一种3-吲哚乙基(3’-甲基-2’-酮)戊酰胺的分离方法
文献发布时间:2023-06-19 10:33:45
技术领域
本发明属于农药领域,具体涉及一种3-吲哚乙基(3’-甲基-2’-酮)戊酰胺(以下简称Nematophin)的分离方法。
背景技术
昆虫病原线虫共生菌是研究共生关系的一种模式生物,目前已成为生物制药研究领域的开发热点。昆虫病原线虫共生细菌是一种肠杆科的革兰氏阴性细菌,寄生于昆虫病原线虫肠道内,包括致病杆菌(Xenorhabdus)和发光杆菌(Photorhabdus)属,分别与斯氏线虫(Steinernema)和异小杆线虫(Heterorhabditis)共生。共生的昆虫病原线虫可以直接作为一种生物制剂,主要通过提高植物免疫从而达到杀虫效果,已经成功应用在植物保护领域。除了具有防虫效果外,共生菌的次生代谢产物是抑菌、杀线虫、抗病毒、细胞毒素等化合物的丰富来源。因此,昆虫病原线虫共生菌的次生代谢产物已成为一类新型具有开发潜力和应用前景的新型生物资源。
目前,国内外对昆虫病原线虫共生菌的代谢产物的化学成分进行了大量的研究,至今已从共生菌代谢产物中分离得到上百种成分,主要为吲哚类化合物、酰胺类化合物、异睛类化合物、亚苄基酮类化合物、苯并芘类化合物、苯丙氨酸甲胺类物质、二硫吡咯类抑菌物、呋喃酮类物质、环肽和缩肽类化合物、可溶性蛋白类、儿茶酚亲铁类化合物、蒽醌类化合物、二苯乙烯衍生物、碳青霉烯类抗生素等多种化合物。提取致病杆菌中活性成分的方法有,超声提取法,溶媒萃取法等,提取溶剂一般为水、乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯等。致病杆菌分离活性化合物的方法有,硅胶柱层析法、葡聚糖凝胶柱层析法、超临界流体提取法、高速逆流色谱法等。
Nematophin的结构式为:
3-吲哚乙基(3’-甲基-2’-酮)戊酰胺(Nematophin)化合物是嗜线虫致病杆菌中一种主要的活性化合物。该化合物除了对农业上的一些植物病害具有较好的活性外,医药方面对金黄色葡球菌也表现出较高的活性(MIC,0.57mg/L)。此外,该化合物也具有较好的抗肿瘤活性。该化合物是Li et al.首次从X.nematophila BC1中分离鉴定。首先将BC1菌株发酵液经乙酸乙酯萃取,然后进行硅胶柱层析,采用100%三氯甲烷进行洗脱,得到Nematophin。许鹏等也从X.nematophila YL001发酵液的乙酸乙酯提取物中分离得到Nematophin,但分离流程与Li et al.的有一定的差异,其先将X.nematophila YL001菌株发酵液经乙酸乙酯萃取,后进行二次硅胶柱层析,采用石油醚-乙酸乙酯体系进行洗脱,对V
发明内容
本发明的目的在于提供一种3-吲哚乙基(3’-甲基-2’-酮)戊酰胺的分离方法,具体方案为:
一种3-吲哚乙基(3’-甲基-2’-酮)戊酰胺的分离方法,包括:致病杆菌属细菌(Xenorhabdus)的发酵液进行柱层析分离,收集含有3-吲哚乙基(3’-甲基-2’-酮)戊酰胺的组分;含有3-吲哚乙基(3’-甲基-2’-酮)戊酰胺的组分依次经减压浓缩及溶媒萃取即得;所述的溶媒为石油醚,石油醚与萃取对象的体积比为1:1。
可选的,含有3-吲哚乙基(3’-甲基-2’-酮)戊酰胺的组分依次经减压浓缩、水复溶及溶媒萃取即得;
所述的溶媒为石油醚,石油醚与水复溶物的体积比为1:1。
可选的,所述的柱层析分离过程包括:
嗜线虫致病杆菌细菌的发酵液经大孔树脂静态吸附12h,依次用5倍柱体积水、1倍柱体积的体积浓度为50%甲醇、1倍柱体积的体积浓度80%甲醇及3倍柱体积甲醇进行洗脱,收集甲醇洗脱液。
可选的,所述的大孔树脂选自XAD-11大孔树脂、XAD-12大孔树脂、Porapak S大孔树脂、HPD-600大孔树脂、XAD-9大孔树脂、XAD-10大孔树脂、XAD-7HP大孔树脂、LSA-10大孔树脂、LX-28大孔树脂、AB-8大孔树脂、DA大孔树脂、X-5大孔树脂、D320大孔树脂、D101大孔树脂、CAD-40大孔树脂、GDX-105大孔树脂、D大孔树脂和DM2大孔树脂。
