鸭疫里氏杆菌phoR基因部分片段缺失弱毒株及应用

技术领域

本发明属于动物细菌基因工程技术领域，具体涉及鸭疫里氏杆菌phoR基因部分片段缺失弱毒株及应用。

背景技术

鸭传染性浆膜炎(infectious serositis of duck)又称鸭疫里氏杆菌病，是感染家鸭、家鹅、火鸡和多种家禽和野禽的一种急性、接触性、败血性传染病。临床诊断表现特征为困乏，眼与鼻腔有分泌物，绿色排泄物，共济失调和抽搐，慢性病例可呈现斜颈临诊症状。病理变化以纤维素性心包炎，肝周炎，气囊炎和脑膜炎为特征(郭玉璞1986)。早在1932年，美国纽约州的长岛地区有鸭传染性浆膜炎病例报道，随后在澳大利亚、英国、苏联等国家和地区蔓延。我国最早于1982年首次报道本病，目前在山东、四川、湖北、广东等养鸭省份均有鸭疫里氏杆菌感染的报道。该病发病率和致死率均较高，患病家禽的致死率高、生长缓慢、品质下降、饲料回报率低和养殖成本增加等，给养鸭业造成了巨大的经济损失，是目前危害养鸭业最为严重的细菌性传染病之一。

鸭疫里氏杆菌(Riemerellaanatipestifer，RA)是引起鸭传染性浆膜炎的病原，曾经被称为鸭疫巴氏杆菌(Pasteurella anatipestifer，PA)，1993年，Segers等根据鸭疫里氏杆菌DN A-核糖体RNA杂交分析、蛋白质和脂肪酸的组成以及表型特点，建议将其单独设立一个里氏杆菌属(Riemerella)得到认同。该菌为革兰阴性小杆菌，无芽胞，不能运动，有荚膜，病料中的菌体经瑞氏染色呈两极浓染。首次分离可将心、肝、脑、血等病料划线接种于TS A(胰蛋白胨大豆琼脂)或巧克力琼脂平板，在含5％-10％CO

鸭疫里氏杆菌通常不发酵碳水化合物，但少数菌株能发酵果糖、麦芽糖、葡萄糖等产酸不产气。本菌不能分解蛋白胨中的色氨酸，因此生化试验不能产生吲哚，同时也不能分解含硫氨基酸产生硫化氢，但是有极少数菌株吲哚试验阳性。不还原硝酸盐，不水解淀粉，过氧化氢酶、接触酶、磷酸酶、磷胺酶、酯脂酶C8均为阳性，不利用枸橼酸盐。一般来说，鸭疫里氏杆菌对青霉素、链霉素、壮观霉素、红霉素等多种抗生素敏感，对卡那霉素、庆大霉素等有抵抗力。

凝集试验和琼脂扩散试验都被用于RA的血清分型。1995年国际上已经确认的血清型有21个，并一直有新的血清型出现。鸭疫里氏杆菌血清型很多，同时也很复杂，在不同的国家和地区血清型不同，且呈现动态变化。Sandhu等报道美国存在的菌株血清型有1-3、5 -8、11-17，但以1、2、5型为主要血清型。Bisgaard报道丹麦存在的血清型有1-3、7、1 0、12和13型，但以1型和3型为主要血清型。Timms和Marshall报道英国存在的血清型有1-10型，但是以1型和2型为主要血清型。Loh等报道新加坡存在的血清型有1、 2、6、10、11和14-19型，但主要血清型为1、10和15型。Pathanasophon等报道泰国主要的血清型为血清1型。中国第一次分离的鸭疫里氏杆菌是血清1型菌株，但其它血清型随后逐渐被报道。高福等对我国北京、广东、上海等地区分离的222株鸭疫里氏杆菌菌株进行血清学鉴定发现均为血清1型。对北京和河南两个地区286株鸭疫里氏杆菌菌株进行血清型分型，发现至少有6种血清型。张大丙等对我国流行的鸭疫里氏杆菌菌株的血清型进行了统计分析，结果显示有1、2、6、7、10、11、13、14、15、17共10个血清型，并以1、2、6、10这4种血清型为主。程安春等报道，我国除现有的21种鸭疫里氏杆菌血清型外，还发现了22-25四种新的血清型。由于鸭疫里氏杆菌的血清型众多，且各血清型之间无交叉保护或存在较弱的交叉保护性，导致鸭疫里氏杆菌病的防治十分困难。因此针对鸭疫里氏杆菌流行优势血清型研制单价或多价弱毒活疫苗为将防控鸭疫里氏杆菌病的防控提供重要手段。

