电致化学发光免疫传感器

技术领域

本发明属于检测领域。

背景技术

电致化学发光，简称ECL，是在电位激励下电极表面附近产生的化学发光现象。联吡啶钌Ru(bpy)

Han等通过将Ru(bpy)

发明内容

本发明要解决的问题是：提供一种发光信号强的电致化学发光免疫传感器。

本发明的技术方案如下：

一种增强Ru(bpy)

所述复合物为纳米银AgNPs与还原型谷胱甘肽GSH的复合物。

如前述的复合物AgNPs：GSH，其特征在于：

该复合物的制备方法为：

AgNPs与GSH混合后在2～8℃充分反应，即得；优选地，反应温度为4℃；

和/或，AgNPs与GSH的物质的量之比为1.07∶100～1.07∶1800；优选地，为1.07∶200。

一种电致化学发光免疫传感器，它自下而上包括：电极、石墨烯层、银单质层，银单质层上表面吸附Ru(bpy)

所述诱饵蛋白为抗原或抗体，用于免疫结合待检测的抗体或抗原。

如前述的传感器，在未与诱饵蛋白结合的AgNPs：GSH的Ag结合有封闭剂；优选地，所述封闭剂是BSA。

一种电致化学发光免疫传感器的制备方法，包括如下步骤：

(1)均匀地在电极表面涂抹石墨烯，干燥后，形成石墨烯层；

(2)在石墨烯层表面覆盖银单质；

(3)在Ru(bpy)

(4)在Ru(bpy)

(5)在复合物AgNPs：GSH的银颗粒上修饰抗原或抗体。

进一步地，所述步骤(2)为通过电沉积将银离子转化为银单质，覆盖到石墨烯层表面；

优选地，银离子浓度10mmol/L，电沉积电位-0.2V，时间100s。

进一步地，所述步骤(3)中吸附时间为8min；

和/或，Ru(bpy)

一种检测蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将待检样本加到权利要求3或4所述传感器上孵育，如果样本中含有目标蛋白，则目标蛋白与诱饵蛋白免疫结合；

2)洗涤未免疫结合的蛋白；

3)将传感器置于缓冲液中，用电化学发光分析仪测定发光信号。

进一步地，所述缓冲液的pH为8。

本发明的有益效果：本发明的免疫传感器借助谷胱甘肽GSH聚集AgNPs(GSH-AgNPs)可增强Ru(bpy)

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：8-OHdG免疫传感器层层自组装构建示意图。

图2：AgNPs与AgNPs：GSH形貌表征HRTEM图及其粒径分布图和电位图(A)AgNPs电镜图，(B)AgNPs：GSH电镜图，(C)AgNPs粒径分布图，(D)AgNPs的Zeta电位图，(E)AgNPs：GSH粒径分布图，(F)AgNPs：GSH的Zeta电位图。

图3：电极组装信号响应趋势图。(a)GCE/Nafion-GO，(b)GCE/Nafion-GO/AgNPs/Ru(bpy)

图4：梯度浓度8-OHdG检测的电位-发光强度(E-I)响应图(A)及标准曲线(B)。

图5：四支电极不同Ag

图6：AgNPs电沉积圈数优化(AgNO

图7：联吡啶钌修饰时间优化(c

图8：联吡啶钌修饰浓度优化。

图9：AgNPs：GSH复合物比例优化。

图10：AgNPs、GSH、AgNPs：GSH复合物信号比较。

图11：最佳pH值筛选。

具体实施方式

实施例1一种电致化学发光免疫传感器及其使用方法

本实施例的传感器以八羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)为检测对象。8-OHdG是活性氧自由基如羟自由基、单线态氧等攻击DNA分子中的鸟嘌呤碱基第8位碳原子而产生的一种氧化性加合物，是一种DNA氧化性损伤的产物，现已作为多种炎症疾病的指标。

