一种同时测定菊苣中绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸含量的方法

技术领域

本发明涉及中药活性成分含量测定技术领域，尤其涉及一种同时测定菊苣中绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸含量的方法。

背景技术

菊苣(Cichorium intybus L.)为菊科多年生草本植物。《中国药典》(2020版)中，菊苣作为维吾尔族习用药材，主要利用其干燥地上部分或根，具有清肝利胆，健胃消食，利尿消肿的功效，用于湿热黄疸，胃痛食少，水肿尿少。栽培菊苣有多种用途，叶子可以用作蔬菜和饲料，根可以用来生产菊粉和咖啡替代品。菊苣含有多种酚酸类化合物，如绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸等，具有清除自由基、抗脂质过氧化、保肝利胆、抗菌、抗病毒、增强免疫功能和抗炎作用。目前对菊苣还没有建立其质量控制方法。开发同时测定菊苣中绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸含量的方法，为菊苣药用价值的评价和质量控制提供参考依据。

文献《毛菊苣不同部位中菊苣酸、绿原酸、单咖啡酰酒石酸的含量测定》中，对毛菊苣不同部位(根、茎、种子)中菊苣酸、绿原酸和单咖啡酰酒石酸3种成分进行了含量测定报道。文献《高效液相色谱法同时测定苣荬菜叶中绿原酸、木犀草苷和菊苣酸的含量》中，建立高效液相色谱(HPLC)法同时测定苣荬菜叶中绿原酸、木犀草苷和菊苣酸的含量的分析方法。文献《HPLC法同时测定蒲公英中单咖啡酰酒石酸、绿原酸、咖啡酸、菊苣酸的含量》中，建立HPLC法同时测定蒲公英中4种有机酸类成分含量。文献《HPLC法测定蒲公英中菊苣酸、咖啡酸与绿原酸》中，建立同时测定蒲公英中菊苣酸、咖啡酸和绿原酸的HPLC方法。文献《HPLC同时测定苦碟子注射液中单咖啡酰基酒石酸、咖啡酸、绿原酸、阿魏酸、菊苣酸的含量》中，建立同时测定苦碟子注射液中5种有机酸类成分含量的HPLC分析方法。以上测定方法均为多种成分同时测定，检测时间较长(分别为50、50、34、55和40min)，洗脱方式为梯度洗脱，要求测定仪器必须带梯度洗脱装置，仪器成本提高，测定范围受到设备的限制。为提高检测效率，降低检测成本，本着检测指标增加，效率不减、成本不增加的原则，拟将菊苣中绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸采用等度洗脱方式，同时测定。

发明内容

本发明的目的是通过提供一种同时测定菊苣中绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸含量的方法，以实现同时对菊苣有效成分-绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸进行定量分析的目的，同时将测定分析时间缩减至20min左右，实现了定量指标翻倍，节省检测费用的有益效果。

为实现上述目的，本发明提供了一种同时测定菊苣中绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸含量的方法，该方法采用等度洗脱的方法，包括以下步骤：

步骤一：对照品溶液的制备

分别取绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸对照品，加入溶剂，制成绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸对照品溶液，作为储备液，其他不同质量浓度的对照品溶液由储备液稀释得到；

步骤二：供试品溶液的制备

取菊苣粉末，加入溶剂，真空超声处理后过滤，取续滤液，过微孔滤膜，即得供试品溶液；

步骤三：定量分析

取对照品溶液和供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪，进行测定分析。

优选的，步骤一中所述的溶剂为甲醇-0.5％磷酸溶液，其中甲醇与0.5％磷酸体积比为4:1-3:1；所制成绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸对照品溶液浓度为0.125-0.25mg/mL。

优选的，步骤二中所述的菊苣粉末提前过40-60目筛后取5-10g。

优选的，步骤二中所述超声处理前加入溶剂为甲醇-0.5％磷酸溶液，其中甲醇与0.5％磷酸体积比为4:1-3:1；加入用量为250-500mL。

优选的，步骤二中所述真空超声处理在真空超声波反应釜内进行，真空度为50-100Pa，超声功率为200-400W，反应釜温度15℃-20℃，超声频率10-20KHz，处理时间为60-75min。

优选的，超声处理后所述微孔滤膜孔径为0.22μm。

优选的，步骤三中所述的对照品溶液和供试品溶液用量均为10-20μL。

优选的，步骤三中所述的高效液相色谱仪测定条件包括：色谱柱为AmethystC18-H型色谱柱，其规格为250mm×4.6mm，5μm，柱温为25-30℃，紫外检测波长为327±1nm。