可选的,溶媒萃取包括:
溶媒与待萃取对象每隔30min混匀一次,反复3~4次后收集石油醚萃液。
可选的,发酵液制备包括:
①种子液制备:菌种于LB培养基中,在28℃、摇床转速180r/min条件下,培养至对数期,用划线法在NBTA平板上室温培养48h,挑取蓝色单菌落于LB培养基中,培养温度28℃,转速180r/min,培养至对数期备用;
②发酵培养:将种子液以10%(V/V)接种于TSB培养基中,于温度28℃、摇床转速180r/min条件下培养3d。
可选的,取嗜线虫致病杆菌发酵液的上清液减压浓缩;
具体过程为:取发酵液的上清液,于40℃、0.1Mpa下浓缩至原体积的1/5。
可选的,嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)细菌选自X.nematophilaYL001、X.nematophila ALL、X.nematophila AN6和X.nematophila A24中的一株或两株以上的混合株。
可选的,将嗜线虫致病杆菌细菌浓缩液用1.5~2倍的水复溶,经大孔树脂静态吸附12h,以丙酮-水(丙酮-水体积比依次为:0:100、50:50、80:20、100:0)、乙醇-水(乙醇-水体积比依次为:0:100、50:50、80:20、100:0)、丙酮-水-0.01n盐酸(丙酮-水-0.01n盐酸体积比依次为:0:100、30:70)或甲醇-水-0.01N盐酸(甲醇-水-0.01N盐酸体积比依次为:0:100、30:70)为洗脱体系,依次洗脱经静态吸附12h嗜线虫致病杆菌细菌发酵液的大孔树脂层析柱,每种洗脱段分别用1~5倍柱体积洗脱,收集甲醇洗脱液、丙酮洗脱液、乙醇洗脱液、30%丙酮-0.01N盐酸洗脱液或30%甲醇-0.01N盐酸液为馏分;
馏分依次在40℃、0.1Mpa条件下减压浓缩、加5~7倍于浓缩液的水复溶及溶媒萃取即得;所述的溶媒为石油醚,石油醚与水复溶物的体积比为1:1,溶媒与待萃取对象每隔30min混匀一次,反复3次后收集石油醚萃液。
优选的,一种3-吲哚乙基(3’-甲基-2’-酮)戊酰胺的分离方法,X.nematophilaYL001发酵液的上清液经减压浓缩后得浓缩液;
浓缩液用1.5~2倍的水复溶,后经大孔树脂静态吸附12h,依次用5倍柱体积水、1倍柱体积50%甲醇、1倍柱体积80%甲醇、3倍柱体积甲醇进行洗脱收集甲醇洗脱液;
甲醇洗脱液的组分在40℃、0.1Mpa条件下减压浓缩、用5-7倍于浓缩液的水复溶及溶媒萃取即得;所述的溶媒为石油醚,石油醚与水复溶物的体积比为1:1,溶媒与待萃取对象每隔30min混匀一次,反复3~4次后收集石油醚萃液。
本发明中于虫致病杆菌属细菌中提取Nematophin的方法所采用的设备和方法简单,即使用的是常规的柱层析法及溶媒萃取法,而不需要硅胶、葡聚糖凝胶、超临界流体提取仪、高速逆流色谱仪等昂贵的试剂或仪器。大大简化了Nematophin的分离纯化设备,方法简便易行,成本低廉,且产品纯度可达95%以上,易于推广使用。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与下面的具体实施方式一起用于解释本公开,但并不构成对本公开的限制。在附图中:
图1为实施例1分离得到的Nematophin的HPLC检测图;
图2为Nematophin标品的HPLC检测图。
具体实施方式
以下如无特殊说明,实验中选用的试剂均为市售,实验中的液体比例均为体积比,未详述的实验方法均为本领域常规实验方法。
本发明提供了一种从嗜线虫致病杆菌细菌中提取Nematophin的方法,它包括如下步骤:
(1)供试细菌材料:将嗜线虫致病杆菌细菌发酵培养,离心,取上清,减压浓缩,制得A液备用。具体流程如下:
①种子液制备:取菌管保存的菌种于LB培养基中,28℃恒温培养,转速180r/min,培养至对数期,用划线法在NBTA平板上在室温培养48h,挑取蓝色单菌落于LB培养基中(培养温度:28℃,转速:180r/min),培养至对数期,备用;
②发酵培养:将种子液以10%(V/V)接种于TSB培养基中,于温度28℃、摇床转速180r/min条件下培养3d;
③上清液制备:将所得发酵液于4℃、10000r/min离心15min,留上清,后将上清于40℃、0.1Mpa下浓缩至原体积的1/5倍,4℃保存。
(2)柱层析分离纯化:
①用1.5-2倍于A液的蒸馏水(pH=7.0)复溶,用大孔树脂柱D101静态吸附12h,后依次用5倍柱体积蒸馏水(pH=7.0)、1倍柱体积50%甲醇、1倍柱体积80%甲醇、3倍柱体积甲醇洗脱。收集甲醇洗脱液,40℃、0.1Mpa条件减压浓缩,制得B液备用;
②将B液用5-7倍的蒸馏水(pH=7.0)复溶,后用石油醚(AR)萃取,萃取比例为石油醚(AR):水复溶物=1:1,每隔30min充分混匀一次,反复3~4次,后收集石油醚(AR)萃液,40℃、0.1Mpa条件下减压浓缩,制得Nematophin。
Nematophin的结构鉴定:Nematophin:浅黄色针状晶体,
本发明中嗜线虫致病杆菌细菌选自X.nematophila YL001,X.nematophila ALL,X.nematophila AN6,X.nematophila A24等菌株中的一株或多株。本发明中采用的嗜线虫致病杆菌参照论文:《嗜线虫致病杆菌YL001抑菌活性成分研究》,许鹏,2016,硕士学位论文。
本发明中柱层析分离所使用的柱填充物选自XAD-11大孔树脂、XAD-12大孔树脂、Porapak S大孔树脂、HPD-600大孔树脂、XAD-9大孔树脂、XAD-10大孔树脂、XAD-7HP大孔树脂、LSA-10大孔树脂、LX-28大孔树脂、AB-8大孔树脂、DA大孔树脂、X-5大孔树脂、D320大孔树脂、D101大孔树脂、CAD-40大孔树脂、GDX-105大孔树脂、D大孔树脂和DM2大孔树脂。
下面通过具体分离方法实例对发明作进一步详细的描述。
为了更好的理解本发明,现给出Nematophin的分离实例,本发明包括但不限于此分离方法。
实施例1:
种子液制备:取菌管保存的X.nematophila ALL菌种于LB培养基中,28℃恒温培养,转速180r/min,培养至对数期,用划线法在NBTA平板上在室温培养48h,挑取蓝色单菌落于LB培养基中(培养温度:28℃,转速:180r/min),培养至对数期,备用;
发酵培养:将种子液以10%(V/V)接种量接种于TSB培养基中,于温度28℃、摇床转速180r/min条件下培养3d,富集发酵液20L,将发酵液在9000r/min离心15min,取上清液于40℃、0.1Mpa条件下减压浓缩至4L。
将上述得到的浓缩液用蒸馏水(pH=7.0)复溶至6L,进行柱层析分离。采用大孔树脂(D101)作为固定相(上柱量2kg),发酵液以20mL/min的流速,缓慢注入层析柱(10×200cm)中,层析柱流速10mL/min,待浓缩发酵液全部吸附,关掉柱层析阀门,静态吸附12h。后依次用5倍柱体积蒸馏水(pH=7.0)、1倍柱体积的50%甲醇、1倍柱体积80%甲醇及3倍柱体积甲醇洗脱,收集甲醇洗脱液,于40℃、0.1Mpa条件下减压浓缩,用5-7倍浓缩液体积的蒸馏水(pH=7.0)复溶,按体积比1:1加入石油醚萃取三次,每次萃取时间为2h,萃取温度室温,得纯度≥90%的Nematophin。
检测结果:
HPLC检测图谱见图1和图2;
本实施例制备得到的Nematophin的核磁数据及物理性状为:浅黄色针状晶体,
实施例2:
对X.nematophila YL001进行发酵培养,富集发酵液20L,9000r/min离心15min,于40℃、0.1Mpa条件下减压浓缩。