1.试剂的配制

磷酸缓冲液(PBS)的制备：配制0.1mol/L的PBS缓冲液，称取磷酸氢二钠7.098g、磷酸二氢钾6.805g和氯化钾3.728g置于烧杯内，加入一定量去离子水后，置于超声震荡仪中超声并搅拌至固体充分溶解，再全部转移到500mL量瓶内，定容至500mL。

石墨烯基底的制备：将200μL无水乙醇和300μL5％的Nation(全氟磺酸)加入1.5mL离心管内混合，再加入0.1g石墨烯固体，然后超声震荡至体系充分扩散。

10mmol/L AgNO

联吡啶钌(Ru(bpy)

还原型谷胱甘肽(GSH)的制备：配制浓度为0.2mol/L，精确称取GSH固体6.146g于50mL烧杯内，用加入10mL离子水溶解，4℃保存，使用期限为15天，过期后重新配制。

纳米银(AgNPs)的制备：合成制备前，把所有的玻璃仪器用铬酸清洗和浸泡，以保证所用的容器无杂质混入合成过程中。准备10mmol/L硼氢化钠75mL装于烧杯，再将烧杯置于磁力搅拌仪，设置1200r/min，同时逐滴加入提前配制的10mmol/L的AgNO

标准8-OHdG抗体：本实施例使用的标准8-OHdG抗体是8-OHdG ELISA试剂盒(上海雅吉生物科技有限公司，人8羟基脱氧鸟苷ELISA试剂盒)中的酶标抗体，按实验需求浓度1.5mg/mL，稀释比1∶300～1∶500稀释使用。试剂盒置于冰箱-20℃保存。

牛血清蛋白(BSA)的制备：固体药品置于冰箱-20℃保存，使用时，称取0.1g，用加入100mL去离子水，充分溶解后，取10mL该溶液加入90mL去离子水，配成0.01％的BSA溶液体系，用于封闭8-OHdG抗体蛋白质。使用期限为7天，过期后重新配制。

肝癌细胞(HepG2)提取液制备：本实施例使用的是实验室内培养的HepG2传代细胞。将HepG2细胞培养瓶置于超声频率为40±5kHz的超声仪，设置超声时间为10min来超声破壁，使培养瓶内的贴壁细胞脱落并破碎。再用移液枪吸取PBS缓冲液沿培养瓶底面反复吹洗5次，每次1mL，然后将液体全部转移至离心管，用高速离心机，设置转速为6000r/min，时间6min，制得HepG2的DNA悬浊液。向悬浊液加入蛋白裂解液2mL于55℃孵育过夜，然后加入10mL苯酚-酚-氯仿(25∶24∶1)，离心10min，再加入醋酸钠1mL和异丙醇10mL析出DNA，最后用20mL 70％乙醇洗涤、离心、弃上清。本实施例使用的HepG2传代细胞，细胞总数量为1×10

8-OHdG梯度浓度标准使用液制备：本实施例使用的标准8-OHdG抗原是8-OHdG的ELISA试剂盒(上海雅吉生物科技有限公司，人8羟基脱氧鸟苷ELISA试剂盒)中的标准抗原。从ELISA试剂盒中取8-OHdG标准液10μL，定容至10mL，制成1000μg/mL，即1×10

2.传感器构建方法

每次实验前，先对工作电极进行如下处理：用0.5μm和50nm的Al

传感器构建方法原理如图1所示。实验时使用6μL上述石墨烯基底涂抹电极表面，至均匀分散且覆盖完全(借助Nation的成膜性)，室温下使石墨烯干燥固定5分钟。然后将修饰电极没入AgNO

3.传感器使用方法

(1)标准曲线

将不同浓度的8-OHdG加到传感器上，37℃孵育60min，PBS洗涤，传感器置于0.1mol/L PBS(pH 8.0)溶液中，用电化学发光分析仪分别测定其ECL信号强度I