优选的，步骤三中所述的高效液相色谱仪测定条件还包括：流动相为体积比20:80的乙腈和0.1％磷酸的混合溶液，流速为1.0mL/min。

优选的，步骤三中所述的高效液相色谱仪测定分析时间为20±1min；理论塔板数按绿原酸峰计算不低于3000。

本发明的有益效果：

(1)本发明公开了一种同时测定菊苣中绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸含量的方法，采用HPLC法，以常用的流动相体系，体积比为20:80的乙腈和0.1％磷酸的混合溶液为流动相，以等度洗脱的方式，在326-328nm区间段，可以同时测定了菊苣中的绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸含量，波峰分离良好，峰面积大小适宜，进样一针，20min左右出峰完毕；方法简便、快捷、准确、成本低、实用范围广，易于普及掌握。

(2)本发明与已报道的梯度洗脱方法相比，不要求测定仪器配有梯度洗脱装置，仪器成本降低、实施普及范围扩大。运行时间依次比背景技术中的报道文献分别约缩短了30、30、14、35和20min，四种成分同时测定，仅需20min，是目前运行时间较短的方法。

(3)本发明克服现有技术中植物酚酸物质在制备过程中极易被氧化，或存在因物料细胞壁破碎不充分而不能充分释放酚酸物质，导致提取率差从而不能真实反应物料酚酸含量的问题。为避免上述问题，本发明采用低温真空超声提取，使菊苣中酚酸物质充分溶出，并防止酚酸被氧化。

附图说明

图1为本发明所提供的实施例3中的绿原酸对照品HPLC色谱图；

图2为本发明所提供的实施例3中的咖啡酸对照品HPLC色谱图；

图3为本发明所提供的实施例3中的阿魏酸对照品HPLC色谱图；

图4为本发明所提供的实施例3中的菊苣酸对照品HPLC色谱图；

图5为本发明所提供的实施例3中的菊苣HPLC色谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种同时测定菊苣中绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸含量的方法，该方法采用等度洗脱的方法，包括以下步骤：

步骤一：对照品溶液的制备

分别取绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸对照品，精密称定，置棕色容量瓶中，优选加入甲醇-0.5％磷酸(4:1-3:1，V/V)溶液，制成0.125-0.25mg/mL绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸对照品溶液，作为储备液，其他不同质量浓度的对照品溶液由储备液稀释得到；

步骤二：供试品溶液的制备

菊苣粉末提前过40-60目筛后精密称取菊苣粉末5-10g，置具塞锥形瓶中，优选加入甲醇-0.5％磷酸(4:1-3:1，V/V)溶液250-500mL，真空超声处理，所述真空超声处理在真空超声波反应釜内进行，真空度优选为50-100Pa，超声功率优选为200-400W，反应釜温度优选为15℃-20℃，超声频率优选为10-20KHz，处理时间优选为60-75min，处理后过滤，取续滤液，过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液；

步骤三：定量分析

精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10-20μL，分别注入高效液相色谱仪，进行测定，所述液相色谱条件如下：色谱柱为AmethystC18-H型色谱柱，其规格优选为250mm×4.6mm，5μm；柱温优选为25-30℃；紫外检测波优选长为327±1nm；流动相优选为体积比20:80的乙腈和0.1％磷酸的混合溶液；流速优选为1.0mL/min；分析时间优选为20±1min；理论塔板数按绿原酸峰计算不低于3000。

实施例1

步骤一：对照品溶液的制备

分别取绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸对照品，精密称定，置棕色容量瓶中，加入甲醇-0.5％磷酸(3:1，V/V)溶液，制成0.125mg/mL绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸对照品溶液，作为储备液，其他不同质量浓度的对照品溶液由储备液稀释得到；

步骤二：供试品溶液的制备

菊苣粉末提前过40目筛后精密称取菊苣粉末5g，加入甲醇-0.5％磷酸(3:1，V/V)溶液250mL，真空超声处理，所述超声处理功率为200W，真空度为50Pa，反应釜温度为20℃，超声频率为10KHz，处理时间为75min，处理后过滤，取续滤液，过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液；

步骤三：定量分析

精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪，进行测定，所述液相色谱条件如下：色谱柱为AmethystC18-H型色谱柱，其规格为250mm×4.6mm，5μm；柱温为25℃；紫外检测波长为326nm；流动相为体积比20:80的乙腈和0.1％磷酸的混合溶液；流速为1.0mL/min；分析时间为21min；理论塔板数为3000。

实施例2

步骤一：对照品溶液的制备

分别取绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸对照品，精密称定，置棕色容量瓶中，加入甲醇-0.5％磷酸(4:1，V/V)溶液，制成0.15mg/mL绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸对照品溶液，作为储备液，其他不同质量浓度的对照品溶液由储备液稀释得到；

步骤二：供试品溶液的制备

菊苣粉末提前过50目筛后精密称取菊苣粉末7.5g，加入甲醇-0.5％磷酸(4:1，V/V)溶液400mL，真空超声处理，所述超声处理功率为300W，真空度为80Pa，反应釜温度为18℃，超声频率为15KHz，时间为70min，处理后过滤，取续滤液，过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液；