尽管国内外学者已开始对鸭疫里氏杆菌的弱毒活疫苗进行了研究，但迄今为止还没有一个商品化的鸭疫里氏杆菌弱毒活疫苗问世。我们前期研究发现Cas9基因是鸭疫里氏杆菌的毒力相关基因，在鸭疫里氏杆菌RA-YM菌株中敲除Cas9基因后，缺失株毒力较亲本株下降了约317倍，但其免疫原性较好，可用于作为弱毒活疫苗候选菌株。与亲本株相比，Cas9基因缺失株对雏鸭的致病性降低了，但仍具有较高的致病力，因此我们希望获得毒力更低，且具有较好免疫原性的基因缺失株。

针对上述问题，申请人通过对鸭疫里氏杆菌的基因组进行生物信息学分析，发现在鸭疫里氏杆菌云梦株(RA-YM)中存在RAYM_RS09735/RS09740双组份信号系统，进一步通过转录组学分析确定该双组份系统为PhoP/PhoR双组份信号系统，该双组份系统为革兰阴性菌中首次报道的一对新双组份系统。申请人前期的研究中发现PhoP/PhoR双基因缺失株对雏鸭的半数致死量(LD

发明内容

本发明的主要目的在于提供一株鸭疫里氏杆菌phoR基因部分片段缺失弱毒株，与亲本相比，该菌株毒力显著降低，对雏鸭的致病性显著降低，但保留了免疫原性，该菌株已于2 020年8月18日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer)YMΔphoR，保藏编号：CCTCC NO:M2020432，地址：中国武汉武汉大学。

本发明的另一个目的在于提供鸭疫里氏杆菌基因缺失突变菌株在制备鸭疫里氏杆菌弱毒疫苗中的应用，利用该菌株制备的弱毒疫苗，经免疫接种后对雏鸭能提供良好的免疫保护。为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

以鸭疫里氏杆菌血清1型湖北云梦分离株(RA-YM)为出发菌株，通过对其PhoP/PhoR双组份信号系统中的phoR基因进行部分基因片段的缺失，利用接合转移方法构建phoR 基因部分片段缺失株。同时通过连续传代筛选出能稳定遗传的phoR基因部分片段缺失突变株。该菌株已于2020年8月18日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：鸭疫里氏杆菌(Riemerellaanatipestifer)YM△phoR，保藏编号：CCTCC NO:M2020432，地址：中国武汉武汉大学。

该基因缺失株与亲本株生理生化特性基本一致，不利用葡萄糖、阿拉伯糖和蔗糖等糖类，在添加3％-5％新生牛血清的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中生长良好。

鸭疫里氏杆菌ΔphoR在制备鸭疫里氏杆菌弱毒疫苗中的应用，包括利用该菌株作为唯一有效成分，或与其他有效成分制备成鸭疫里氏杆菌弱毒疫苗。

与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：

1.本发明首次发现通过将鸭疫里氏杆菌中PhoP/PhoR双组份信号系统中的PhoR基因的部分进行缺失，获得了可稳定传代的弱毒株，该毒株的毒力大幅度下降，但保留了其免疫源性，为探讨鸭疫里氏杆菌致病机理及研制基因工程活疫苗提供了依据。