(2)检测

将样本加到传感器上，37℃孵育60min，PBS洗涤，传感器置于0.1mol/L PBS(pH8.0)溶液中，用电化学发光分析仪分别测定其ECL信号强度I

上述步骤(1)和(2)中，电化学发光分析仪参数设置如下：

电位设置参数为：正向扫描，初电位0.2V，低电位0.2V，高电位1.25V。

发光设置参数为：放大级数3，光电倍增管高压800V。

以下用实验例的形式对实施例1的传感器有益效果做进一步说明。

实验例1合成纳米材料的表征

采用高分辨透射电镜(HRTEM)对AgNPs(图2-A)和GSH聚集AgNPs之后的复合物(图2-B)的外观形貌进行表征。

由图2-A可知，在透射电镜下AgNPs呈斑点状散在分布，由图2-C，图2-D可以看出其优势分布粒径为10.10nm(23.41％)，优势分布电位为-5.06mV。图2-B为AgNPs：GSH复合物，呈圆珠状团聚分布，从图2-E和图2-F可知该复合物优势粒径为68.06nm(31.57％)，优势电位分布为-33.89mV。

说明GSH成功的通过共价结合聚集了AgNPs，负电荷增加，可增强复合物与Ru(bpy)

实验例2传感器每层材料叠加后的ECL信号强弱比较

分别在实施例1的基础上，将传感器构建过程中的石墨烯修饰后、电沉积纳米银并泡吸发光体Ru(bpy)

结果如图3所示。图中曲线a是裸电极修饰了Nation分散的石墨烯过后的ECL信号。曲线b是电极表面电沉积一层纳米银颗粒，并泡吸了发光体Ru(bpy)

本实验例的结果说明，AgNPs：GSH复合物可提高ECL信号，能保证抗体及BSA结合后电极仍能产生足够强的ECL信号，提高检测灵敏度。

实验例3标准曲线

取实施例1的传感器，检测不含抗原的缓冲液所得ECL信号值为2421(作为空白对照)。将8-OHdG标准配制液稀释到1×10

实验例4检出限

取实施例1的传感器，测出孵育抗原前的ECL信号，记为I

进行检出限的判定和计算。

实验结果：孵育8-OHdG抗原前，ECL信号I

表2为本方法同其他方法(安玲玲，路毛凤，邓玲玲等.8-羟基脱氧鸟苷在壳聚糖/石墨烯修饰电极上的电化学及DNA氧化损伤检测[J].应用化学，2014，31(2)：200-205；刘慧.基于核酸适体的8-羟基脱氧鸟苷光学传感方法研究[D].南华大学，2014.)对8-OHdG检测的检出限的比较。

表2目标ECL免疫传感器检测8-OHdG与其他方法检出限的对比

本实验例结果表明，本发明的传感器检测灵敏度极高。

实验例5精密度

使用实施例1的传感器和方法，检测肝癌细胞提取液(制备方法见实施例1)中8-OHdG浓度。结果如表3所示，测得三次检测均值间相对标准偏差小于5％，说明本发明的传感器和方法具有良好的精密度。

表3目标免疫传感器测定8-OHdG信号均值的精密度

实验例6准确度

取8-OHdG标准液加入检测底液(PBS，pH 8.0)分别稀释至0.01ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL然后各取3mL，使用实施例1的传感器和方法进行加标回收检测。三次检测ECL信号分别为1446、1845、2176，扣除孵育含0ng/mL 8-OHdG缓冲底液基底信号后，根据标准方程得结果如表4。可以看出加标量为0.01ng/mL和0.1ng/mL时，回收率在85％-130％之间，加标量为0.2ng/mL-10ng/mL时，回收率在90％-120％之间。

表4目标ECL免疫传感器的加标回收检测

本实验例结果说明：

本发明传感器在检测范围内具有较好的准确度。本方法同其他方法(李栋，张芹，张圣虎等.自制混合型小柱净化-高效液相色谱-串联质谱法同时测定尿液中有机磷酸酯代谢物和8-羟基-2′-脱氧鸟苷[J].色谱，2020，38(6)：647-654；杨明岐，袁悦，任建伟等.同位素稀释-亲水作用色谱串联质谱快速测定尿液中8-羟基脱氧鸟苷和可替宁的研究.四川大学学报(医学版)，2020，51(1)：74-80.)对8-OHdG的检测准确度相比，本发明传感器在0.2ng/mL-10ng/mL较高浓度检测范围具有更好的准确度(加标回收率更接近100％)。