步骤三：定量分析

精密吸取对照品溶液和供试品溶液各15μL，分别注入高效液相色谱仪，进行测定，所述液相色谱条件如下：色谱柱为AmethystC18-H型色谱柱，其规格为250mm×4.6mm，5μm；柱温为30℃；紫外检测波长为328nm；流动相为体积比20:80的乙腈和0.1％磷酸的混合溶液；流速为1.0mL/min；分析时间为19min；理论塔板数为3000。

实施例3

步骤一：对照品溶液的制备

分别取绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸对照品，精密称定，置棕色容量瓶中，加入甲醇-0.5％磷酸(4:1，V/V)溶液，制成0.25mg/mL绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸对照品溶液，作为储备液，其他不同质量浓度的对照品溶液由储备液稀释得到；

步骤二：供试品溶液的制备

菊苣粉末提前过60目筛后精密称取菊苣粉末10g，加入甲醇-0.5％磷酸(4:1，V/V)溶液500mL，真空超声处理，所述超声处理功率为400W，真空度为100Pa，反应釜温度为15℃，超声频率为20KHz，时间为60min，处理后过滤，取续滤液，过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液；

步骤三：定量分析

精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μL，分别注入高效液相色谱仪，进行测定，所述液相色谱条件如下：色谱柱为AmethystC18-H型色谱柱，其规格为250mm×4.6mm，5μm；柱温为25℃；紫外检测波长为327nm；流动相为体积比20:80的乙腈和0.1％磷酸的混合溶液；流速为1.0mL/min；分析时间为20min；理论塔板数为3000。

一、样品测定

取菊苣粉末6份，分别按照上述实施例3中的方法同时测定菊苣中绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸的含量，并采用外标法计算，结果见表1，由表1可知，计算出绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸含量相对标准偏差(RSD)分别为1.20％、1.62％、1.89％、1.17％，此结果表明利用本发明所述同时测定菊苣中绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸含量的方法，所测菊苣中绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸的含量精确，数据可靠。

图1为绿原酸对照品HPLC色谱图，图2为咖啡酸对照品HPLC色谱图，图3为阿魏酸对照品HPLC色谱图，图4为菊苣酸对照品HPLC色谱图，图5为样品HPLC色谱图，由图5可以看出，菊苣中绿原酸1、咖啡酸2、阿魏酸3和菊苣酸4的波峰清晰，且分离效果好，便于快速准确地测量。

表1菊苣中绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸的含量测定结果

二、线性关系考察

精密吸取按实施例3中方法制备的绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸对照品储备液，用甲醇-0.5％磷酸(4:1，V/V)溶液逐级稀释成不同质量浓度的对照品溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤，分别进样20μL。以对照品浓度X(μg/mL)为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，得到绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸线性回归方程及线性范围，结果如表2所示，由表2可知，绿原酸在6.75～250μg/mL、咖啡酸在6.75～250μg/mL、阿魏酸在3.38～100μg/mL、菊苣酸在1.69～250μg/mL范围内，浓度和峰面积呈良好的线性关系。

表2线性关系考察

三、仪器精密度试验

精密吸取按实施例3中方法制备的绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸对照品混合液(0.025mg/mL)，在上述色谱条件下连续进样6次，记录峰面积。结果见表3，由表3可知，计算出绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸峰面积RSD分别为0.53％、0.08％、1.46％、1.40％，此结果表明仪器精密度良好。

表3仪器精密度试验

四、稳定性试验

取同一批菊苣按实施例3中方法制成供试品溶液，室温下放置，分别于0，2，4，6，8，24h进样20μL，按上述色谱条件进行测定，记录峰面积，结果如表4所示，由表4可知绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸峰面积的RSD值分别为0.76％，1.67％、1.39％、1.53％，此结果表明供试品溶液在24h内稳定。

表4稳定性试验

五、重复性试验

精密称定同一批菊苣粉末0.5g，共6份，按实施例3中方法制成供试品溶液，在上述色谱条件下进行测定，结果见表5，由表5可知，测得绿原酸的平均含量为8.66mg/g，RSD为1.94％；咖啡酸的平均含量为3.58mg/g，RSD为0.88％；阿魏酸的平均含量为1.10mg/g，RSD为1.90％；菊苣酸的平均含量为0.139mg/g，RSD为0.97％，表明本方法重复性良好。

表5重复性试验

六、加样回收率试验

取同一批菊苣粉末3份，每份约0.5g，精密称定，按实施例3中样品测定方法测得每份含绿原酸4.32mg、咖啡酸1.80mg、阿魏酸0.56mg、菊苣酸0.07mg。取上述同一批菊苣粉末3份，每份约0.5g，精密称定，按低(80％)，中(100％)，高(120％)浓度分别精密加入一定量的绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸对照品粉末，按照实施例3中供试品溶液的制备方法制备，并在上述色谱条件进行测定，计算回收率。结果如表6所示，结果显示，回收率全达到97％以上。结果证实所建立的方法对于同时测定菊苣中绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和菊苣酸的含量具有较高的准确度。

表6加样回收率试验