一种盐裂皮肤的制备方法和其间接免疫荧光检测方法

技术领域

本发明涉及一种医学检测技术，具体涉及一种盐裂皮肤的制备方法和其间接免疫荧光检测方法。

背景技术

盐裂皮肤-间接免疫荧光技术被广泛用于自身免疫性表皮下水疱病的检测, 该技术可将表皮和真皮在透明层下部进行分离，从而将基底膜带抗原分为表皮侧抗原和真皮侧抗原，其中BP180、BP230、整合素α6β4位于表皮侧，而VII型胶原、层粘连蛋白γ1、层粘连蛋白332位于真皮侧，可以根据盐裂皮肤-间接免疫荧光表皮侧或是真皮侧线状阳性的荧光模式，对自身免疫性表皮下水疱病进行初步分类。

传统制备盐裂皮肤的方法为：（1）取正常人皮肤，去除皮下脂肪，切成0.5cm ×0.5cm皮肤小块；（2）将切好的皮肤小块放入盛有1mol/l NaCl的烧杯中，将烧杯置于磁力搅拌器上，在溶液中放入转子，整套装置放在4℃冰箱中；（3）调节磁力搅拌器转速，使皮肤小块轻轻飘起，低速旋转48h-72h；（4）用镊子轻轻夹持表皮，判断是否与真皮分离，若分离不理想，则放入烧杯中继续旋转；（5）取出盐裂皮肤，用滤纸吸干水分，OCT包埋；（6）将OCT包埋的盐裂皮肤，切成6μm厚的冰冻切片，-80℃保存。

该方法不仅步骤繁琐和耗时长，需要有专门的4℃冰箱及磁力搅拌器等仪器装置，而且旋转速度不易控制，物理旋转偏快，易导致表皮与真皮完全分离；物理旋转过慢，导致真表皮分离时间延长，或者盐裂皮肤分离不充分，从而影响盐裂皮肤底物的使用。

PBS是磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline），一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用。它是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，由于Na2HPO4和KH2PO4它们有二级解离，缓冲的pH值范围很广；而NaCl和KCl主要作用为增加盐离子浓度。

OCT包埋剂英文全称：optimal cutting temperature compound，是一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，已广泛用于免疫组化实验室中，其用途是在冰冻切片时支撑组织，以增加组织的连续性，减少皱折及碎裂。又因OCT混合物为水溶性，故在漂片时可溶于水，所以在以后的染色中不会增加背景染色。 利用OCT混合物（optimal cuttingtemperature compound）预先浸润组织，然后再进行恒冷箱切片，使切片质量得到改善。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种盐裂皮肤的制备方法和其间接免疫荧光检测方法，其具体技术方案如下：

一种盐裂皮肤的制备方法，包括以下步骤，

（1）取正常人皮肤，去除皮下脂肪，切成0.5cm×0.5cm皮肤小块；

（2）将切好的皮肤小块，浸没在盛有1mol/l NaCl的50ml离心管中，把离心管倒置于25℃的室温环境中，直接浸泡皮肤20h -24h，形成盐裂皮肤；

（3）取出盐裂皮肤，用滤纸吸干盐裂皮肤的水分，用OCT包埋盐裂皮肤；

（4）将OCT包埋的盐裂皮肤，切成厚度为6μm的盐裂皮肤-冰冻切片，置于-80℃环境中保存（不要超过半年）。

盐裂皮肤的间接免疫荧光检测方法，包括以下步骤，

步骤一：取出盐裂皮肤-冰冻切片，常温下用PBS清洗2次，每次清洗5min，并用去离子水漂洗1次，然后吹干。

步骤二：以体积比1：10的比例，用PBS稀释待测血清，形成血清稀释液；

步骤三：滴加30ul步骤二制得的血清稀释液至权利要求1所得的盐裂皮肤切片上，然后，将盐裂皮肤切片置于37℃湿盒内，孵育30min，孵育完成后，取出，用PBS清洗3次，每次清洗5min，再用去离子水漂洗1次，并吹干，得到免疫后的盐裂皮肤切片；

步骤四：以体积比1：300的比例，用PBS稀释山羊抗人FITC-IgG、FITC-C3，以体积比1：30的比例，用PBS稀释山羊抗人FITC-IgA，分别得到山羊抗人FITC-IgG、FITC-C3和FITC-IgA二抗稀释液；