实验例7实际样品检测

使用实施例1的传感器和方法，检测肝癌细胞HepG2提取液(制备方法见实施例1)中8-OHdG浓度。

检测所得ECL信号值分别为419、447、445，与孵育抗原前并扣除缓冲液空白值后ECL信号的差值ΔI分别为2266、2269、2262。因为提取时稀释到了10mL，所以带入标准曲线方程ΔI＝2149+342.751gc，得三次检测结果为c

用SPSS软件对三次检测结果与正常细胞内8-OHdG含量做了单样本的t检验，得到双侧检验P值为0.001，则P＜0.05，说明检测结果与正常值差异有统计学意义，可以认为用本免疫传感器检测的HepG2细胞内8-OHdG含量远高于正常细胞含量12.03±4.58ng/mL。

肝癌细胞中DNA损伤程度高于正常细胞，其内8-OHdG含量高于正常细胞，因此，本实验例检测结果符合本领域常识。

实验例8方法参数优化

本实验例中，除了已指明以外，未指明的参数与实施例1相同。本实验例同时选择了4个电极进行平行试验，电极编号分别为：4031、4032、GCE1、GCE6。

一、电沉积银修饰层条件优化

实验比较了浸泡吸附和电沉积两种方法固载AgNPs的效果。设置浸泡吸附时间为80s，电沉积圈数为4圈(8seg＝80s)，其他条件相同。

图5为两种修饰方法的信号结果比较。四组电极使用电沉积法响应信号都比使用浸泡吸附高，由此可知，修饰银使用电沉积方法比浸泡吸附效果更好。

在上述实验数据基础上，进行了电沉积AgNPs圈数优化。设置电沉积圈数(1圈＝2seg＝20s)优化系列为3圈(6seg)、4圈(8seg)、5圈(10seg)、6圈(12seg)、7圈(14seg)进行检测，结果如图6所示。由四组电极信号修饰结果可知，当电沉积AgNPs圈数(时间)为5圈时，即电沉积时间100s时，四组电极电致发光强度达到拐点。

本部分实验结果表明：对电极进行AgNPs修饰时，电沉积优于浸泡吸附，电极电沉积AgNPs最佳圈数(时间)为5圈。

二、联吡啶钌(Ru(bpy)

设置Ru(bpy)

在此基础上，对Ru(bpy)

本部分结果说明：Ru(bpy)

三、AgNPs：GSH复合物合成比例的优化

配制0.2mol/L的还原型谷胱甘肽(GSH)和1.07mmol/L的AgNP以备用。取一定量的AgNPs材料和一定量的还原型谷胱甘肽4℃混合搅拌反应30min制得复合物，再使用该复合物与电极进行4℃低温冷藏孵育，复合物孵育量为100μL，孵育时间为3-4小时。本次实验按AgNPs：GSH体积比为1∶9、1∶4、1∶2、1∶1、2∶1(物质的量之比依次为1.07∶1800、1.07∶800、1.07∶400、1.07∶200、1.07∶100)进行优化，用四组电极在相同条件下多次试验，实验结果如图9。

由结果可知，当AgNPs：GSH体积比为1∶1时，ECL信号进入平台期，所以确定AgNPs：GSH复合物的体积比为1∶1。

同时对该层的修饰材料进行比较选择，即在Ru(bpy)

本部分结果说明：GSH聚集AgNPs可以明显诱导阳极ECL信号增强。

四、检测底液pH优化

pH值影响着溶液中各物质的带电性，进而影响Ru(bpy)

本部分实验说明：pH＝8的缓冲液为最适ECL信号检测用缓冲液。

综上，本发明的免疫传感器借助谷胱甘肽GSH聚集AgNPs(GSH-AgNPs)可增强Ru(bpy)

应当知晓的是，将本发明的免疫传感器中8-OHdG抗体换成其他抗体，同样能用于检测其他物质，并取得相似的效果。