2.本发明所得到的鸭疫里氏杆菌phoR基因缺失突变株的毒力显著降低，与亲本株相比，phoR基因缺失株的毒力下降了约1.0×10

3.本发明所得的phoR基因缺失株与传统灭活疫苗相比，其生产工艺简单，生产成本较低，通过给雏鸭免疫接种，能提供良好的免疫保护。

4.本发明所用到的亲本菌株是申请人从湖北云梦某养鸭场分离鉴定，其血清型为血清1型，血清1型是我国目前流行最广的血清型，因此以该菌株构建的phoR基因缺失菌株为进一步研制鸭疫里氏杆菌弱毒活疫苗具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明的总体技术路线图。

图2为本发明中的鸭疫里氏杆菌phoR基因缺失株的PCR鉴定示意图。

泳道1.PCR扩增RA-YM phoR基因；泳道2.PCR扩增RA-YM Spec基因；泳道3.PCR 扩增RA-YM phoP基因；泳道4.PCR扩增△phoRphoR基因；泳道5PCR扩增△phoRSpe c基因；泳道6.PCR扩增△phoRphoP基因；泳道M.DL 5000DNA marker。

图3为鸭疫里氏杆菌phoR基因缺失株的生长特性示意图。

图4为鸭疫里氏杆菌phoR基因缺失株24h血液与组织载菌量的测定结果示意图。

图5为鸭疫里氏杆菌phoR基因缺失株48h血液与组织载菌量的测定结果示意图。

图6为鸭疫里氏杆菌phoR基因缺失株感染雏鸭24h病理切片观察结果示意图。

图7为鸭疫里氏杆菌phoR基因缺失株感染雏鸭48h病理切片观察结果示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施步骤对本发明进行详细地说明。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术，所述试剂或材料如未特备说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

(1)鸭疫里氏杆菌基因缺失突变菌株YM△phoR的获得：

根据NCBI中提供的RA-YM基因组序列，利用premier 5.0设计三对引物分别扩增其可用于Overlap PCR的左右臂以及壮观抗性基因。在左臂的上游引物5’-端加入Kpn I酶切位点，在右臂的下游引物5’-端引入Sac I酶切位点。所述引物序列如下：

PhoR L-F：5’ctGGTACCgccttggtttcttactctttcatccatcatagag 3’

PhoR L-R：5’AACGTGAGTTTTCGTTCCACTGatagatataataggaataaatttgttacgcac 3’

PhoR Spec F：5’gtgcgtaacaaatttattcctattatatctatCAGTGGAACGAAAACTCACGTT3’

PhoR Spec R：5’ttaaatcattggaagttttacaataaaggtacCAGTAGTTTTAAAAGTAAGCACCTG 3’

PhoR R-F：5’CAGGTGCTTACTTTTAAAACTACTGTTgtacctttattgtaaaacttccaatgatttaa 3’

PhoR R-R：5’aGAGCTCactttatctatcatctgtagaactctatttgc 3’

以鸭疫里氏杆菌RA-YM株基因组为模板，分别扩增纯化左臂，Spec和右臂，通过Overlap PCR将三片段连接，反应体系如下：KOD酶1μL，10×KOD Buffer 5μL，10m mol/LdNTPs 5μL，MgSO

以含有待转化质粒的E.coli X7213菌株为供体菌，鸭疫里氏杆菌血清1型云梦株(RA- YM)为受体菌，采用接合转移的方法构建缺失株。具体方法如下：供体菌和受体菌分别在适合的琼脂平板上培养过夜，受体菌接种于TSB培养基中，37℃200r/min振荡培养12-16h。供体菌接种于含有适当抗生素的LB液体培养基中，37℃200r/min振荡培养过夜。供体菌和受体菌分别复苏培养5-6h，直至OD600达到0.8左右。5000r/min离心3min，分别收集供体菌和受体菌。用1mL 10mmol/L的MgSO

