一种缓解大豆阿特拉津残留药害的种子菌衣剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于农业微生物应用领域，更具体地说，涉及一种缓解大豆阿特拉津残留药害的种子菌衣剂及其制备方法与应用。

背景技术

玉米田长期、大量使用的除草剂阿特拉津残留在土壤中，易造成阿特拉津敏感作物大豆的药害，如叶片发黄干枯甚至整株死亡，严重影响大豆生长与产量形成，成为种植结构转变中的绊脚石。因此，发展行之有效的除草剂残留药害预防或缓解措施对推动种植结构转变，提升我国大豆自给率具有重要意义。

常用的药害缓解措施包括翻耕、灌溉等物理手段减少土壤除草剂残留，施用1,8-萘酐、解草胺腈等安全剂，芸薹素内酯等植物生长调节剂减少除草剂吸收、增加抗性，施用除草剂降解菌剂减少土壤残留等。目前研究较多的是解决除草剂土壤残留对单子叶作物的药害问题，而针对大豆等双子叶植物的缓解措施较少。此外，施用降解菌剂减少土壤中除草剂残留是更为根本的措施，且该措施作为微生物缓解措施成本低、环境友好、适合大规模应用，但是由于土壤中土著微生物的竞争，外源微生物定殖困难，降解菌剂难以取得稳定的修复效果。因此，如何更好地发挥降解菌的修复效果仍是值得关注的问题。

微生物的种子接种可直接将微生物输送到作物根际，自种子萌发就可以建立密切的植物-微生物联系，减少与土壤中土著微生物的竞争，获得更高的根系定殖效率。然而，利用种子菌衣剂帮助敏感作物抵抗除草剂残留胁迫的工作尚未见报道。

发明内容

1.要解决的问题

针对常用除草剂阿特拉津残留会造成敏感作物大豆药害，影响种植结构由玉米单作转向玉米-大豆复合种植或轮作的问题，本发明提供一种缓解大豆阿特拉津残留药害的种子菌衣剂及其制备方法与应用。本发明的种子菌衣剂通过降解菌接种，大豆种子浸泡其中获得菌衣，可显著改善阿特拉津残留胁迫下的大豆生长状况，减少大豆植株阿特拉津的累积量，提高叶片叶绿素含量、氮含量与大豆生物量，有效解决施用阿特拉津导致的土壤残留对大豆的药害问题。

2.技术方案

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

本发明的一种用于缓解大豆阿特拉津残留药害的种子菌衣剂，包含降解菌菌液、载体和粘合剂，所述降解菌菌液的活性成分为菌株Paenarthrobacter sp.AT-5，于2023年10月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.28595。

优选地，所述载体为蒙脱土、生物炭、膨润土、硅藻土、粘土、泥炭土中的一种或多种，所述粘合剂为黄原胶、阿拉伯胶、聚乙烯醇、壳聚糖、羧甲基纤维素钠中的一种或多种。

更优选地，所述载体为蒙脱土、生物炭中的一种或两种，所述粘合剂为黄原胶。

优选地，按质量份计，所述种子菌衣剂包含45-55份降解菌菌液、5-15份载体和0.5-1份粘合剂。

更优选地，按质量份计，所述种子菌衣剂包含50份降解菌菌液、10份载体和1份粘合剂。

优选地，所述降解菌菌液是以含5wt％海藻糖保护剂的磷酸盐缓冲液配制的悬浮菌液。

优选地，所述降解菌菌液OD

优选地，所述降解菌菌液的有效活菌数为5.6×10

本发明的一种缓解大豆阿特拉津残留药害的种子菌衣剂的制备方法，包括以下步骤：

S1、将降解菌菌株Paenarthrobacter sp.AT-5，保藏号为CGMCC No.28595，转接到LB平板上活化培养，而后挑取单菌落接种在LB液体培养基中培养，得到降解菌菌液；

S2、将步骤S1得到的降解菌菌液与载体、粘合剂和磷酸盐缓冲液按一定质量份混合，得到降解菌种子菌衣剂。

优选地，步骤S1中，挑取单菌落接种在LB液体培养基中25℃培养12h，4500rpm离心10min收集菌体，而后用磷酸盐缓冲液清洗3次，将菌体悬浮于含5％海藻糖的磷酸盐缓冲液中，采用稀释法调整菌液OD

优选地，步骤S2中，按质量份计，将50份降解菌菌液、10份蒙脱土、1份黄原胶和39份含5wt％海藻糖的磷酸盐缓冲液混合，得到降解菌种子菌衣剂。

更优选地，步骤S2中，按质量份计，将1份黄原胶搅拌溶解在39份含5wt％海藻糖的磷酸盐缓冲液中，而后与搅拌均匀的50份降解菌菌液和10份蒙脱土混合，得到降解菌种子菌衣剂。

