

(1)试验期间，分别于仔猪8和21日龄，统计体重。

(2)于仔猪8日龄时，每组随机选择4头进行屠宰取样，包括肠道组织样以及食糜样品；于仔猪21日龄时，采集仔猪前腔静脉血。

3、试验结果

(1)生长性能：如图5所示，在出生第1-7天进行德氏乳杆菌干预后，与IUGR组相比，L.del组仔猪生长性能显著提高。

(2)免疫球蛋白水平：如图6所示，与IUGR组相比，德氏乳杆菌能够在一定程度上提高仔猪血清免疫球蛋白(IgA和IgG)水平。此结果说明，哺乳早期对低出生重仔猪进行德氏乳杆菌的干预能够有效提高仔猪的免疫机能。

(3)回肠和结肠德氏乳杆菌绝对定量：如图7所示，德氏乳杆菌能够显著提高仔猪结肠中乳杆菌属的丰度，且德氏乳杆菌在回、结肠中的丰度也显著提高。此结果说明，德氏乳杆菌能够在仔猪肠道中有效的定植，且哺乳早期对低出生重仔猪进行德氏乳杆菌的干预能够显著提高肠道中乳酸菌属这一核心菌群的丰度。

(4)结肠微生物组成与结构：通过比较差异物种组成结果(图8)可以发现，与正常猪相比，低出生重猪的重要肠道微生物Oscillospira颤螺菌属显著降低；而德氏乳杆菌干预后，Lactobacillus乳杆菌属、Bifidobacterium双歧杆菌属丰度显著升高。此结果说明，哺乳早期对低出生重仔猪进行德氏乳杆菌的干预能够改变结肠微生物组成，提高有益菌的丰度从而缓解其肠道紊乱状态。

(5)结肠屏障发育：如图9所示，德氏乳杆菌能够显著提高低出生重哺乳仔猪结肠紧密连接相关蛋白基因(Mucin-2、ZO-1)的表达。此结果说明，针对低出生重仔猪，德氏乳杆菌可提高其哺乳期肠道屏障完整性。

(6)结肠炎症水平：如图10所示，与IUGR组相比，德氏乳杆菌能够显著降低低出生重仔猪结肠IFN-γ、IL-8以及IL-12等促炎因子水平。此结果说明，哺乳早期对低出生重仔猪进行德氏乳杆菌的干预能够有效缓解其结肠炎症，促进肠道健康。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。