挑取在含壮观霉素的平板上生长的细菌克隆为候选突变株，将长出菌落在含壮观霉素的 TSA平板上连续传5代能够正常生长的菌株作为阳性菌株进行PCR鉴定，本发明中挑选出了5株。以引物phoR Spec F和phoR Spec R扩增突变株内部的Spec抗性基因片段，判断转导的发生与否。以引物PhoP F/R(phoP F：ATGAGCAACAGGATATTATTAGTAGAA GATGACCAAAG，phoP R：ATTTTTAACTAGAAGCCTAAACCCTTCCCCGTGTACATT)， PhoR F/R(phoR F：AGGAATATTATAGCTCTATTGAAGAAGAATTCGC，phoR R：CATT TCGTTCCTCTCTAACTTTGACATATTG)扩增待缺失的phoP和phoR基因。phoR基因缺失菌株中phoR片段扩增结果为阴性，phoP和Spec基因扩增结果呈阳性；而在RA-YM菌株中，phoP和phoR基因片段扩增呈阳性，Spec扩增结果为阴性，这说明RA-YMphoR基因缺失株构建成功(图2)。该菌株缺失的phoR基因的核苷酸序列片段为SEQID NO.1所示。

在添加100μg/mL壮观霉素和3-5％新生牛血清的胰蛋白胨大豆肉汤/琼脂琼脂培养基中继续连续传代培养，并进行检测，最终筛选出一株在连续传代培养10代以上均能正常生长，经检测未出现回复突变的基因缺失株，表明该缺失株具有良好的遗传稳定性。

(2)RA-YMphoR基因缺失菌株的生长曲线测定

将过夜培养的RA-YMphoR基因缺失突变株与亲本株RA-YM以1:1000的比例转接至10mL的TSB培养中，37℃，200r/min振荡培养，每隔1h取出100μL的菌液，用分光光度计测OD

该菌株已于2020年08月18日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：鸭疫里氏杆菌(Riemerellaanatipestifer)YMΔphoR，保藏编号：CCTCC NO:M2020432，地址：中国武汉武汉大学。在本发明实施例中，该基因缺失株或称为ΔphoR、RA-YMphoR基因缺失菌株或RA-YMΔphoR。

该基因缺失株与亲本株生理生化特性基本一致，不利用葡萄糖、阿拉伯糖和蔗糖等糖类，在添加3％-5％新生牛血清的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中生长良好。

实施例2：

RA-YMphoR基因缺失菌株的LD

分别准备新鲜培养的鸭疫里氏杆菌phoR基因部分片段缺失株以及RA-YM亲本株，以5 000r/min离心3min，用PBS重悬，再次离心，重复3次；测定细菌OD

改良寇氏法公式：LgLD

在以上公式中，Xk为最高剂量对数，i为相邻剂量比值对数，ΣP为各组死亡率的组合， Pm为组内最高死亡率，Pn为组内最低死亡率。

结果如表1所示，本次试验亲本株RA-YMLD

表1鸭疫里氏杆菌phoR基因缺失突变株与RA-YM株接种雏鸭死亡情况

感染雏鸭组织和血液载菌量测定

将12日龄樱桃谷肉鸭分成三组，每组6只。分别准备新鲜培养的鸭疫里氏杆菌phoR基因缺失株以及亲本株，以5000r/min离心3min，用PBS重悬，再次离心，重复3次；测定细菌OD600值。分别按0.2mL/只(5.0×10

感染雏鸭病理切片制作

对上述中鸭疫里氏杆菌phoR基因缺失株以及亲本株感染雏鸭进行剖检，观察其病理变化，重点观察脑，心脏，肝脏，脾脏的变化，有无出血、坏死、表面的纤维素覆盖情况等症状。取其病变明显的部位置于10％福尔马林中固定，再用石蜡包埋后，切出4μm宽的组织切片，制作HE染色切片，在光学显微镜下观察。结果如图6，图7所示，空白组与Δph oR组鸭肝脏、心脏、脾脏和脑组织的切片均未见明显组织病变；RA-YM感染组鸭心肌组织结构异常，部分心肌纤维排列紊乱，心肌间隙并可见大量炎症细胞浸润，个别心肌细胞坏死变性；肝组织结构异常，肝细胞广泛脂肪变性，汇管区可见炎症细胞浸润，少量细胞坏死变性；脾组织结构异常，部分淋巴细胞坏死变性，细胞核碎裂、固缩；脑组织结构异常，部分神经元核固缩深染，出现嗜神经细胞现象，周围可见胶质细胞围绕吞噬，以上结果表明Δp hoR感染雏鸭24h和48h，缺失株对雏鸭组织器官侵袭力显著降低。