上述种子菌衣剂以及根据上述制备方法制备得到的种子菌衣剂在缓解大豆阿特拉津残留药害的应用，其中，所述应用包括将大豆种子在所述种子菌衣剂中浸泡一定时间，而后将大豆种子自然风干，得到具有菌衣的大豆种子，将所述具有菌衣的大豆种子播种在阿特拉津残留的环境中，缓解阿特拉津对大豆幼苗的生长抑制。

优选地，将所述大豆种子预先消毒后进行浸泡，预先消毒的具体步骤为：将大豆种子先用75％体积分数的乙醇浸泡30s，再用1％体积分数的NaClO溶液浸泡5min，最后用去离子水清洗多次。

优选地，将大豆种子在种子菌衣剂中浸泡的时间为1-3min。

优选地，将所述具有菌衣的大豆种子播种在阿特拉津残留为1～10mg/kg的环境中，缓解阿特拉津对大豆幼苗的生长抑制。

优选地，所述具有菌衣的大豆种子的有效活菌数为1.66×10

优选地，所述大豆种子的品种为吉农28，培养条件为：25℃下光照14h，20℃下黑暗10h。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明的一种用于缓解大豆阿特拉津残留药害的种子菌衣剂，包含降解菌Paenarthrobacter sp.AT-5，能够显著改善阿特拉津残留胁迫下的大豆生长状况，减少大豆植株阿特拉津的累积量，提高叶片叶绿素含量、氮含量与大豆生物量；

(2)本发明的一种用于缓解大豆阿特拉津残留药害的种子菌衣剂，包含一定质量份比例的降解菌菌液、载体和粘合剂，不仅为降解菌提供相对稳定的生存环境，便于降解菌定殖，而且有利于菌衣剂与种子结合；

(3)本发明的一种用于缓解大豆阿特拉津残留药害的种子菌衣剂的制备方法，通过含5％海藻糖的磷酸盐缓冲液配制降解菌菌液，以海藻糖作保护剂，能够提高降解菌的抗胁迫能力，延长存活时间；

(4)本发明的一种用于缓解大豆阿特拉津残留药害的种子菌衣剂的应用，通过菌衣剂降解菌接种，使大豆种子获得可观的有效活菌数，而后将具有菌衣的大豆种子播种在阿特拉津残留为1～10mg/kg的环境中，能够明显缓解阿特拉津对大豆幼苗的生长抑制。

附图说明

图1为实施例1制备的含阿特拉津降解菌菌衣的大豆种子的照片；

图2示出实施例2中初始阿特拉津浓度为1mg/kg时有无菌衣的大豆生长状况，其中CK指未使用菌衣剂，MT指使用无降解菌的菌衣剂，MT+AT5指使用含降解菌AT5的菌衣剂；

图3示出实施例3中初始阿特拉津浓度为5mg/kg时有无菌衣的大豆生长状况，其中CK指未使用菌衣剂，MT指使用无降解菌的菌衣剂，MT+AT5指使用含降解菌AT5的菌衣剂；

图4示出实施例4中初始阿特拉津浓度为10mg/kg时有无菌衣的大豆生长状况，其中CK指未使用菌衣剂，MT指使用无降解菌的菌衣剂，MT+AT5指使用含降解菌AT5的菌衣剂；

图5示出实施例2-4中不同阿特拉津残留浓度下大豆植株真叶的SPAD值，其中CK指未使用菌衣剂，MT指使用无降解菌的菌衣剂，MT+AT5指使用含降解菌AT5的菌衣剂；

图6示出实施例2-4中不同阿特拉津残留浓度下大豆植株真叶的含氮量，其中CK指未使用菌衣剂，MT指使用无降解菌的菌衣剂，MT+AT5指使用含降解菌AT5的菌衣剂；

图7示出实施例2-4中不同阿特拉津残留浓度下大豆植株地上部长度，其中CK指未使用菌衣剂，MT指使用无降解菌的菌衣剂，MT+AT5指使用含降解菌AT5的菌衣剂；

图8示出实施例2-4中不同阿特拉津残留浓度下大豆植株地上部鲜重，其中CK指未使用菌衣剂，MT指使用无降解菌的菌衣剂，MT+AT5指使用含降解菌AT5的菌衣剂；

图9示出实施例2-4中不同阿特拉津残留浓度下大豆植株地下部鲜重，其中CK指未使用菌衣剂，MT指使用无降解菌的菌衣剂，MT+AT5指使用含降解菌AT5的菌衣剂；

图10示出实施例2中初始阿特拉津浓度为1mg/kg时大豆植株地上部和地下部阿特拉津累积浓度，其中CK指未使用菌衣剂，MT指使用无降解菌的菌衣剂，MT+AT5指使用含降解菌AT5的菌衣剂；

