一种用于检测人甲状旁腺激素的胶体金试纸条

技术领域

本发明属生物医学检测技术领域，具体涉及一种用于检测人甲状旁腺激素的胶体金试纸条。

背景技术

人体有两对甲状旁腺，棕黄色，形似大豆，分别位于左右两叶甲状腺背面(或埋在其中)的中部和下部。主要功能为分泌甲状旁腺激素(简称PTH)，调节机体内钙、磷的代谢。与甲状旁腺相关的疾病主要是甲状腺手术术后并发甲状旁腺功能减退症以及原发或继发的甲状旁腺瘤。

甲状腺癌一种发于头颈部的常见恶性肿瘤，也是近年来发病率增长速度最快的恶性肿瘤之一，甲状腺癌已经成为女性第五大常见恶性肿瘤。甲状腺癌的治疗目前主要以外科手术治疗为主。由于甲状旁腺位置特殊，而且体积较小，与人体脂肪颜色相近，因此在甲状腺癌手术施术时，很容易被误切除。这也是甲状腺手术术后并发甲状旁腺功能减退症的主要原因。甲状腺术中误切甲状旁腺的几率极高，据文献报道，甲状腺术后暂时性和永久性甲状旁腺功能减退的发生率分别为19-60％和4-11％。

为了防止误切甲状旁腺，目前临床上在进行甲状腺手术时，切除病灶后，术者会仔细检视切除组织是否存在疑似的甲状旁腺，如果发现这类组织，会立即将组织的一部分送病理科做冰冻病理，若病理检查确认送检组织为甲状旁腺，术者会迅速对剩余部分做甲状旁腺自体移植，以尽量避免术后永久性甲状旁腺功能的丧失。然而冰冻病理检查耗时大于30分钟，术者须术中等待，客观造成了手术时间延宕，同时甲状旁腺较长时间的体外室温保存所导致的组织失活，因送检消耗而造成的回植甲状旁腺体量不足，均会大大影响甲状旁腺自体移植术的成功率。因此，缺乏一种快捷、准确、不消耗待移植甲状旁腺体量的甲状旁腺确认方法一直是甲状腺外科的痛点。

甲状旁腺瘤包括原发性甲状旁腺瘤和继发性甲状旁腺瘤。其结果均可导致循环血中过量PTH的蓄积，进一步又通过PTH的正反馈机制导致高钙血症的发生。这严重威胁罹患甲状旁腺疾病患者的健康。，通过手术切除病变的或完全切除所有甲状旁腺是治疗这一疾病的最终解决方案，而术中，因多种病生理因素，造成甲状旁腺的数目与位置难以确认，继而使术者难以判断是否对甲状旁腺做了完全切除。为了在术中及时准确评估手术切除效果，术者会在手术前和手术切除10分钟后分别采集静脉血离心成血清，进行全段PTH(iPTH)的血清检测。如果iPTH下降幅度超过一半及以上(iPTH在循环血中半衰期小于10分钟)，则证明手术成功。然而，静脉血的采集及血清的处理需要多科室、多人参与，操作麻烦而且耗时较长。

因此，临床非常期待一种可以直接在手术环境中使用、单人操作、直接检测指尖血同时检测时间小于15分钟的快捷检测方法以解决现有血清检测方法的局限。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供了一种用于检测人全段甲状旁腺激素(iPTH)的试纸条，包括底板，以及设置在所述底板上依次连接的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫，所述硝酸纤维膜上设置有检测线；

所述胶体金结合垫中含有结合抗体标记的胶体金颗粒；所述检测线中锚定了捕获抗体，所述结合抗体和所述捕获抗体均可特异性地识别和结合甲状旁腺激素，并且所述结合抗体和所述捕获抗体与甲状旁腺激素结合的位点互不干扰。

本发明使用双抗夹心策略制备用于检测人全段甲状旁腺激素(iPTH)的胶体金试纸条，可在短时间内快速检测目标样品中是否含有iPTH，帮助医生快速判断是否误切甲状旁腺。

在一个优选实施方案中，所述结合抗体为纳米抗体，包含三个CDR区，序列依次如SEQ ID NO:6-8所示。

优选地，所述结合抗体的可变区序列如SEQ ID NO:5所示。

在一个优选实施方案中，所述捕获抗体为纳米抗体，包含三个CDR区，序列依次如SEQ ID NO:2-4所示。

优选地，所述捕获抗体的可变区序列如SEQ ID NO:1所示。

使用AP3(序列如SEQ ID NO:1所示)捕获抗体，AP8(序列如SEQ ID NO:5所示)作为结合抗体，可高效特异地检测出样品中的iPTH。AP3和AP8均是纳米抗体，仅仅包含具有4个框架区和3个CDR的重链可变区(VHH)，其稳定性搞，亲和力好，并且易于表达，有利于降低抗体制作成本。