步骤五：分别滴加30ul二抗稀释液至步骤三制得的免疫后的盐裂皮肤切片上，然后将免疫后的盐裂皮肤切片置于37℃湿盒内孵育30min，孵育完成后，取出，PBS清洗3次，每次清洗5min，再用去离子水漂洗1次，并吹干，得到免疫荧光切片；

步骤六：将步骤五中得到的免疫荧光切片置于荧光显微镜FITC模式下观察结果，判断盐裂皮肤表皮侧或真皮侧是否有荧光物质呈线状沉积。

本发明的有益效果是：

在制备盐裂皮肤过程中，具有以下优点：1、不需要4℃冰箱、磁力搅拌器等仪器装置，直接放在室温浸泡就行，去除了物理旋转这一变量，极大的简化了操作步骤； 2、制备盐裂皮肤的时间明显缩短，新方法仅需20h-24h，而传统方法通常需要48-72h。

本发明制备的盐裂皮肤切片进行间接免疫荧光检测过程中，具有以下优点：与传统方法相比，敏感性明显优于传统方法制备的盐裂皮肤，检测灵敏度更高。

附图说明

图1为本发明方法制备的盐裂皮肤切片，荧光检测结果图：

其中：图1（A）为大疱性类天疱疮血清显示表皮侧呈线状沉积；

图1（B）为获得性大疱性表皮松解症血清显示真皮侧呈线状沉积；

图1（C）为抗Lamininγ1抗体显示真皮侧呈线状沉积；

图1（D）为抗Lamininα3抗体显示真皮侧呈线状沉积。

具体实施方式

为了深入了解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

收集2019年8月至2020年8月在中国医学科学院皮肤病医院就诊，并行自身免疫性水疱病血清学检查的20例大疱性类天疱疮患者血清，患者均签署知情同意书。以上述的20例患者血清进行本发明的间接免疫荧光检测试验，实验例用本发明制备盐裂皮肤的方法来获得盐裂皮肤切片，对比例用背景技术介绍的传统方法制备的盐裂皮肤切片，结合实验例和对比例，比较得出应用本发明制备方法所得的盐裂皮肤切片检测灵敏度更高。

间接免疫荧光检测试验的主要试剂包括NaCl溶液、OCT包埋液、山羊抗人FITC-IgG。

本发明的盐裂皮肤的制备包括以下步骤：

1）取正常人皮肤，去除皮下脂肪，切成0.5cm×0.5cm皮肤小块；

2）将切好的皮肤小块，放入盛有1mol/l NaCl的50ml的离心管中，把离心管倒置于25℃的室温，直接浸泡皮肤20h-24h；

3）取出盐裂皮肤，用滤纸吸干水分，OCT包埋；

4）将OCT包埋的盐裂皮肤，切成6μm厚的冰冻切片，-80℃保存。

本发明的盐裂皮肤-间接免疫荧光检测包括以下步骤：

1）取出冰冻切片，PBS清洗5min 2次，并用去离子水漂洗1次，吹干；

2）以PBS从1：10到1：40960 呈倍比稀释待测血清；

3）滴加30ul血清稀释液至切片上，37℃湿盒内孵育切片30min，PBS清洗5min 3次，去离子水漂洗1次，吹干；

4）以1：300 PBS稀释山羊抗人FITC-IgG；

5）滴加30ul二抗稀释液至切片上，37℃湿盒内孵育切片30min，PBS清洗5min 3次，去离子水漂洗1次，吹干；

6）切片吹干后，置于荧光显微镜FITC模式下观察结果；盐裂皮肤表皮侧呈线状沉积，则判读为阳性结果。

为了进一步比较，不同方法制备的盐裂皮肤切片，在间接荧光检测上是否存在差异，本实施例选择了20例大疱性类天疱疮患者血清，采用倍比稀释法，比较相同患者在2种不同盐裂皮肤切片上的滴定抗体滴度。结果显示：20例BP患者均为表皮侧IgG线状沉积模式。在室温浸泡24h盐裂皮肤、及传统4℃旋转盐裂皮肤这两种底物（盐裂皮肤切片）上，滴定抗体滴度中位数分别为5120、1280。室温浸泡24h盐裂皮肤效果优于原有4℃旋转的传统盐裂方法，其中有19例（95%）患者的滴定滴度，比传统盐裂方法高出1-5个倍比稀释度（见表1）。

表1

综上所述，采用室温（25℃）1mol/lNaCl浸泡法，来制备盐裂皮肤，不仅皮肤分离时间更短，简化了操作步骤，而且在BP运用中，敏感性优于传统盐裂方法。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。