实施例3：

RA-YMphoR基因缺失突变株转录组测序分析

将RA-YMΔphoR菌株和野生株RA-YM在TSA培养基上培养，挑单菌落在TSB培养基中37℃培养过夜，然后以1:100的比例转接至TSB培养基中，37℃200r/min振荡培养，待其OD

通过转录组测序对RA-YMΔphoR菌株与亲本株RA-YM的差异表达基因进行分析。结果显示phoR基因缺失突变菌株与亲本株RA-YM相比表达差异在2倍或2倍以上的基因共 243个，其中表达上调的基因有97个，表达下调基因的有146个。

实施例4：

RA-YM phoR基因缺失菌株经脚蹼注射免疫雏鸭的攻毒保护性试验

选择鸭疫里氏杆菌抗原、抗体阴性的12日龄樱桃谷雏鸭15只，随机分为3组，每组5只，免疫接种采用脚蹼注射方式。第1组、第2组为RA-YMΔphoR菌株脚蹼注射免疫组(1. 0×10

表2鸭疫里氏杆菌phoR基因缺失株经脚蹼免疫雏鸭后攻毒保护率(存活数/总数)

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 鸭疫里氏杆菌phoR基因部分片段缺失弱毒株及应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 687

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagcaaca ggatattatt agtagaagat gaccaaagtt tcggagcggt gcttaaagat 60

tacctaagca taaataactt tgaagttacc cttgctacag acggcgagga aggtcttaaa 120

gaatatacaa ataacgattt tgatatttgt atatttgatg ttatgatgcc aaaaaaagac 180

ggcttcacat tagcagaaga tgttaagaaa ttagggaaaa atattccaat tatcttccta 240

acagcacgaa atttaagaga ggatatcttg aaaggttatc agttaggtgc agacgattat 300

ataacaaaac cttttgatac cgaactgtta ctttataaaa ttaaggcgat tttatccaga 360

agtacttctt tggaagaaga agagcaagag caatttagca ttagcaatat agagtttgac 420

tctatgttga ggcagcttaa agtacacgat aaagaatata aactttctcc aaaagagaac 480

gagcttttga agttgttttg tctccacaga aacgacttta tgcctagaga tttagcactt 540

cgtaaaatat ggaaaaaaga aaactatttt accgctagaa gtatggatgt atatatcgct 600

aaattaagaa aattgcttaa agatgatgat ggtctagaaa tcatcaatgt acacggggaa 660

gggtttaggc ttctagttaa aaattaa 687

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctggtaccgc cttggtttct tactctttca tccatcatag ag 42

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aacgtgagtt ttcgttccac tgatagatat aataggaata aatttgttac gcac 54

<210> 4

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgcgtaaca aatttattcc tattatatct atcagtggaa cgaaaactca cgtt 54

<210> 5

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttaaatcatt ggaagtttta caataaaggt accagtagtt ttaaaagtaa gcacctg 57

<210> 6

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caggtgctta cttttaaaac tactgttgta cctttattgt aaaacttcca atgatttaa 59

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agagctcact ttatctatca tctgtagaac tctatttgc 39

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgagcaaca ggatattatt agtagaagat gaccaaag 38

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atttttaact agaagcctaa acccttcccc gtgtacatt 39

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aggaatatta tagctctatt gaagaagaat tcgc 34

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

catttcgttc ctctctaact ttgacatatt g 31