图11示出实施例3中初始阿特拉津浓度为5mg/kg时大豆植株地上部和地下部阿特拉津累积浓度，其中CK指未使用菌衣剂，MT指使用无降解菌的菌衣剂，MT+AT5指使用含降解菌AT5的菌衣剂；

图12示出实施例4中初始阿特拉津浓度为10mg/kg时大豆植株地上部和地下部阿特拉津累积浓度，其中CK指未使用菌衣剂，MT指使用无降解菌的菌衣剂，MT+AT5指使用含降解菌AT5的菌衣剂。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

本发明的一种缓解大豆阿特拉津残留药害的种子菌衣剂的制备方法，包括以下步骤：

S1、将降解菌菌株Paenarthrobacter sp.AT-5，保藏号为CGMCC No.28595转接到LB平板上30℃活化培养过夜，挑取单菌落接种在LB液体培养基中25℃培养12h，4500rpm离心10min收集菌体，而后用磷酸盐缓冲液清洗3次，将菌体悬浮于含5％海藻糖的磷酸盐缓冲液中，得到降解菌菌液，采用稀释法调整菌液OD600为1，菌液的有效活菌数为5.6×10

需要说明的是，菌株Paenarthrobacter sp.AT-5，由南京农业大学蒋建东教授团队筛选，于2023年10月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.28595。该菌株可有效降解阿特拉津，12h内可使20mg/kg的阿特拉津降解97％。

S2、将步骤S1得到的降解菌菌液与载体、粘合剂和磷酸盐缓冲液按一定质量份混合，其中降解菌菌液45-55份、载体5-15份、粘合剂0.5-1份，优选降解菌菌液50份、载体10份、粘合剂1份，更优选将50份降解菌菌液、10份蒙脱土、1份黄原胶和39份含5wt％海藻糖的磷酸盐缓冲液混合，得到降解菌种子菌衣剂。

所述载体为蒙脱土、生物炭、膨润土、硅藻土、粘土、泥炭土中的一种或多种，优选蒙脱土，载体为降解菌提供了相对稳定的生存环境，便于降解菌定殖；所述粘合剂为黄原胶、阿拉伯胶、聚乙烯醇、壳聚糖、羧甲基纤维素钠中的一种或多种，优选黄原胶，粘合剂便于后续应用过程中与种子有效结合。

采用本发明的种子菌衣剂以缓解大豆阿特拉津残留药害，具体包括以下步骤：

S1、大豆种子消毒：用75％体积分数的乙醇浸泡大豆种子30s，再用1％体积分数的NaClO溶液浸泡5min，最后用去离子水清洗多次，得到消毒后的大豆种子；

S2、将消毒后的大豆种子在上述种子菌衣剂中浸泡一定时间，优选1-3min，更优选2min；而后将大豆种子自然风干，得到具有菌衣的大豆种子；

S3、将具有菌衣的大豆种子播种在阿特拉津残留为1～10mg/kg的环境中，能够缓解阿特拉津对大豆幼苗的生长抑制。

需要说明的是，选用的大豆种子的品种是吉农28，具体的培养条件为25℃下光照14小时，20℃下黑暗10小时。通过采用上述种子菌衣剂进行阿特拉津降解菌接种，能够使每颗大豆种子获得可观的降解菌数量，从而显著改善阿特拉津残留胁迫下的大豆生长状况，减少大豆植株阿特拉津的累积量，提高叶片叶绿素含量、氮含量与大豆生物量。

实施例1

本实施例的一种缓解大豆阿特拉津残留药害的含菌衣种子的制备方法，包括以下步骤：

(1)将降解菌菌株Paenarthrobacter sp.AT-5，保藏号为CGMCC No.28595转接到LB平板上活化培养，而后挑取单菌落接种在LB液体培养基中25℃培养12h，4500rpm离心10min收集菌体，用PBS清洗3次，将菌体悬浮于含5％海藻糖的磷酸盐缓冲液中，得到降解菌菌液，采用稀释法调整菌液OD