在一个优选实施方案中，所述硝酸纤维膜上还设置有质控线，所述质控线比所述检测线远离所述胶体金结合垫。

在一个优选实施方案中，所述质控线中锚定了鼠抗羊驼IgG。

在一个优选实施方案中，所述样品垫与所述胶体金结合垫交界处设置有滤血膜。该设置使得本发明的试纸条可用于检测全血样品，而非局限于血清或组织洗脱液。

本发明的胶体金试纸条，使用方便快速，能在10分钟内完成检测，大大缩短了检测时间，从而帮助医生在短时间内判断是否误切甲状旁腺，并在快速将误切的甲状旁腺放回患者体内，极大保证了甲状旁腺的活性，大幅降低甲状腺术后甲状旁腺功能减退这一并发症的发病率。

附图说明

图1为AP1-10与PTH的结合值统计图，结合值＝含PTH的0D450/空白OD450；

图2为AP3作为捕获抗体，AP1-10作为结合抗体进行双抗夹心ELISA检测的OD450统计图；

图3为AP8作为捕获抗体，AP1-10作为结合抗体进行双抗夹心ELISA检测的OD450统计图；

图4为本发明的试纸条的结构示意图；

图5为硝酸纤维膜的俯视图；

图6为样品垫、滤血膜、胶体金结合垫的示意图。

其中，1、底板、2、样品垫，3、胶体金结合垫，4、硝酸纤维膜，41、检测线，42、质控线，5、吸水垫；6、滤血膜。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1、抗体的筛选与制备

使用甲状旁腺激素全蛋白用于免疫羊驼，制备抗人iPTH抗体。用250μg抗原与250μL弗氏完全佐剂混合乳化，将混合物用于免疫羊驼，完成初免。在初免2周后和4周后，对羊驼各进行一次加强免疫，加强免疫时使用1250μg抗原和250μL弗氏不完全佐剂的混合物进行。二免和三免一周后，采血测定抗血清效价。

结果显示，抗原二免和三免引发的抗血清效价分别为3.28×10

取三免一周后的外周血，分离外周血单核细胞(PBMC)，提取RNA，反转录后使用通用引物扩增，并克隆至噬菌粒上，转化TG1菌株，建立噬菌体库用于筛选单克隆抗体。在经过多轮筛选后，我们得到10个具有高特异性和亲和力的单克隆抗体，AP1-10。如图1所示，这10个单克隆抗体在3×10

分析AP3和AP8的序列，结果显示，AP3的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，包括3个CDR区，CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2-4所示。AP8的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，包括3个CDR区，CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6-8所示。

使用PTH突变体库进行进一步研究发现，AP3的识别位点位于PTH氨基酸序列的头部10个氨基酸内，而其他抗体的识别位点位于PTH的其他部位。由于新分泌的甲状旁腺激素具有全长的氨基酸序列，而留存一段时间的PTH头部的几个氨基酸会被切掉。因此，AP3与AP8的组合能够特异地检测iPTH。这在对甲状旁腺癌的手术切除评价方面很有意义。在术前先进行一次全血或血清定量检测，在术后再进行一次全血或血清定量检测，如果iPTH的量大幅降低，说明新产生的iPTH的量大幅减少，也说明切除手术是成功的，反之亦然。

2、iPTH检测试纸条的制备

iPTH试纸条的结构如图4和5所示，包括长方形的底板1，以及设置在所述0底板1上依次搭接的样品垫2、胶体金结合垫3、硝酸纤维膜4和吸水垫5。在一个优选实施方案中，样品垫2与胶体金结合垫3之间的交界面增大，以提高样品扩散效率。优选地，样品垫2与胶体金结合垫3的交界处做成上部突出的形状，胶体金结合垫3与样品垫2的交界处做成下部突出的形状，并且这两个部分相互契合，以增大接触面，并且，由于交界处，样品垫2在上，胶体金结合垫3在下，在重力的作用下有利于样品从样品垫2扩散到胶体金结合垫3上。

样品垫2为经过磷酸缓冲液处理的玻璃纤维膜，所述磷酸缓冲液为含有1-5％BSA和表面活性剂的磷酸缓冲液。

胶体金结合垫3为涂覆了抗体AP8标记的胶体金颗粒的玻璃纤维膜。胶体金结合垫3中含有胶体金颗粒，胶体金颗粒上结合抗体AP8。滴加在样品垫2中的样品如果存在iPTH，iPTH扩散至胶体金结合垫3中后，可通过AP8耦合胶体金颗粒。带有胶体金颗粒的iPTH继续向硝酸纤维膜4扩散，并在硝酸纤维膜4上聚集显示。

胶体金颗粒标记AP8抗体的方法如下：

1)胶体金的配制：用双蒸水将1％的氯金酸溶液稀释成0.01％，煮沸，加入柠檬酸三钠溶液，继续煮沸，知道液体呈亮红色，停止加热，补足因煮沸而损失的水分，即得到胶体金；

2)在胶体金加入AP8抗体，混匀后静置，离心取沉淀，洗涤两遍后，得到标记了AP8的胶体金颗粒。将标记了AP8的胶体金颗粒喷涂在玻璃纤维膜上，制备成胶体金结合垫3。

在具体的实施方案中，我们优化了胶体金的pH值，当胶体金pH值为7.8-8.2时，标记效率最高，这与本领域常用的7.0-7.5的pH不同。有可能与抗体AP8的性质有关。