将上述得到的浓缩液用1.5-2倍蒸馏水(pH=7.0)复溶,后进行柱层析分离。采用大孔树脂(X-5)作为固定相,依次用5倍柱体积蒸馏水(pH=7.0)、1倍柱体积的50%丙酮、1倍柱体积80%丙酮及3倍柱体积丙酮进行洗脱,收集丙酮洗脱液,于40℃下减压浓缩,用5-7倍浓缩液体积的蒸馏水(pH=7.0)复溶,按体积比1:1加入石油醚萃取三次,得纯度≥90%的Nematophin。
实施例3:
对X.nematophila AN6进行发酵培养,富集发酵液20L,9000r/min离心15min,40℃、0.1Mpa条件下减压浓缩。
将上述得到的浓缩液用1.5-2倍蒸馏水(pH=7.0)复溶。采用大孔树脂(XAD-11)作为固定相,依次用5倍柱体积水、1倍柱体积50%乙醇、1倍柱体积的80%乙醇及3倍柱体积乙醇进行洗脱,收集乙醇洗脱液,40℃、0.1Mpa下减压浓缩,用5-7倍浓缩液体积的蒸馏水(pH=7.0)复溶,按体积比1:1加入石油醚萃取三次,得纯度≥90%的Nematophin。
实施例4:
对X.nematophilaA24进行发酵培养,富集发酵液20L,9000r/min离心15min,40℃、0.1Mpa条件下减压浓缩。
将上述得到的浓缩液用1.5-2倍蒸馏水(pH=7.0)复溶,采用大孔树脂(XAD-11)作为固定相,依次用5倍柱体积水-0.01n盐酸、3倍柱体积30%丙酮-0.01n盐酸进行洗脱,收集30%丙酮-0.01n盐酸段,40℃、0.1Mpa下减压浓缩,用5-7倍浓缩液体积的蒸馏水(pH=7.0)复溶,按体积比1:1加入石油醚萃取三次,得纯度≥90%的Nematophin。
实施例5:
对X.nematophila YL001进行发酵培养,富集发酵液20L,9000r/min离心15min,40℃、0.1Mpa条件下减压浓缩。
将上述得到的浓缩液用1.5-2倍蒸馏水(pH=7.0)复溶,采用大孔树脂(AB-8大孔树脂)作为固定相,依次用5倍柱体积水-0.01n盐酸、3倍柱体积30%甲醇-0.01n盐酸洗脱,收集30%甲醇-0.01n盐酸段,40℃、0.1Mpa下减压浓缩,用5-7倍浓缩液体积的蒸馏水(pH=7.0)复溶,按体积比1:1加入石油醚萃取三次,得纯度≥90%的Nematophin。
实施例6:
对X.nematophilaYL001进行发酵培养,富集发酵液50L,9000r/min离心15min,40℃,0.1Mpa条件下减压浓缩。
参照许鹏(2016)方法,将上述得到的浓缩发酵液加入1.5-2倍蒸馏水(pH=7.0)复溶,用乙酸乙酯萃取四次,得乙酸乙酯提取物,将乙酸乙酯提取物进行硅胶柱层析(硅胶312g、200-300目;层析柱:100*5cm),分别用石油醚:乙酸乙酯体系(V
实施例7:
对X.nematophila YL001进行发酵培养,富集发酵液5L,12000*g,4℃下离心20min,得上清液。
参照Li et al(1997)对化合物Nematophin的分离方法,上述浓缩液用乙酸乙酯萃取四次,萃取物用无水硫酸钠去除水分后在30℃,0.1Mpa条件下减压浓缩。后将浓缩的馏分进行硅胶柱层析(200g硅胶,层析柱40*5cm),洗脱剂为三氯甲烷-甲醇体系(V
以上详细描述了本公开的优选实施方式,但是,本公开并不限于上述实施方式中的具体细节,在本公开的技术构思范围内,可以对本公开的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是,在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合,为了避免不必要的重复,本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外,本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合,只要其不违背本公开的思想,其同样应当视为本公开所公开的内容。
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