(2)按质量份计，将50份降解菌菌液、10份蒙脱土、1份黄原胶和39份含5％海藻糖的磷酸盐缓冲液混合，得到降解菌种子菌衣剂；

(3)用75％体积分数乙醇与1％体积分数的NaClO溶液消毒后的大豆种子在降解菌种子菌衣剂中浸泡2min，而后将大豆种子自然风干后获得具有菌衣的大豆种子。

将具有菌衣的大豆种子进行稀释平板计数，获得大豆种子有效活菌数为1.66×10

实施例2

本实施例主要考察具有阿特拉津降解菌菌衣的大豆种子在阿特拉津残留环境中的播种情况，其中，初始阿特拉津残留浓度为1mg/kg。具体步骤如下：

(1)根据实施例1的步骤制备具有菌衣的大豆种子，将其播种在初始阿特拉津浓度为1mg/kg的无菌细沙中，播种深度2cm，在光照培养箱中培养，昼夜温度分别为25℃和20℃，光照14h，黑暗10h，每三天称重法补充水分；

(2)播种20天后，大豆第一片三出复叶已完全展开，以便携式SPAD仪测定真叶SPAD值和含氮量，测定大豆植株地上部与地下部的长度与鲜重，同时参考植物源性食品中331种农药及其代谢物残留量的测定GB 23200.121-2021，QuEChERS方法提取，液相色谱-质谱联用法测定地上部与地下部阿特拉津残留量。

由图2可以看出，阿特拉津残留导致叶片明显黄化，具有菌衣的大豆叶片黄化现象得到缓解。此外，由图5和图6可以看出，在初始阿特拉津浓度为1mg/kg的环境下，具有菌衣的大豆种子播种后大豆真叶SPAD值增加了18.0％，含氮量增加了14.2％，明显改善大豆叶片的光合特性。由图7-9可以看出，在1mg/kg的低浓度阿特拉津残留下，具有菌衣的植株生物量并无显著差异。由图10可以看出，具有菌衣的大豆植株对阿特拉津的累积量显著下降，地上部阿特拉津残留减少了47.4％，地下部阿特拉津残留减少了92.3％。

实施例3

本实施例的基本内容同实施例1，不同之处在于：初始阿特拉津残留浓度为5mg/kg。

由图3可以看出，阿特拉津残留导致叶片明显黄化，甚至导致叶片脱落，具有菌衣的大豆叶片黄化现象得到缓解。此外，由图5和图6可以看出，在初始阿特拉津浓度为5mg/kg的环境下，具有菌衣的大豆种子播种后大豆真叶SPAD值增加了49.3％，含氮量增加了37.1％，明显改善大豆叶片的光合特性。由图7-9可以看出，在5mg/kg的中浓度阿特拉津残留下，具有菌衣的植株只有地上部生物量显著增加了13.9％。由图11可以看出，具有菌衣的大豆植株对阿特拉津的累积量显著下降，地上部阿特拉津残留减少了95.1％，地下部阿特拉津残留减少了98.7％。

实施例4

本实施例的基本内容同实施例1，不同之处在于：初始阿特拉津残留浓度为10mg/kg。

由图4可以看出，阿特拉津残留导致叶片明显黄化，甚至导致叶片脱落，具有菌衣的大豆叶片黄化现象得到缓解。此外，由图5和图6可以看出，在初始阿特拉津浓度为10mg/kg的环境下，具有菌衣的大豆种子播种后大豆真叶SPAD值增加了87.0％，含氮量增加了60.2％，明显改善大豆叶片的光合特性。由图7-9可以看出，在10mg/kg的高浓度阿特拉津残留下，具有菌衣的植株生长状态得到明显改善，地上部长度增加了47.3％，地上部鲜重增加了57.4％，地下部鲜重增加了26.5％。由图12可以看出，具有菌衣的大豆植株对阿特拉津的累积量显著下降，地上部阿特拉津残留减少了91.2％，地下部阿特拉津残留减少了99.5％。

本发明将除草剂阿特拉津高效降解菌Paenarthrobacter sp.AT-5制备成种子菌衣剂用于缓解大豆阿特拉津残留药害，可以明显减少大豆植株中阿特拉津的积累，提升叶片叶绿素含量与含氮量，明显改善植株生长状况，具有用于缓解长期种植玉米造成的土壤阿特拉津残留导致大豆药害的潜力，为促进种植结构转变以提升大豆自给率提供一种解决大豆阿特拉津残留药害的方案。

以上示意性的对本发明及其实施方式进行了描述，该描述没有限制性，所用的数据也只是本发明的实施方式之一，实际的数据组合并不局限于此。所以，如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出于该技术方案相似的实施方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。