在一个优选实施方案中，如图6所示，样品垫2与胶体金结合垫3交界面上设置有滤血膜6。该设置使得本发明的试纸条可用于检测全血样品，而非局限于血清或组织洗脱液。

硝酸纤维膜4上设置有检测线41。检测线41上锚定了包被抗体AP3，带有胶体金颗粒的iPTH在硝酸纤维膜4上扩散时，遇到检测线41时，与检测线41中锚定的包被抗体AP3结合，聚集于检测线41上，带有胶体金颗粒的PTH在检测线上聚集越多，则显色越深。

硝酸纤维膜4上还设置有质控线42，质控线42比检测线41远离胶体金结合垫3。质控线42上锚定了鼠抗羊驼IgG。当胶体金颗粒扩散至质控线42处时，聚集于质控线42上。因此，胶体金颗粒在扩散过程中，先遇到检测线41，结合了PTH的胶体金颗粒聚集于检测线41上，没有集合PTH的胶体金颗粒继续向前扩散，在遇到质控线42时，聚集于质控线42上。由于胶体金颗粒丰度远大于iPTH，因此无论样品中是否存在iPTH，质控线42都将显色。

硝酸纤维膜4的制备方法如下：

1)将硝酸纤维膜在封闭液中封闭60min，封闭液为含有1％BSA和0.1％吐温-20的0.01M的磷酸缓冲液(pH 7.0)；

2)将捕获抗体AP3和鼠抗羊驼IgG分别加入到点膜稀释液中，得到AP3点膜液和鼠抗羊驼IgG抗体点膜液，将AP3点膜液和鼠抗羊驼IgG点膜液分别按2μL/cm的量喷涂在相隔5mm的检测线和质控线上。其中，点膜稀释液为含有0.15M氯化钠、10mM乙二胺四乙酸、1g/L叠氮钠和25g/L甲醇的0.01M的磷酸缓冲液(pH 7.4)。AP3点膜液的浓度为2.5μg/mL，鼠抗羊驼IgG点膜液的浓度为1.5μg/L。

3、iPTH检测方法

定性检测时，将50μL外周血、血清或组织洗脱液样品加入到50μL样品预处理溶液中，搅拌混匀后，取50μL滴加在检测试纸条的样品垫的加样区，于20-30℃下进行层析5min。通过观察检测线和质控线即可确定样品中是否含有iPTH。即，当检测线和质控线都显色时，样品中含有iPTH；当检测线不显色，质控线显色时，样品中不含iPTH。

在一个具体实施方案中，样品预处理液为含有0.3-0.5％氯化铵、0.1％碳酸氢钾的0.1M的磷酸缓冲液。使用该样品预处理液，可裂解全血样品中的红细胞，有利于全血样品的检测。

定量检测时，需要准备色值读数系统。将层析反应后的试纸条放置在色值读数系统的扫描装置下进行扫描，扫描后的图像经过色值读数系统进行处理和判定，可得出iPTH的浓度。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 德林医疗科技(武汉)有限公司

<120> 一种用于检测人甲状旁腺激素的胶体金试纸条

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 137

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Glu Val Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Tyr Ser Gly Ile Gly Asp Met His Lys

20 25 30

Phe Ser Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Val Leu Gly Lys Ala Arg Glu

35 40 45

Phe Val Ala Ser Ile Gly Asn Asp Thr Leu Glu Ala Ser Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Leu

65 70 75 80

Met Tyr Leu Arg Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Phe Cys Ala Gly Asn Tyr Phe Leu Arg Ser Ile Arg Asp Trp Asn Ser

100 105 110

Asp Asn Ser Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro

130 135

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Ile Gly Asp Met His Lys Phe Ser Ser

1 5 10

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ile Gly Asn Asp Thr Leu Glu Ala

1 5

<210> 4

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ala Gly Asn Tyr Phe Leu Arg Ser Ile Arg Asp Trp Asn Ser Asp Asn

1 5 10 15

Ser Gly Ser

<210> 5

<211> 143

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Val Ser Ile Ser Phe Ile Asp

20 25 30

Thr Ser Thr Asn Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp

35 40 45

Arg Glu Phe Val Ile Ser Thr Arg Gly Gly Arg Ser Thr Gly Tyr Thr

50 55 60

Glu Tyr Glu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Lys Asn Thr Val Thr Leu Glu Met Asn Gly Leu Lys Pro Glu Asp

85 90 95

Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Met Arg Pro Phe Ser Val Ser Val Ala

100 105 110

Ile Gly Ala Phe Glu Gly Ile Ser Asp Tyr Asp Trp Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro

130 135 140

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Val Ser Ile Ser Phe Ile Asp Thr Ser Thr Asn Ala

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<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Thr Arg Gly Gly Arg Ser Thr Gly Tyr Thr

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<210> 8

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Ala Met Arg Pro Phe Ser Val Ser Val Ala Ile Gly Ala Phe Glu Gly

1 5 10 15

Ile Ser Asp Tyr Asp

20